XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MAJONOSIDE R2 TRONG CHẾ PHẨM CHỨA SÂM NGỌC LINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN CHÍNH KHOA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MAJONOSIDE R2 TRONG CHẾ PHẨM CHỨA SÂM NGỌC LINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN CHÍNH KHOA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MAJONOSIDE R2 TRONG CHẾ PHẨM CHỨA SÂM NGỌC LINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài Luận văn thạc sĩ cách hoàn chỉnh, hướng dẫn nhiệt tình q thầy cơ, động viên ủng hộ gia đình, bạn bè đồng nghiệp suốt thời gian học tập nghiên cứu nguồn đồng lực lớn lao quý báu Đầu tiên, xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn Tơi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến tồn thể q thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đặc biệt q thầy Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất, tận tình truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin gởi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo anh chị cán Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia – Trường Đại học Dược Hà Nội Trung tâm giám định ma túy – Viện Khoa học hình – Bộ Cơng an không ngừng hỗ trợ thiết bị tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian nghiên cứu thực luận văn Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn anh chị đồng nghiệp động viên, hỗ trợ cho tơi nhiều suốt q trình học tập thực đề tài Mặc dù có nhiều cố gắng suốt trình thực đề tài, song có mặt hạn chế, thiếu sót Tơi mong nhận ý kiến đóng góp dẫn thầy giáo anh chị đồng nghiệp Hà Nội, ngày 01 tháng 04 năm 2019 Nguyễn Chính Khoa MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan sâm Ngọc Linh 1.1.1 Đặc điểm sâm Ngọc Linh 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.2.1 Thành phần hóa học phần mặt đất 1.1.2.2 Thành phần hóa học phần mặt đất 1.1.3 Tác dụng sâm Ngọc Linh 1.2 Tổng quan Majonoside R2 1.2.1 Công thức cấu tạo tính chất 1.2.2 Tác dụng Majonoside R2 1.2.3 Phương pháp định tính định lượng Majonoside R2 1.2.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 1.2.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 10 1.2.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 11 1.2.4 Một số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh lưu hành thị trường 12 1.3 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 13 1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng 13 1.3.2 Detector khối phổ cho sắc ký lỏng 13 1.3.2.1 Nguyên tắc 13 1.3.2.2 Các nguồn ion hóa sắc ký lỏng khối phổ 14 1.3.2.3 Bộ phận phân tích khối lượng 14 1.3.3 Ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ phân tích 15 1.3.3.1 Ứng dụng định tính 15 1.3.3.2 Ứng dụng định lượng 15 CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng phương tiện nghiên cứu 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Phương tiện thiết bị nghiên cứu 17 2.1.3 Hóa chất dung mơi 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Thu thập mẫu 18 2.2.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký 18 2.2.3 Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu 18 2.2.4 Thẩm định phương pháp 19 2.2.5 Áp dụng số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh 19 2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 19 CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21 3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 21 3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 21 3.1.2 Khảo sát điều kiện khối phổ 21 3.1.3 Khảo sát cột sắc ký 23 3.1.4 Khảo sát thành phần tỷ lệ pha động 26 3.1.5 Khảo sát thể tích tiêm 30 3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 31 3.2.1 Khảo sát dung môi chiết 32 3.2.2 Khảo sát thời gian chiết 33 3.2.3 Khảo sát số lần chiết 34 3.3 Quy trình phân tích 35 3.3.1 Điều kiện sắc ký 35 3.3.2 Chuẩn bị mẫu chuẩn mẫu thử 36 3.3.3 Định tính Majonoside R2 37 3.3.4 Định lượng Majonoside R2 37 3.4 Thẩm định phương pháp 38 3.4.1 Độ phù hợp hệ thống 38 3.4.2 Độ đặc hiệu 38 3.4.3 Độ tuyến tính 41 3.4.4 Độ chụm 42 3.4.5 Độ 44 3.4.6 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 47 3.5 Áp dụng phương pháp số mẫu chứa sâm Ngọc Linh 48 3.5.1 Định tính 49 3.5.2 Định lượng 51 CHƯƠNG 4.BÀN LUẬN 52 4.1 Lựa chọn phương pháp phân tích 52 4.2 Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu 53 4.3 Thẩm định phương pháp 54 4.4 Áp dụng phương pháp vào mẫu thực tế 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu chữ viết tắt AOAC APCI APPI ESI HPLC IUPAC LC-MS Diễn giải tiếng Anh Việt Association of Official Hiệp hội nhà hố Agricultural Chemists phân tích thống Atmospheric pressure chemical Ion hóa hóa học áp suất ionization khí Atmospheric pressure Ion hóa quang học áp photoionization suất khí Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu chromatography cao International Union of Pure and Applied Chemistry Liquid chromatography–mass spectrometry Liquid chromatography–mass LC-MS/MS Dịch nghĩa tiếng spectrometry/ mass spectrometry Liên minh Quốc tế Hóa học túy Hóa học ứng dụng Sắc ký lỏng khối phổ Sắc ký lỏng khối phổ hai lần Rf Retention factor Hệ số lưu giữ RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối TNF-α tumor necrosis factor α Yếu tố hoại tử khối u α TOF Time of flight Thời gian bay UV-VIS Ultraviolet–visible Tử ngoại- khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh 12 Bảng 2.1 Chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh dạng rắn 16 Bảng 2.2 Chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh dạng dầu 16 Bảng 2.3 Danh mục dung mơi hóa chất 17 Bảng 3.1 Các thông số tối ưu buồng ion hóa 22 Bảng 3.2 Điều kiện phân mảnh Majonoside R2 23 Bảng 3.3 Kết khảo sát dung môi chiết (n =3) 32 Bảng 3.4 Kết khảo sát thời gian chiết (n=3) 33 Bảng 3.5 Kết khảo sát số lần chiết 35 Bảng 3.6 Chương trình dung mơi 36 Bảng 3.7 Điều kiện khối phổ 36 Bảng 3.8 Kết khảo sát độ phù hợp hệ thống 38 Bảng 3.9 Kết khảo sát độ tuyến tính 41 Bảng 3.10 Kết khảo sát độ chụm mẫu dạng rắn 43 Bảng 3.11 Kết khảo sát độ chụm mẫu dạng dầu 44 Bảng 3.12 Kết khảo sát độ thu hồi mẫu dạng rắn 45 Bảng 3.13 Kết khảo sát độ thu hồi mẫu dạng dầu 46 Bảng 3.14 Kết khảo sát giới hạn phát 47 Bảng 3.15 Kết định lượng Majonoside R2 số mẫu 51 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Sâm Ngọc Linh Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo Majonoside R2 Hình 1.3 Nguyên lý hoạt động sắc ký lỏng khối phổ 13 Hình 1.4 Phạm vi áp dụng chế ion hóa 14 Hình 3.1 Phổ khối lượng Majonoside R2 chế độ ion hóa dương 21 Hình 3.2 Phổ khối lượng Majonoside R2 chế độ ion hóa âm 22 Hình 3.3 Kết khảo sát ion lượng phân mảnh 23 Hình 3.4 Kết khảo sát cột Inertsustain NH2 25 Hình 3.5 Kết khảo sát cột Inertsustain AQ C18 26 Hình 3.6 Kết khảo sát pha động methanol : nước chứa 0,1% acid formic 27 Hình 3.7 Kết khảo sát pha động acetonitril : nước chứa 0,1% acid formic 28 Hình 3.8 Kết khảo sát tỷ lệ pha động 30 Hình 3.9 Kết khảo sát thể tích tiêm mẫu 31 Hình 3.10 Kết khảo sát dung mơi chiết 33 Hình 3.11 Kết khảo sát thời gian chiết 34 Hình 3.12 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu 40 Hình 3.13 Kết định tính mẫu R1 40 Hình 3.14 Kết định tính mẫu N1 41 Hình 3.15 Đường chuẩn Majonoside R2 42 Hình 3.16 Kết xác định LOD phương pháp (nồng độ 0,2ng/ml) 48 Hình 3.17 Sắc ký đồ mẫu R2 N5 49 Hình 3.18 Kết định tính mẫu R2 N5 50 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nước có nguồn tài nguyên thực vật đa dạng, với nguồn dược liệu làm thuốc phong phú Từ hàng ngàn năm trước, loại dược liệu sử dụng để phòng, chữa bệnh có vai trò quan trọng việc bảo vệ sức khỏe người Sử dụng loại dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên (đông dược) xu hướng phát triển chủ yếu khơng Việt Nam mà nhiều nước châu Á Các thành phần tự nhiên dược liệu thân thiện với sức khỏe người, độc hại gây tác dụng khơng mong muốn so với thuốc tân dược Sâm Ngọc Linh có tên khoa học Panax Vietnamensis, loài thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Được tìm thấy lần vào năm 1973 núi Ngọc Linh, huyện Đắc Tô, tỉnh Kon Tum [4] Sâm Ngọc Linh loại sâm đặc biệt quý hiếm, có Việt Nam Trước đây, người dân sử dụng sâm Ngọc Linh theo thuốc cổ truyền để chữa nhiều bệnh Sau tìm thấy xác nhận danh tính, sâm Ngọc Linh nghiên cữu kỹ hơn, nhà khoa học phát 52 loại saponin củ sâm, có chất chưa phát loại sâm khác [18], [19], [20] Các nghiên cứu tác dụng sâm Ngọc Linh tiến hành cho thấy nhiều kết khả quan Chính vậy, thị trường có nhiều sản phẩm từ sâm Ngọc Linh sâm tươi, cao sâm chế phẩm khác Majonoside R2 saponin chiếm tỷ lệ cao sâm Ngọc Linh [1], [5], hoạt chất đặc trưng có sâm Ngọc Linh mà khơng có loại sâm phát trước Do đó, việc định tính định lượng Majonoside R2 có ý nghĩa quan trọng việc kiểm soát chất lượng sâm Ngọc Linh chế phẩm liên quan Trong Dược điển Việt Nam V có chuyên luận định lượng Majonoside R2 dược liệu sâm Ngọc Linh theo phương pháp HPLC [3] Ngồi ra, có nhiều nghiên cứu định lượng Majonoside R2 sâm Ngọc Linh [1], [5], [28] Tuy nhiên, chế Dung dịch chuẩn C6 2.3 Mẫu thực Sắc ký đồ mẫu R2 Sắc ký đồ mẫu R3 Sắc ký đồ mẫu R4 Sắc ký đồ mẫu R5 Sắc ký đồ mẫu R6 Sắc ký đồ mẫu R7 Sắc ký đồ mẫu N2 Sắc ký đồ mẫu N3 Sắc ký đồ mẫu N4 Sắc ký đồ mẫu N5 Kết định tính Majonoside R2 mẫu R2 Kết định tính Majonoside R2 mẫu R3 Kết định tính Majonoside R2 mẫu R4 Kết định tính Majonoside R2 mẫu R5 Kết định tính Majonoside R2 mẫu R6 Kết định tính Majonoside R2 mẫu R7 Kết định tính Majonoside R2 mẫu N2 Kết định tính Majonoside R2 mẫu N3 Kết định tính Majonoside R2 mẫu N4 Kết định tính Majonoside R2 mẫu N5 Hình ảnh số mẫu nghiên cứu Mẫu R1 Mẫu R3 Mẫu R5 Mẫu R7 Mẫu N1 Mẫu N2 Mẫu N3 Mẫu N4 Mẫu N5 ... CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan sâm Ngọc Linh 1.1.1 Đặc điểm sâm Ngọc Linh  Tên khoa học Sâm Ngọc Linh có tên khoa học Panax Vietnamensis Ha & Grushv.1985 thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), Hoa... VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài Luận văn thạc sĩ... Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia – Trường Đại học Dược Hà Nội Trung tâm giám định ma túy – Viện Khoa học hình – Bộ Cơng an không ngừng hỗ trợ thiết bị tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian nghiên