NGUYỄN THỊ LAN ANH xây DỰNG PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH dư LƯỢNG một số MA túy TRONG bùn THẢI BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký LỎNG KHỐI PHỔ HAI lần (LC MSMS) LUẬN văn THẠC sĩ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN ANH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CỦA MỘT SỐ MA TÚY TRONG BÙN THẢI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN (LC-MS/MS) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh Ths.NCS Trần Thị Thanh Huế HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian nghiên cứu hồn thành luận văn này, tơi nhận giúp đỡ tận tình thầy giáo, chuyên gia nhiều lĩnh vực, anh chị kỹ thuật viên, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cám ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, NCS.Ths Trần Thị Thanh Huế người tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Cảm ơn Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 105.99-2020.22 hỗ trợ kinh phí thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh chị Trung tâm Đánh Giá Tương Đương Sinh học - Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian làm thực nghiệm trung tâm Tôi xin gửi lời cảm ơn thầy Ban Giám hiệu, phịng Sau Đại học tồn thể thầy mơn trường Đại học Dược Hà Nội tận tình dạy dỗ giúp đỡ suốt thời gian học tập Trường Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè động viên, quan tâm tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 25 tháng 03 năm 2022 Nguyễn Thị Lan Anh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan ma túy 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại ma túy 1.1.3 Một số ma túy nghiên cứu 1.1.4 Tình hình sử dụng ma túy Việt Nam 10 1.1.5 Một số nghiên cứu xác định dư lượng ma túy môi trường 11 1.2 Tổng quan phương pháp phân tích sử dụng nghiên cứu 19 1.2.1 Sắc ký lỏng hiệu cao sắc ký lỏng khối phổi 19 1.2.2 Tổng quan chiết pha rắn (SPE) 21 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị đối tượng nghiên cứu 22 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.2 Hoá chất - chất chuẩn 22 2.1.3 Máy móc - trang thiết bị 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng dư lượng số ma túy bùn thải LC-MS/MS 24 2.2.2 Ứng dụng phương pháp để đánh giá dư lượng ma túy số mẫu bùn thải thu thập 30 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 31 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 32 3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ 32 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 33 3.1.3 Xây dựng phương pháp xử lý mẫu 37 3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng mẫu 40 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 42 3.2.1 Độ thích hợp hệ thống 42 3.2.2 Độ chọn lọc/đặc hiệu 43 3.2.3 Độ tuyến tính/khoảng nồng độ định lượng 45 3.2.4 Độ - Độ xác 47 3.2.5 Giới hạn định lượng (LOQ) giới hạn phát (LOD) 48 3.3 Ứng dụng phương pháp để đánh giá dư lượng ma túy số mẫu bùn thải thu thập 50 Chương BÀN LUẬN 54 4.1 Về kỹ thuật xử lý mẫu 54 4.2 Về phương pháp phân tích 55 4.3 Về thẩm định phương pháp 56 4.4 Về ứng dụng phương pháp 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 Kết luận 58 Kiến nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt AOAC AMP EDDP FA ACN HPLC Koc Tên tiếng Anh Association of Official Analytical Chemists Amphetamine 2-ethylidene-1,5-dimethyl-3,3diphenylpyrrolidine Acid formic Acetonitril High Performance Liquid Chromatography Organic carbon partition Tên tiếng Việt Hiệp hội nhà hóa học phân tích Amphetamin 2-ethylidene-1,5-dimethyl-3,3diphenylpyrrolidine Acid formic Acetonitril Sắc ký lỏng hiệu cao Hệ số riêng phần carbon hữu coefficien IUPAC LC-MS/MS P.A MDMA MAMP KET LSD MDA THCA THC-COOH THC UNODC WBE International Union of Pure and Applied Chemistry Liquid chromatogram tandem mass spectrometry Pro analysis 3,4-Methylenedioxy methamphetamine Methamphetamine Ketamine Lysergic acid diethylamide 3,4methylenedioxyamphetamine Tetrahydrocannabinolic acid 11-nor-9-carboxy-∆ 9tetrahydrocannabinol Tetrahydrocannabinol United Nations Office on Drugs and Crime Wastewater-Based Epidemiology Liên minh Quốc tế Hóa học Hóa học ứng dụng Sắc ký lỏng khối phổ hai lần Tinh khiết phân tích 3,4-Methylenedioxy methamphetamin Methamphetamin Ketamin Lysergic acid diethylamid 3,4methylenedioxyamphetamine Tetrahydrocannabinolic acid 11-nor-9-carboxy-∆ 9tetrahydrocannabinol Tetrahydrocannabinol Cơ quan phòng chống Ma túy Tội phạm Liên hợp quốc Dịch tễ học nước thải DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Số lượng ma túy bị bắt giữ Việt Nam từ năm 2015 đến 2020 11 Bảng 1.2 Các nghiên cứu phương pháp xác định dư lượng ma túy môi trường giới 12 Bảng 2.1 Các ngoại chuẩn nội chuẩn .22 Bảng 2.2 Các hóa chất 23 Bảng 2.3 Thiết bị nghiên cứu 23 Bảng 2.4 Độ thu hồi, độ lặp lại chấp nhận nồng độ khác theo AOAC 30 Bảng 3.1 Các thơng số hoạt động nguồn ion hóa 32 Bảng 3.2 Các điều kiện khối phổ để phân tích ma túy 32 Bảng 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng mẫu 40 Bảng 3.4 Kết đánh giá độ phù hợp hệ thống LC - MS/MS 43 Bảng 3.5 Tỷ lệ hai mảnh bắn phá chất nghiên cứu 45 Bảng 3.6 Kết xây dựng đường chuẩn 46 Bảng 3.7 Kết khảo sát độ độ xác phương pháp 47 Bảng 3.8 Kết khảo sát LOQ phương pháp 48 Bảng 3.9 Kết khảo sát LOD 49 Bảng 3.10 Kết phân tích mẫu bùn 51 Bảng 4.1 Tổng hợp kết LOD, LOQ số nghiên cứu 57 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo AMP Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo MAMP Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo KET Hình 1.4 Công thức cấu tạo MDMA .9 Hình 1.5 Sơ đồ cấu tạo máy khối phổ 20 Hình 3.1 Phổ đồ MS/MS MAMP 33 Hình 3.2 Sắc đồ chất phân tích khảo sát cột sắc ký 34 Hình 3.3 Kết khảo sát pha động 36 Hình 3.4 Kết khảo sát dung môi phân tán mẫu 38 Hình 3.5 Kết khảo sát dung môi rửa giải SPE 39 Hình 3.6 Sắc đồ mẫu trắng mẫu chuẩn 44 Hình 3.7 Đường chuẩn chất phân tích nghiên cứu 46 Hình 3.8 Sắc đồ chất phân tích mức nồng độ LOD 49 Hình 3.9 Sắc đồ phân tích mẫu bùn 51 Hình 3.10 Biểu đồ nồng độ chất phân tích mẫu bùn nghiên cứu 52 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm gần khu vực “Tam giác Vàng”, đường biên giới dài địa hình 3/4 đồi núi gây khó khăn cho cơng tác phịng chống ma túy [37], [38] Theo báo cáo Cơ quan phòng chống Ma túy Tội phạm Liên hợp quốc (UNODC số lượng thuốc ma túy bị bắt giữ Việt Nam tăng mạnh giai đoạn năm 2013 đến 2020 [34] Cùng với đó, tình hình người nghiện ma túy diễn biến phức tạp, gia tăng số lượng, tính chất, mức độ, gây khó khăn cơng tác quản lý Tính đến tháng 12/2020, nước có 235.000 người nghiện ma túy có hồ sơ quản lý [4] Để xây dựng sách y tế cơng cộng nhằm bảo vệ người dân khỏi tình trạng lạm dụng ma túy điều quan trọng phải thống kê kịp thời xác tỷ lệ sử dụng loại thuốc cộng đồng [18] Trong thập kỷ gần đây, phương pháp dịch tễ học nước thải (Wastewater-Based Epidemiology) nghiên cứu áp dụng rộng rãi giới nhằm cung cấp thông tin việc tiêu thụ phơi nhiễm với hóa chất bao gồm thuốc, sản phẩm chăm sóc sức khỏe, ma túy, rượu thuốc Phần lớn loại ma túy sử dụng tiết dạng hợp chất ban đầu chất chuyển hóa thải trực tiếp vào mạng lưới thoát nước [36] Theo cách tiếp cận này, dựa vào nồng độ chất nước thải, lưu lượng xả thải hàng ngày dân số khu vực để ước tính tổng lượng tiêu thụ theo đầu người sau lượng tiêu thụ chất theo đầu người phạm vi khảo sát [26], [31] Tại Việt Nam, Trần Thị Thanh Huế cộng (2022) sử dụng phương pháp WBE để ước tính tỷ lệ tiêu thụ trái phép chất ma túy Hà Nội từ năm 2018 đến 2020 [32] Tuy nhiên, tính kỵ nước chế khác tạo cầu nối cation, trao đổi cation, liên kết hydro… làm cho phần ma túy bị hấp phụ vào bùn [14], [27], [33] Để đánh giá xác nồng độ chất xả thải môi trường nhằm phục vụ phương pháp WBE ngồi việc phân tích nước thải cịn cần đến liệu dư lượng chất bùn thải Đây hướng nghiên cứu chưa thực Việt Nam Do đó, chúng tơi thực nghiên cứu “Xây dựng phương pháp xác định dư lượng số ma túy bùn thải phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)” với mục tiêu sau: 1 Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời dư lượng số ma túy bùn thải phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LCMS/MS) Bước đầu ứng dụng phương pháp để đánh giá dư lượng số ma túy mẫu bùn thải thu thập sông chứa nước thải Hà Nội Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan ma túy 1.1.1 Định nghĩa Theo Tổ chức Liên Hợp Quốc: Ma túy “Các chất có nguồn gốc tự nhiên hay tổng hợp, xâm nhập vào thể làm thay đổi trạng thái tâm sinh lý người sử dụng” Luật Phòng, chống ma tuý số 73/2021/QH14 Việt Nam Quốc hội thông qua ngày 30/3/2021, có hiệu lực từ ngày 01/01/2022, đưa khái niệm chất ma túy sau: Chất ma tuý chất gây nghiện, chất hướng thần quy định danh mục chất ma túy Chính phủ ban hành Chất gây nghiện chất kích thích ức chế thần kinh, dễ gây tình trạng nghiện người sử dụng Chất hướng thần chất kích thích ức chế thần kinh gây ảo giác, sử dụng nhiều lần dẫn tới tình trạng nghiện người sử dụng [9] Danh mục chất ma túy tiền chất quy định Nghị định số 73/2018/NĐ-CP năm 2018 Chính phủ [7] có sửa đổi bổ sung Nghị định số 60/2020/NĐ-CP năm 2020 Chính phủ [8] 1.1.2 Phân loại ma túy Dựa nguồn gốc, tác dụng hệ thần kinh trung ương người ta đưa cách phân loại ma tuý sau: 1.1 Phân loại theo nguồn gốc - Ma túy tự nhiên: Đây chất ma tuý có sẵn tự nhiên, alcaloid số thực vật thuốc phiện (anh túc), cần sa (cây gai dầu), coca (cocain)… - Ma túy bán tổng hợp: Là chất ma túy tổng hợp phần từ số loại ma tuý có sẵn tự nhiên, có tác dụng mạnh chất ma túy ban đầu Ví dụ: morphin, heroin… - Ma túy tổng hợp: Là nhóm chất ma túy khơng có tự nhiên Ma túy tổng hợp tổng hợp nên từ loại hóa chất (các hóa chất gọi tiền chất): ví dụ: amphetamin (AMP), 3,4-methylenedioxy methamphetamin (MDMA), ecstasy, ma túy đá [43] Quantify Sample Report BE center - NIDQC Dataset: Untitled MassLynx V4.2 SCN985 Page of Name: P2-241021 MS Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\25032022.PRO\ACQUDB\HHCGN.EXP Inlet Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\25032022.PRO\ACQUDB\HHCGN-Gra8 Tune Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\25032022.PRO\ACQUDB\Methamphetamine012022.IPR Instrument: XEVO-TQD#QCB0140 User: Vial: 2:E,6 Date: 25-Mar-2022 Time: 22:11:49 Metamphetamin_2 Amphetamin_2 P2-241021 Smooth(Mn,2x3) Metamphetamin_2 4.40 100 MRM of 16 channels,ES+ 150 > 119 5.059e+005 P2-241021 Smooth(Mn,2x3) MRM of 16 channels,ES+ 136 > 65.02 5.658e+004 4.55 100 % % 1.54 1.86 3.05 2.5 5.0 7.5 10.0 4.95 8.76 10.63 12.5 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Amphetamin_1 P2-241021 Smooth(Mn,2x3) MRM of 16 channels,ES+ 136 > 91 1.130e+006 4.55 100 % 1.53 1.86 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 # Name Trace RT Area Ketamin-d4 242.07>128.97 4.93 60761 IS Area Response Ketamin_2 237.99>206.99 4.93 5498 5498.226 Ketamin_1 237.99>124.97 4.94 18354 18353.605 MDMA-d5 199.11>165.04 4.50 194356 194355.734 MDMA_2 194.07>104.95 4.52 21977 21977.264 MDMA_1 194.07>163.04 4.51 25362 25362.201 Metamphetamin-d5 155.12>91.76 4.38 60747 60746.613 Metamphetamin_1 150>90.99 4.41 149706 149706.453 Metamphetamin_2 49661.430 60760.500 150>119 4.40 49661 10 Amphetamin_2 136>65.02 4.07 156 155.794 11 Amphetamin_1 136>91 4.01 3450 3449.574 Conc %Rec Quantify Sample Report BE center - NIDQC Dataset: Untitled MassLynx V4.2 SCN985 Page of Method: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\MethDB\chatgaynghien-ver29.mdb 15 Apr 2022 15:37:45 Calibration: 15 Apr 2022 15:37:45 Name: P2-080122 MS Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN.EXP Inlet Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN-Gra8 Tune Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\Methamphetamine012022.IPR Instrument: XEVO-TQD#QCB0140 User: Vial: 2:A,7 Date: 29-Mar-2022 Time: 19:38:50 Ketamin-d4 Ketamin_2 P2-080122 Smooth(Mn,2x3) Ketamin-d4 4.94 100 MRM of 16 channels,ES+ 242.07 > 128.97 1.541e+006 P2-080122 Smooth(Mn,2x3) Ketamin_2 4.95 100 MRM of 16 channels,ES+ 237.99 > 206.99 2.467e+005 % % 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 2.5 Ketamin_1 5.0 7.5 10.0 12.5 MDMA-d5 P2-080122 Smooth(Mn,2x3) Ketamin_1 4.95 100 MRM of 16 channels,ES+ 237.99 > 124.97 7.257e+005 P2-080122 Smooth(Mn,2x3) MDMA-d5 4.53 100 MRM of 16 channels,ES+ 199.11 > 165.04 4.604e+006 % % 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 2.5 MDMA_2 5.0 7.5 10.0 12.5 MDMA_1 P2-080122 Smooth(Mn,2x3) MDMA_2 4.55 100 MRM of 16 channels,ES+ 194.07 > 104.95 2.922e+005 P2-080122 Smooth(Mn,2x3) MDMA_1 4.54 100 MRM of 16 channels,ES+ 194.07 > 163.04 5.431e+005 % % MDMA_2 4.55 1.20 3.84 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Quantify Sample Report BE center - NIDQC Dataset: Untitled MassLynx V4.2 SCN985 Page of Name: P2-080122 MS Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN.EXP Inlet Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN-Gra8 Tune Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\Methamphetamine012022.IPR Instrument: XEVO-TQD#QCB0140 User: Vial: 2:A,7 Date: 29-Mar-2022 Time: 19:38:50 Metamphetamin-d5 Metamphetamin_1 P2-080122 Smooth(Mn,2x3) Metamphetamin-d5 4.42 100 MRM of 16 channels,ES+ 155.12 > 91.76 1.248e+006 % P2-080122 Smooth(Mn,2x3) Metamphetamin_1 4.44 100 MRM of 16 channels,ES+ 150 > 90.99 1.735e+006 % 1.37 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 2.5 Metamphetamin_2 5.0 7.5 10.0 12.5 Amphetamin_2 P2-080122 Smooth(Mn,2x3) Metamphetamin_2 4.44 100 MRM of 16 channels,ES+ 150 > 119 5.843e+005 % P2-080122 Smooth(Mn,2x3) Amphetamin_2 4.59 100 % MRM of 16 channels,ES+ 136 > 65.02 1.794e+005 0.97 1.55 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 MRM of 16 channels,ES+ 136 > 91 3.773e+006 4.59 100 % 1.54 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 2.5 Amphetamin_1 P2-080122 Smooth(Mn,2x3) 5.0 7.5 10.0 12.5 Quantify Sample Report BE center - NIDQC Dataset: Untitled MassLynx V4.2 SCN985 Page of Name: P2-080122 MS Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN.EXP Inlet Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN-Gra8 Tune Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\Methamphetamine012022.IPR Instrument: XEVO-TQD#QCB0140 User: Vial: 2:A,7 Date: 29-Mar-2022 Time: 19:38:50 # Name Trace RT Area Ketamin-d4 242.07>128.97 4.94 121311 IS Area 121311.297 Response Ketamin_2 237.99>206.99 4.95 19655 19655.168 Ketamin_1 237.99>124.97 4.95 56984 56983.918 MDMA-d5 199.11>165.04 4.53 371391 371391.469 MDMA_2 194.07>104.95 4.55 29748 29747.730 MDMA_1 194.07>163.04 4.54 42941 42940.535 Metamphetamin-d5 155.12>91.76 4.42 116915 116914.500 Metamphetamin_1 150>90.99 4.44 157164 157163.625 Metamphetamin_2 150>119 4.44 55177 55176.875 10 Amphetamin_2 136>65.02 4.59 19733 19732.811 11 Amphetamin_1 136>91 4.07 3106 3106.365 Conc %Rec Name: P2-150122 MS Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN.EXP Inlet Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN-Gra8 Tune Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\Methamphetamine012022.IPR Instrument: XEVO-TQD#QCB0140 User: Vial: 2:A,8 Date: 29-Mar-2022 Time: 19:54:50 Ketamin-d4 Ketamin_2 P2-150122 Smooth(Mn,2x3) Ketamin-d4 4.94 100 MRM of 16 channels,ES+ 242.07 > 128.97 1.454e+006 P2-150122 Smooth(Mn,2x3) Ketamin_2 4.95 100 MRM of 16 channels,ES+ 237.99 > 206.99 2.134e+005 % % 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Quantify Sample Report BE center - NIDQC Dataset: Untitled MassLynx V4.2 SCN985 Page of Name: P2-150122 MS Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN.EXP Inlet Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN-Gra8 Tune Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\Methamphetamine012022.IPR Instrument: XEVO-TQD#QCB0140 User: Vial: 2:A,8 Date: 29-Mar-2022 Time: 19:54:50 Ketamin_1 MDMA-d5 P2-150122 Smooth(Mn,2x3) Ketamin_1 4.94 100 MRM of 16 channels,ES+ 237.99 > 124.97 6.601e+005 % P2-150122 Smooth(Mn,2x3) MDMA-d5 4.52 100 MRM of 16 channels,ES+ 199.11 > 165.04 4.860e+006 % 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 2.5 MDMA_2 5.0 7.5 10.0 12.5 MDMA_1 P2-150122 Smooth(Mn,2x3) MDMA_2 4.54 100 MRM of 16 channels,ES+ 194.07 > 104.95 5.567e+005 % P2-150122 Smooth(Mn,2x3) MDMA_1 4.54 100 MRM of 16 channels,ES+ 194.07 > 163.04 1.080e+006 % 3.67 MDMA_2 4.54 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 2.5 Metamphetamin-d5 5.0 7.5 10.0 12.5 Metamphetamin_1 P2-150122 Smooth(Mn,2x3) Metamphetamin-d5 4.41 100 MRM of 16 channels,ES+ 155.12 > 91.76 1.435e+006 % P2-150122 Smooth(Mn,2x3) Metamphetamin_1 4.43 100 MRM of 16 channels,ES+ 150 > 90.99 4.123e+006 % 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Quantify Sample Report BE center - NIDQC Dataset: Untitled MassLynx V4.2 SCN985 Page of Name: P2-150122 MS Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN.EXP Inlet Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN-Gra8 Tune Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\Methamphetamine012022.IPR Instrument: XEVO-TQD#QCB0140 User: Vial: 2:A,8 Date: 29-Mar-2022 Time: 19:54:50 Metamphetamin_2 Amphetamin_2 P2-150122 Smooth(Mn,2x3) Metamphetamin_2 4.43 100 MRM of 16 channels,ES+ 150 > 119 1.411e+006 P2-150122 Smooth(Mn,2x3) Amphetamin_2 4.58 100 MRM of 16 channels,ES+ 136 > 65.02 8.567e+004 0.76 % % 0.99 1.54 1.89 5.0 7.5 10.0 9.71 10.82 2.5 Amphetamin_2 4.58 12.5 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Amphetamin_1 P2-150122 Smooth(Mn,2x3) 4.58 100 % MRM of 16 channels,ES+ 136 > 91 1.719e+006 1.54 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 # Name Trace RT Area Ketamin-d4 242.07>128.97 4.94 115850 IS Area 115850.406 Response Ketamin_2 237.99>206.99 4.95 16794 16794.436 Ketamin_1 237.99>124.97 4.94 51402 51401.563 MDMA-d5 199.11>165.04 4.52 401586 401585.656 MDMA_2 194.07>104.95 4.54 53288 53288.066 MDMA_1 194.07>163.04 4.54 88006 88005.523 Metamphetamin-d5 155.12>91.76 4.41 136271 136270.797 Metamphetamin_1 150>90.99 4.43 378383 378383.406 Metamphetamin_2 150>119 4.43 131174 131174.391 10 Amphetamin_2 136>65.02 4.58 9601 9601.339 11 Amphetamin_1 136>91 4.05 6202 6202.198 Conc %Rec Quantify Sample Report BE center - NIDQC Dataset: Untitled MassLynx V4.2 SCN985 Page of Name: P2-010122 MS Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN.EXP Inlet Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN-Gra8 Tune Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\Methamphetamine012022.IPR Instrument: XEVO-TQD#QCB0140 User: Vial: 2:B,1 Date: 29-Mar-2022 Time: 20:10:50 Ketamin-d4 Ketamin_2 P2-010122 Smooth(Mn,2x3) Ketamin-d4 4.93 100 MRM of 16 channels,ES+ 242.07 > 128.97 1.267e+006 % P2-010122 Smooth(Mn,2x3) Ketamin_2 4.94 100 MRM of 16 channels,ES+ 237.99 > 206.99 1.287e+005 % 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 2.5 Ketamin_1 5.0 7.5 10.0 12.5 MDMA-d5 P2-010122 Smooth(Mn,2x3) Ketamin_1 4.94 100 MRM of 16 channels,ES+ 237.99 > 124.97 3.834e+005 P2-010122 Smooth(Mn,2x3) MDMA-d5 4.51 100 MRM of 16 channels,ES+ 199.11 > 165.04 4.526e+006 % % 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 2.5 MDMA_2 5.0 7.5 10.0 12.5 MDMA_1 P2-010122 Smooth(Mn,2x3) MDMA_2 4.53 100 MRM of 16 channels,ES+ 194.07 > 104.95 3.334e+005 % P2-010122 Smooth(Mn,2x3) MDMA_1 4.53 100 MRM of 16 channels,ES+ 194.07 > 163.04 6.380e+005 % 3.63 MDMA_2 4.53 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Quantify Sample Report BE center - NIDQC Dataset: Untitled MassLynx V4.2 SCN985 Page of Name: P2-010122 MS Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN.EXP Inlet Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN-Gra8 Tune Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\Methamphetamine012022.IPR Instrument: XEVO-TQD#QCB0140 User: Vial: 2:B,1 Date: 29-Mar-2022 Time: 20:10:50 Metamphetamin-d5 Metamphetamin_1 P2-010122 Smooth(Mn,2x3) Metamphetamin-d5 4.39 100 MRM of 16 channels,ES+ 155.12 > 91.76 1.403e+006 P2-010122 Smooth(Mn,2x3) Metamphetamin_1 4.42 100 MRM of 16 channels,ES+ 150 > 90.99 3.431e+006 % % 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 2.5 Metamphetamin_2 5.0 7.5 10.0 12.5 Amphetamin_2 P2-010122 Smooth(Mn,2x3) Metamphetamin_2 4.42 100 MRM of 16 channels,ES+ 150 > 119 1.140e+006 % P2-010122 Smooth(Mn,2x3) Amphetamin_2 4.58 100 % MRM of 16 channels,ES+ 136 > 65.02 1.003e+005 1.53 1.86 2.54 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 P2-010122 Smooth(Mn,2x3) % MRM of 16 channels,ES+ 136 > 91 2.124e+006 4.57 100 1.53 1.86 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 2.5 Amphetamin_1 10.39 5.0 7.5 10.0 12.5 Quantify Sample Report BE center - NIDQC Dataset: Untitled MassLynx V4.2 SCN985 Page of Name: P2-010122 MS Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN.EXP Inlet Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\HHCGN-Gra8 Tune Method Name: D:\LCMS53.06\Development\2022\DTCH\29032022.PRO\ACQUDB\Methamphetamine012022.IPR Instrument: XEVO-TQD#QCB0140 User: Vial: 2:B,1 Date: 29-Mar-2022 Time: 20:10:50 # Name Trace RT Area Ketamin-d4 242.07>128.97 4.93 99376 IS Area 99376.469 Response Ketamin_2 237.99>206.99 4.94 10291 10291.361 Ketamin_1 237.99>124.97 4.94 30333 30333.086 MDMA-d5 199.11>165.04 4.51 372017 372016.500 MDMA_2 194.07>104.95 4.53 36880 36880.102 MDMA_1 194.07>163.04 4.53 51417 51417.293 Metamphetamin-d5 155.12>91.76 4.39 131908 131908.188 Metamphetamin_1 150>90.99 4.42 311883 311882.688 Metamphetamin_2 150>119 4.42 106462 106462.117 10 Amphetamin_2 136>65.02 4.58 10840 10839.703 11 Amphetamin_1 136>91 4.04 6200 6199.766 Conc %Rec PHỤ LỤC 6: QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC MẪU THỬ Thuốc thử: - Methanol HPLC (TT) - Acid formic LC-MS (TT) - Acid formic PA (TT) - EDTA PA (TT) - Nước (TT) Mẫu thử - Lấy bùn thải từ địa điểm dự kiến - Bảo quản - 20 ºC tới phân tích - Rã đơng trước phân tích, rây qua rây mm để loại tạp thô sỏi đá, cành cây, cây… - Trải mỏng mẫu bùn đĩa petri để khô tự nhiên (hoặc sấy nhiệt độ không 40 ºC) đến độ ẩm khoảng 15 %, nghiền nhỏ - Xác định hàm ẩm mẫu Điều kiện sắc ký - Cột Acquity BEH C18 (1,7 μm; 2,1 x 50 mm) - Điều nhiệt cột: 40ºC - Tốc độ dịng: 0,2 ml/phút - Thể tích tiêm: 10 μl - Pha động: kênh A nước chứa FA 0,1 %, kênh B MeOH chứa FA 0,1 % - Chương trình gradient Thời gian (phút) Tỷ lệ (%) 10 10,1 15 Kênh A 90 90 5 90 90 Kênh B 10 10 95 95 10 10 Điều kiện khối phổ: Thông số (đơn vị) Giá trị tối ưu Nhiệt độ hóa (oC) Tốc độ khí (L/H) 500 800 Điện mao quản (kV) 1,0 Khí Cone (L/H) 30 91,76 24 16 Ion định tính Điện Thế Ion phân (m/z) Cone mảnh (V) (V) 65,02 20 32 206,99 30 14 211,00 30 14 119,00 18 12 24 10 121,03 MDMA 194,07 163,04 24 12 104,95 24 24 MDMA - d5 199,11 165,04 26 12 107,03 26 24 TT Tên chất/nội chuẩn AMP KET KET-d4 MAMP MAMP - d5 Ion định lượng Ion Điện Thế mẹ Ion phân (m/z) (m/z) Cone mảnh (V) (V) 136,00 91,00 20 14 237,99 124,97 30 26 242,07 128,97 30 26 150,00 90,99 18 16 155,12 Tiến hành Dung môi pha mẫu: nước Dung dịch chuẩn: + Dung dịch chuẩn gốc 10 µg/ml chất phân tích KET, MAMP, MDMA, AMP: Lấy ml dung dịch chuẩn mg/ml chất cho vào bình định mức 100 ml bổ sung MeOH đến vạch + Dung dịch chuẩn nội gốc MAMP - d5, MDMA - d5 nồng độ 10 µg/ml: Lấy ml dung dịch chuẩn mg/ml chất cho vào bình định mức 100 ml bổ sung MeOH đến vạch + Dung dịch chuẩn nội gốc KET - d4 nồng độ 10 µg/ml: Lấy ml dung dịch chuẩn KET - d4 nồng độ 100 µg/ml cho vào bình định mức 10 ml bổ sung MeOH đến vạch + Dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 ppb: lấy ml dung dịch chuẩn làm việc 10 µg/ml chất KET, MAMP, MDMA, AMP cho vào bình định mức 100 ml bổ sung MeOH đến vạch + Dung dịch nội chuẩn hỗn hợp 100 ppb: lấy ml dung dịch chuẩn gốc 10 µg/ml nội chuẩn MAMP - d5, MDMA - d5, KET - d4 cho vào bình định mức 100 ml bổ sung MeOH đến vạch + Dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 ppb: lấy ml dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 ppb cho vào bình định mức 10 ml bổ sung dung môi H2O Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn gồm dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ KET, MAMP, MDMA, AMP có nồng độ 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2; 5; 8; 10; 15 ppb thêm dung dịch hỗn hợp chuẩn nội MAMP - d5, MDMA - d5, KET - d4 có nồng độ ppb từ dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 ppb; ppb dung dịch nội chuẩn 100 ppb với dung môi H2O Nồng độ (ppb) 0,125 0,25 0,5 1,0 2,0 5,0 8,0 10,0 15,0 Vhh chuẩn 10 ppb (µl) 25 25 50 100 200 - - - - Vhh chuẩn 100 ppb (µl) - - - - - 50 80 100 150 Vhh chuẩn nội hỗn hợp 100 ppb (µl) 100 50 50 50 50 50 50 50 50 Vnước (µl) 1875 920 900 850 750 900 870 850 800 Dung dịch thử: - Cân xác khoảng 1g bùn (khơ, nghiền nhỏ) cho vào ống falcon dung tích 15 ml - Thêm ng dung dịch nội chuẩn hỗn hợp (50 µl dung dịch nội chuẩn hỗn hợp nồng độ chất 100 ppb) Lắc xoáy 60 giây, để ổn định 15 phút - Phân tán mẫu dung môi: + Phân tán mẫu ml hỗn hợp H2O (có chứa FA 0,5 % EDTA 0,1 %) : MeOH = : 1, lắc xoáy 15 giây, siêu âm 10 phút, ly tâm 4000 vòng/phút 15 phút, gạn phần dịch vào bình đựng mức 250 ml Lặp lại lần nữa, lần với ml hỗn hợp chiết + Thêm nước vừa đủ 250 ml, lắc đều, đưa toàn mẫu lên cột chiết pha rắn InertSep HLB FF (500 mg/6 ml) - Chiết pha rắn: + Hoạt hóa: Cho ml MeOH, ml H2O qua cột + Đưa toàn 250 ml mẫu lên cột Dịch mẫu đưa qua cột tác động trọng lực + Loại tạp: Bằng ml H2O Làm khô cột hút chân không 15 phút + Rửa giải: Cho ml methanol ml hỗn hợp methanol : dicloromethan (1 : 1), rửa giải tác động trọng lực Dịch rửa giải dịng khí N2 nhiệt độ 40ºC hòa tan cắn 0,5 ml hỗn hợp nước – methanol (9 : 1), lắc xoáy 60 giây Sự phù hợp hệ thống sắc ký: Tiêm dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký Trên sắc đồ thu được, RSD diện tích pic lần tiêm lặp lại không lớn 5,0 %, RSD thời gian lưu không lớn 5,0 % Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn dung dịch thử Tính tốn kết quả: Nồng độ chất KET, MAMP, MDMA mẫu tính tốn dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính, tỷ lệ đáp ứng chất phân tích/ nội chuẩn tương ứng: HL(%)  ( Smt  b)   10000 Snc a x mc x (100 - HA) Trong đó: Smt: diện tích pic chất phân tích Snc: diện tích pic nội chuẩn tương ứng a, b: hệ số góc hệ số chắn phương trình hồi quy tuyến tính tỷ lệ diện tích pic chất phân tích nội chuẩn, nồng độ mc: khối lượng mẫu bùn HA: hàm ẩm mẫu bùn (%) Nồng độ chất AMP mẫu tính tốn dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính, tỷ lệ đáp ứng chất phân tích/ nội chuẩn tương ứng hệ số chuyển (tỷ lệ hiệu suất chiết MAMP-d5 hiệu suất chiết AMP) HL(%)  ( Smt 39,09  b)  10000  Snc a x m c x (100 - HA) 14,94 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN ANH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ MA TÚY TRONG BÙN THẢI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN (LC-MS/MS) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2022 ... cứu ? ?Xây dựng phương pháp xác định dư lượng số ma túy bùn thải phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC- MS/MS)” với mục tiêu sau: 1 Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời dư lượng. .. thời dư lượng số ma túy bùn thải phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LCMS/MS) Bước đầu ứng dụng phương pháp để đánh giá dư lượng số ma túy mẫu bùn thải thu thập sông chứa nước thải Hà Nội... Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng dư lượng số ma túy bùn thải LC-MS/MS 24 2.2.2 Ứng dụng phương pháp để đánh giá dư lượng ma túy số