Đặng thị nga xây dựng phương pháp định lượng entecavir trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ (lc – msms) luận văn thạc sĩ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ NGA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ENTECAVIR TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC – MS/MS) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ NGA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ENTECAVIR TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC – MS/MS) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC KIỂM NGHIỆM THUỐC & ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Liên PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI 2023 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Liên – Trưởng Phòng Dược lý – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh – Giảng viên cao cấp - Khoa Hóa phân tích Kiểm nghiệm thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội, hai người thầy tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm quý báu quan tâm giúp đỡ suốt q trình thực hồn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô công tác Khoa Hóa phân tích Kiểm nghiệm thuốc thầy cô dạy giúp đỡ thời gian học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc – Học viện Y – Dược học cổ truyền Việt Nam tạo điều kiện cho học tập thực luận văn Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới anh chị em - Trung tâm đánh giá tương đương sinh học – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương tạo điều kiện giúp đỡ q trình hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè ủng hộ, động viên Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn Thầy, Cơ, quan, gia đình bạn bè giúp tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày 31 tháng 03 năm 2023 Học viên: Đặng Thị Nga MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ENTECAVIR 1.1.1 Công thức cấu tạo tính chất lý hóa entecavir 1.1.1.1 Công thức cấu tạo 1.1.1.2 Tính chất lý hóa 1.1.2 Các đặc tính dược lực học, dược động học Entecavir 1.1.2.1 Đặc tính dược lực học Entecavir 1.1.2.2 Đặc tính dược động học Entecavir 1.1.3 Một số nghiên cứu định lượng Entecavir dịch sinh học 1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC 10 1.2.1 Kỹ thuật xử lý mẫu dịch sinh học 10 1.2.1.1 Kỹ thuật tủa protein 11 1.2.1.2 Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng: 11 1.2.1.3 Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE): 12 1.2.2 Kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC – MS/ MS 13 1.2.2.1 Thiết bị sắc ký lỏng 14 1.2.2.2 Nguồn ion hóa kiểu phun sương điện tử (ESI – Electron spray ionization) 15 1.2.2.3 Bộ phận phân tích khối tứ cực chập ba (triple quadrupole mass analyser) 15 1.2.2.4 Bộ phận phát (Detector) 16 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 18 2.1.1 Chất chuẩn, hóa chất, dung mơi 18 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 19 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 20 2.2.1 Mẫu huyết tương 20 2.2.2 Thuốc nghiên cứu (đánh giá tương đương sinh học) 20 2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 20 2.3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ phân tích ETV 20 2.3.1.2 Lựa chọn điều kiện MS phân tích chuẩn nội q trình phân tích 21 2.3.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký 21 2.3.1.4 Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương chứa chất phân tích 21 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 22 2.3.2.1 Chuẩn bị mẫu thẩm định: 22 2.3.2.2 Phương pháp phân tích 25 2.3.3 Ứng dụng phương pháp định lượng entecavir mẫu huyết tương người tình nguyện sử dụng chế phẩm entecavir 26 2.3.4 Xử lý số liệu 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 28 3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ phân tích Entecavir 28 3.1.1.1 Ion hóa ETV xác định điều kiện chọn lọc ion mẹ 28 3.1.1.2 Phân mảnh ion mẹ ETV chọn lọc ion 28 3.1.2 Lựa chọn điều kiện MS chuẩn nội trình phân tích 30 3.1.3 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 30 3.1.4 Khảo sát quy trình xử lý mẫu ETV huyết tương 34 3.1.5 Điều kiện phân tích định lượng entecavir huyết tương người LC-MS/MS 39 3.2 THẨM ĐỊNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 41 3.2.1 Độ đặc hiệu- chọn lọc phương pháp 41 3.2.2 Giới hạn định lượng (LLOQ) 43 3.2.3 Đường chuẩn - khoảng tuyến tính 45 3.2.4 Độ nhiễm chéo 47 3.2.5 Độ – độ xác 47 3.2.5.1 Độ - độ xác ngày, khác ngày 47 3.2.5.2 Độ - độ xác mở rộng lô 49 3.2.5.3 Độ tái lặp tiêm mẫu 50 3.2.5.4 Độ – độ xác pha lỗng 51 3.2.6 Tỷ lệ thu hồi chất phân tích chuẩn nội 52 3.2.7 Độ ổn định 54 3.2.7.1 Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc dung dịch chuẩn làm việc 54 3.2.7.2 Độ ổn định dược chất huyết tương, sau trình xử lý mẫu 55 3.2.7.3 Độ ổn định máu toàn phần 56 3.2.8 Ảnh hưởng mẫu 57 3.2.9 Ảnh hưởng tan huyết mỡ máu 58 3.3 ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG ENTECAVIR TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI TÌNH SỬ DỤNG CHẾ PHẨM CHỨA ETV 59 CHƯƠNG BÀN LUẬN 65 4.1 VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG ETV TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI 65 4.2 VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 67 4.3 VỀ ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG ETV TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI TÌNH NGUYỆN 68 KẾT LUẬN 69 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ASEAN Liên hiệp quốc gia Đơng Nam Á AUC Diện tích đường cong AUC0-72h AUC từ dùng thuốc (0 giờ) đến thời điểm 72 sau uống thuốc Cmax Nồng độ đỉnh CHB Nhiễm HBV mạn tính CV Hệ số biến thiên DĐH Dược động học ĐĐ Độ ECD Detector điện hóa (Electrochemical detector) ETV Entecavir EMA Cơ quan quản lý thuốc Châu Âu EMPA Empagliflozin ESI Ion hóa kiểu phun sương điện tử (Electrospray ionization) GLP Thực hành tốt phịng thí nghiệm HBV Nhiễm vius viêm gan B HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HQC Mẫu kiểm tra nồng độ cao IS Chất chuẩn nội KLPT Khối lượng phân tử LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ (1 lần) LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid chromatography – Tandem mass spectrometry) LLOQ Giới hạn định lượng LQC Mẫu kiểm tra nồng độ thấp m/z Khối lượng/điện tích ME Hiệu ứng mẫu MQC Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình NTN Người tình nguyện QC Mẫu kiểm tra IWS Dung dịch chuẩn làm việc ETV để pha đường chuẩn WS-QC Dung dịch chuẩn làm việc ETV để pha mẫu kiểm tra tR Thời gian lưu SKĐ Sắc ký đồ SKD Sinh khả dụng SQC Mẫu kiểm tra bổ sung TĐSH Tương đương sinh học TLTK Tài liệu tham khảo Tmax Thời gian đạt nồng độ đỉnh (thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa máu) T1/2 Thời gian bán thải ULOQ Giới hạn định lượng US-FDA Hiệp hội thực phẩm- dược phẩm Mỹ UV-VIS Tử ngoại- khả kiến v/v Thể tích/thể tích VKNTTW Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương w/w Khối lượng/khối lượng WHO Tổ chức y tế Thế giới (World Health Organization) DANH MỤC BẢNG bảng Các chất chuẩn, dung mơi, hóa chất sử dụng 18 bảng 2.2 Các lô dịch sinh học trắng dùng để thẩm định phương pháp phân tích 19 bảng 2.3 Các thiết bị, dụng cụ sử dụng 19 bảng 2.4 Cách chuẩn bị dãy chuẩn làm việc để pha mẫu đường chuẩn 23 bảng 2.5 Cách chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc để pha mẫu qc sst 24 bảng 2.6 Cách chuẩn bị đường chuẩn lloq huyết tương 24 bảng 2.7 Cách chuẩn bị mẫu kiểm tra (qc) sst huyết tương 25 bảng 2.8 Cách chuẩn bị mẫu dc huyết tương 25 chương Kết nghiên cứu 28 bảng 3.1 Kết khảo sát tỷ lệ pha động 31 bảng 3.2 Ảnh hưởng mẫu trắng thời điểm rt etv is 42 bảng 3.3 Đáp ứng pic mẫu lloq mẫu zero 44 bảng 3.4 Độ - độ xác mẫu lloq 44 bảng 3.5 Kết khảo sát đường chuẩn theo mơ hình weighting 1/x2 46 bảng 3.6 Kết đánh giá độ nhiễm chéo 47 bảng 3.7 Kết thẩm định độ – độ xác ngày khác ngày 48 bảng 3.8 Kết khảo sát độ - độ xác mở rộng 49 bảng 3.9 kết độ lặp lại tiêm mẫu 50 bảng 3.10 Kết khảo sát độ - độ xác pha lỗng 51 bảng 3.11 Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi etv 53 bảng 3.12 Kết độ ổn định dung dịch chuẩn 55 bảng 3.13 Kết độ ổn định etv mẫu huyết tương, sau trình xử lý mẫu 56 bảng 3.14 Kết độ ổn định máu toàn phần nhiệt độ phòng 57 bảng 3.15 Kết đánh giá ảnh hưởng mẫu 58 bảng 3.16 Kết đánh giá ảnh hưởng tan huyết mỡ máu etv 59 bảng 3.17 Kết nồng độ etv huyết tương 03 người tình nguyện 60 bảng 3.18 Kết thông số dđh entecavir huyết tương 03 ntn 61 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo Emtecavir Hình 1.2 Sơ đồ khối thiết bị sắc ký lỏng khối phổ 14 Hình 1.3 Bộ phân tích tứ cực đơn 16 Hình 1.4 Bộ phân tích tứ cực chập ba 16 Hình 3.1 Phổ mảnh ion ETV (Phân mảnh ban đầu) 29 Hình 3.2 Phổ mảnh ion ETV (Phân mảnh ion cuối) 29 Hình 3.3 Giản đồ lượng phân mảnh [ETV+H] + 30 Hình 3.4 SKĐ chất chuẩn IS phân tích pha động hệ 32 Hình 3.5 SKĐ chất chuẩn IS phân tích pha động hệ 32 Hình 3.6 SKĐ chất chuẩn IS phân tích pha động hệ 33 Hình 3.7 SKĐ chất chuẩn IS phân tích pha động hệ 33 Hình 3.8 SKĐ ETV chuẩn IS xử lý theo quy trình 36 PHỤ LỤC page Of 55 ANALYST SAMPLE REPORT Sample Name Data File Sample Type Acquisition Date G02-LQC1 Acquisition Method ETV-Ver01-lnstrument.dam C02.wIff Quality Contro 6/7/2022 PM Ana ysis\2022 Entecavir 52BE Project 03 Result Table G02.rdb Instrument Code VKN/TDSH/53.05 Operator tdsh 53.05-cham Internal Standard Entecavir-13C2 15N In ection Vial Injection Volume Algorithm Used Dilution Factor 57 Weight to Volume 0.00 Instrument Name sciex QTRAP 6500* Area (cps) 1061290 Target Analyte Entecavir 635 MOL Target conc n Calc Conc n ImlIml1.00 Target conc Area (cps) 34100 10 639 0.150 Calc Conc n mL 0.189 Entecavir-13C2, 15N (Internal Standard) RT (Exp RT): Concentration: Sample Type: 1.00 ng/mL Entecavir (278.000/152.000 635(1.64) (Quality Contro ) Da) 1.639 (1.65) RT (Exp RT): 0.189 ng/m Calculated conc: 0.032 Quali Contro Area Ratio: Sam leT e: Sample Name Data File C02-I-O Injection Vial 58 G02.wiff ln•ection Volume 10 page Of 55 Created with Analyst Reporter NIDQC-BE-center ANALYST SAMPLE REPORT Sam le T e Ac uisition Date Unknown Acquisition Method ETV-Ver01-lnstrument.dam 6/712022 PM Analysis\2022 Entecavir 52BE Project 03 Result Table G02.rdb Instrument Code VKN,TDSH/53.05 Operator tdsh 53.05-cham MQL Al orithm Used Internal Standard Dilution Factor Weight to Volume 0.00 Instrument Name Sciex QTRAP 6500+ Area (cps) E-ntecavir-13CZ 15N m In 639 1356739 Target Analyte Area (cps) Entecavir nun Target conc n Calc Conc Imln Iml1.00 Target conc Calc Conc o 000 Entecavir-13C2, 15N (Internal Standard) RT (EXP RT): Concentration 639(1 64) 1.00 ng/mL Sample Type: (Unknown) Da) Entecavir (278000/152.000 RT (EXP RT): 000 (1 65) Calculated conc: N/A ng/ml Area Ratio: Sam leT e: 0.000 Unknown Sample Name Data File C02-1-0.17 Injection Vial 59 G02.wiff ln•ection Volume 10 Sam le T e Ac uisition Date Unknown Al orithm Used MQL 6/7,2022 PM Dilution Factor page Of 55 Created with Analyst Reporter NIDQC-BE-center ANALYST SAMPLE REPORT ETV-Ver01-lnstrument.dam Acquisition Method Analysis\2022 Entecavir 52BE Project 03 Result Table G02.rdb Instrument Code VKN,TDSH/53.05 Operator tdsh 53.05-cham Internal Standard E-ntecavir-13CZ 15N Weight to Volume 0.00 Instrument Name Sciex QTRAP 6500+ Area (cps) 1324752 Target Analyte Entecavir Area (cps) 1296296 m In 643 RT ml n 1.646 Target conc n Calc Conc Imln Iml1.00 Target conc N/A Calc Conc 5.731 Entecavnr-13C2 15N (Internal Standard) RT (EXP RT): Concentration 643(1 64) 1.00 ng/mL Sample Type: (Unknown) page Of 55 Created with Analyst Reporter NIDQC-BE-center ANALYST SAMPLE REPORT Sample Name Data File C02-1-0.5 Injection Vial 61 G02.wiff ln•ection Volume 10 Sam le T e Ac uisition Date Unknown Al orithm Used MQL 6/712022 8