Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỀ ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp dược thì lĩnh vực đánh giá kiểm tra chất lượng thuốc có một vai trò rất quan trọng Theo quan điểm sinh dược học đánh giá chấ[.]
ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày với phát triển ngành cơng nghiệp dược lĩnh vực đánh giá kiểm tra chất lượng thuốc có vai trị quan trọng Theo quan điểm sinh dược học đánh giá chất lượng thuốc không thông qua tiêu hố lý thơng thường định tính, định lượng, độ rã, độ hoà tan … quy định dược điển mà phải đánh giá sinh khả dụng (SKD)và tương đương sinh học (TĐSH) [6] Nghiên cứu đánh giá SKD TĐSH doanh nghiệp dược Việt Nam quan tâm vài năm gần Nhờ đó, nhà sản xuất lựa chọn cơng thức, kỹ thuật bào chế tối ưu để tạo sản phẩm có chất lượng tương đương với thuốc phát minh Đồng thời, nghiên cứu cung cấp thêm chứng chất lượng làm sở cho bác sỹ lựa chọn thuốc thay điều chỉnh liều thực hành lâm sàng Trên giới, nước có cơng nghiệp dược phát triển số nước khu vực qui định danh mục loại chế phẩm cần phải xem xét kết nghiên cứu SKD TĐSH cấp phép lưu hành thuốc [17,29] Hầu hết thuốc có khoảng điều trị hẹp, có dược động học bất thường, thuốc phóng thích chậm, thuốc tim mạch thuộc nhóm nằm danh mục bắt buộc phải nghiên cứu Trước xu hội nhập nhu cầu nâng cao chất lượng điều trị, Bộ Y tế ban hành thông tư 08/2010/TT-BYT, ngày 26/4/2010 việc Hướng dẫn báo cáo số liệu nghiên cứu sinh khả dụng/ tương đương sinh học đăng ký thuốc Tại thông tư này, Bộ Y tế đưa nguyên tắc lựa chọn dược chất đưa vào danh mục bắt buộc phải nghiên cứu SKD TĐSH gồm nhóm thuốc ưu tiên: thuốc tim mạch, chống co giật, kháng sinh… Đồng thời, thông tư qui định giới hạn với (1) thuốc generic dạng bào chế quy ước có chứa 12 dược chất danh mục (2) thuốc bào chế dạng phóng thích biến đổi Dilitiazem (DTZ) thuốc tim mạch có tác dụng chẹn kênh calci sử dụng rộng rãi điều trị dự phòng đau thắt ngực, loại -1- bệnh có tỷ lệ ngày tăng Việt Nam Trên thị trường hoạt chất bào chế dạng thuốc qui ước phóng thích biến đổi Một số doanh nghiệp dược nước nghiên cứu sản xuất dạng bào chế phóng thích biến đổi có chứa hoạt chất này, nhu cầu nghiên cứu SKD, TĐSH DTZ điều cần thiết xuất phát từ thực tế Để thực nghiên cứu đánh giá SKD TĐSH thuốc nói chung DTZ nói riêng, nội dung quan trọng xây dựng qui trình kỹ thuật chiết tách, xử lý mẫu phân tích định lượng thuốc dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu,…) Q trình phân tích thuốc dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn nồng độ thuốc mẫu thường thấp; mẫu có nhiều thành phần tạp chất gây ảnh hưởng tới q trình phân tích thuốc Hơn nữa, sau vào thể dược chất bị chuyển hoá tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau, có cấu trúc tính chất hố lý tương tự với dược chất nên việc phân tách để định lượng gặp nhiều khó khăn Chính vậy, phương pháp phân tích phải thẩm định chặt chẽ theo qui định riêng, để đảm bảo kết thử nghiệm xác tin cậy Hệ thống phân tích LC/MS/MS đời bước nhảy vọt kỹ thuật phân tích, tạo điều kiện cho nhà khoa học dược thực nghiên cứu sinh khả dụng phức tạp Với ưu điểm vượt trội độ nhạy tính đặc hiệu cao, kỹ thuật phân tích ngày áp dụng nhiều nghiên cứu chế phẩm có hàm lượng thấp Tuy nhiên, Việt Nam kỹ thuật mẻ khả ứng dụng cịn hạn chế Vì vậy, chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu phương pháp định lượng Diltiazem huyết tương người sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)” với mục tiêu sau: Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu định lượng DTZ huyết tương người LC-MS Thẩm định phương pháp phân tích xây dựng -2- PHẦN TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ DILTIAZEM 1.1.1 Đặc điểm cấu tạo tính chất hóa lý [24,28] a Cơng thức cấu tạo - Công thức phân tử: C22H26N2O4S HCl - Khối lượng phân tử: 450.98 g/mol - Tên khoa học: 1,5-Benzothiazepin-4(5H)-one,3-(acetyloxy)-5-[2- (dimethylamino)ethyl]-2,3-dihydro-2-(4-methoxyphenyl), monohydrochloride, b Tính chất vật lý, hóa học: - Bột kết tinh tinh thể nhỏ màu trắng, khơng mùi - Nhiệt độ nóng chảy: Từ 207,50 C đến 212,00 C - Hệ số phân bố: Log P(octanol/nước) = 2,79 - Dạng muối tan tốt nước, acid formic, it tan ethanol, không tan ether Dạng base tan tốt cloroform, ether Do chiết DTZ huyết tương phương pháp chiết lỏng – lỏng nên kiềm hóa -3- để chuyển sang dạng base chiết dung môi hữu không phân cực cloroform, diclormethan, diethyl ether, n-hexan… - Dạng dược dụng thường kết hợp với phân tử acid hydrocloric nên định lượng DTZ theo phương pháp chuẩn độ bạc nitrat - Phổ hấp thụ UV-Vis: Đỉnh hấp thụ dung dịch acid H 2SO4 0,2M 236 nm, dung dịch kiềm 237 nm Do với dạng nguyên liệu chế phẩm định lượng cách đo trực tiếp phổ hấp thụ UV HPLC với detector UV - Góc quay cực riêng: + 1100 đến + 1160+ 1.1.2 Tác dụng dược lý, dược động học: a Tác dụng dược lý [3,4,5,21] Diltiazem dẫn chất benzothiazepin có tác dụng chẹn kênh calci gây giãn động mạch vành mạch ngoại vi Ngồi cịn làm chậm dẫn truyền điện tử tim làm chậm nhịp tim, giảm co bóp tim làm chậm dẫn truyền nút nhĩ thất Thuốc sử dụng điều trị đau thắt ngực tăng huyết áp b Dược động học [16,23,25,26]: - Thuốc hấp thu nhanh theo đường tiêu hóa, khơng bị ảnh hưởng thức ăn Trong thực tế bệnh nhân thường khuyên dùng trước bữa ăn để tránh quên thuốc Thuốc bị chuyển hóa qua gan lần đầu, tạo thành nhiều chất chuyển hóa khác Tỷ lệ thuốc liên kết với protein cao (khoảng 80 - 85%) Vì dùng liều 60 mg DTZ, nồng độ thuốc huyết tương đạt cực đại khoảng 200 ng/ml Thể tích phân bố biểu kiến từ đến l/kg, đào thải chủ yếu qua phân, có khoảng – % đào thải dạng không biến đổi qua nước tiểu Thời gian bán thải khoảng - -4- - Sản phẩm chuyển hóa bao gồm: o Deacetyl diltiazem(1) o N mono demethyl diltiazem(2) o Deacetyl-N-monodemethyl diltiazem(3) o Deacetyl diltiazemN-oxid(4) o Deacetyl O-demethyl diltiazem(5) o Deacetyl N,O-didemethyl diltiazem(6) - Khi xây dựng phương pháp phân tích DTZ dịch sinh học phương pháp cần có giới hạn định lượng khoảng - 10 ng/ml (1/20 đến 1/30 Cmax) để đảm bảo AUCt > 80% AUC∞ c Chỉ định cách dùng [3,4,5] Liều thông thường: Uống 60 mg, lần ngày trước ăn Ðiều trị đau thắt ngực: Uống 60 mg diltiazem, lần ngày; khởi đầu liều 30 mg, lần ngày, tăng liều cần thiết khoảng - ngày sau Ðối với người bệnh bị đau thắt ngực khơng ổn định, dùng viên giải phóng chậm với liều từ 360 - 480 mg hàng ngày Ðiều trị tăng huyết áp: Dùng viên nén nang giải phóng chậm với liều ban đầu khoảng 60 - 120 mg, lần ngày; 14 ngày lần, tăng liều cần thiết tới liều tối đa ngày 360 mg d - Lưu ý khác dùng thuốc [21] Tác dụng phụ : Thuốc gây khó chịu nhiều số người bệnh Khoảng 30% người bệnh dùng thuốc ghi nhận gặp tác dụng không mong muốn liên quan đến khả gây giãn mạch diltiazem Những biểu hay gặp nhức đầu, buồn nơn, chóng mặt phù cổ chân -5- - Chống định: o Rối loạn hoạt động nút xoang, blốc nhĩ thất độ độ o Mẫn cảm với diltiazem o Suy thất trái kèm theo sung huyết phổi o Nhịp tim chậm 50 phút 1.1.3 Một số phương pháp định lượng DTZ dịch sinh học Đặc thù phân tích thuốc dịch sinh học phức tạp, lẫn nhiều tap chất, nồng độ hoạt chất thấp số lượng mẫu cần phân tích nhiều nên địi hỏi u cầu sau: - Tính đặc hiệu cao: phân biệt DTZ với tạp chất lẫn mẫu, đặc biệt chất chuyển hóa có cơng thức tương tự - Độ nhạy cao: nồng độ thuốc dịch sinh học thường thấp, địi hỏi phương pháp phải có độ nhạy cao Thời gian phân tích mẫu ngắn tốt: số lượng mẫu phân tích đánh giá TĐSH nhiều, thời gian phân tích kéo dài ảnh hưởng tới kết phân tích Một số phương pháp phân tích DTZ dịch sinh học tổng hợp bảng 1.1 : -6- Bảng 1.1: Một số phương pháp phân tích DTZ huyết tương Stt Tài liệu [12] [32] [9] Phương pháp Xử lý mẫu phân tích Kết tủa protein acetonitrile [18] Chiết pha rắn (SPE) 215 nm HPLC – UV Chiết pha rắn (SPE) 238 nm acetate Hiệu suất chiết 50.4-58.8% Chiết lỏng – lỏng hexane – [19] ESI HPLC – UV Chiết lỏng – lỏng ethyl LC – MS/MS chloroform - isopropanol (LC/MS/MS) ESI(+) HPLC - UV 239 nm (60:40:5) Thời gian phân tích mẫu (phút) LLOQ (ng/ml) 15 10 20 15 2,5 2 12 15 Kiềm hóa dung dịch KHCO3 0,01M, chiết [14] ethyl acetate Tiếp tục chiết HPLC - UV HCl 0,01 M đem bay dịng khí nitơ sau hịa tan cắn HCl 0.002 M Kiềm hóa amoni sulfat [13] chiết lỏng – lỏng methyl-terbutyl ether -7- HPLC - FL [22] [7] 10 [8] (LC/MS/MS) Chiết pha rắn (SPE) ESI(+) Kiềm hóa amoni sulfat HPLC – UV chiết ethyl acetate 254 nm Kiềm hóa chiết lỏng – lỏng HPLC – UV ter-butyl methyl ether 240 nm 14 10 15 Từ kết nghiên cứu định lượng DTZ huyết tương, thấy: - PP 1: Sử dụng detector khối phổ, PP có ưu điểm giới hạn định lượng đạt yêu cầu (1ng/ml) với kỹ thuật xử lý mẫu đơn giản tủa protein, đồng thời định lượng DTZ chất chuyển hóa Tuy nhiên hạn chế phương pháp thời gian phân tích mẫu dài (15 phút), nên không phù hợp để triển khai đánh giá SKD TĐSH - PP 2: Định lượng DTZ HPLC với detector UV bước sóng 215 nm, PP có ưu điểm thiết bị phổ biến áp dụng nhiều labo phân tích Tuy nhiên, nhược điểm thời gian phân tích mẫu dài (15 phút), giới hạn định lượng 20 ng/ml > 1/10 Cmax phương pháp xử lý mẫu chiết pha rắn với chi phí lớn khơng phù hợp để triển khai đánh giá SKD TĐSH - PP 3: Định lượng đồng thời DTZ chất chuyển hóa sử dụng detector UV bước sóng 238 nm, nhiên phương pháp xử lý mẫu chiết pha rắn tốn kém, thời gian phân tích mẫu lại dài (15 phút) - PP 4: Sử dụng detector khối phổ với kỹ thuật xử lý mẫu chiết lỏng – lỏng, giới hạn định lượng đạt yêu cầu thời gian phân tích ngắn Tuy -8- nhiên phương pháp có hiệu suất chiết thấp (50.4-58.8%) không ổn định - PP 5: Sử dụng detector UV bước sóng 239 nm phương pháp xử lý mẫu đơn giản chiết lỏng – lỏng, PP có giới hạn định lượng phù hợp (3 ng/ml) nhược điểm thời gian phân tích mẫu dài (12 phút) - PP 6: Sử dụng detector UV, PP định lượng đồng thời DTZ chất chuyển hóa nó, giới hạn định lượng phù hợp (3 ng/ml) thời gian phân tích mẫu dài (15 phút) phương pháp xử lý mẫu chiết lỏng – lỏng qua giai đoạn gây nhiều sai số - PP 7: Sử dụng detector huỳnh quang, PP có giới hạn định lượng phù hợp (2 ng/ml), thời gian phân tích mẫu khơng q dài (9 phút).Tuy nhiên DTZ không phát huỳnh quang trực tiếp nên phải thực phản ứng tạo dẫn chất phát huỳnh quang, điều tốn thời gian phức tạp dễ gây sai số - PP 8: Sử dụng detector khối phổ, PP định lượng đồng thời DTZ chất chuyển hóa, giới hạn định lượng thấp (1 ng/ml), thời gian phân tích mẫu khơng dài (3 phút) Tuy nhiên phương pháp xử lý mẫu chiết pha rắn tốn nên khó ứng dụng thực tế - PP 9: Sử dụng detector UV bước sóng 254 nm với phương pháp xử lý mẫu chiết lỏng – lỏng, nhược điểm PP giới hạn định lượng không phù hợp (10 ng/ml) thời gian phân tích mẫu dài (14 phút) - PP10: Sử dụng detector UV bước sóng 240 nm với phương pháp xử lý mẫu đơn giản chiết lỏng – lỏng, PP có giới hạn định lượng phù hợp (1 ng/ml) thời gian phân tích mẫu lại dài (15 phút) -9- 1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP LC/MS [10,11] 1.2.1 Khái niệm Sắc ký lỏng khối phổ kỹ thuật phân tích có kết hợp khả phân tách chất hỗn hợp phận sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography - HPLC) khả phân tích số khối (m/z) phận khối phổ (Mass spectrometry - MS) 1.2.2 Phân loại Dựa vào máy phân tích khối phổ (Mass analyser), hệ thống LC/MS có loại bản: - Tứ cực (Quadrupole): có tích điện đặt song song, đối có điện tích Các ion phù hợp với tần số quét thẳng tới detector, ion khác bị phá hủy bị va đập vào tứ cực - Bẫy ion (Ion trap): tất ion di chuyển theo hình xoắn ốc, tần số quét RF thay đổi lựa chọn ion phù hợp vào lỗ nhỏ (bẫy ion) - Ống đo thời gian bay (Time-of-flight tube): ion có số khối khác có thời gian bay khác nhau, ion phân tách theo thời gian bay Việc kết hợp hay nhiều loại với tạo thành hệ thống MS/MS như: triple-quadrupole tandem mass spectrometer, Q-Tof,… Hệ thống MS/MS phân tích ion phân mảnh, có ý nghĩa định danh chất để xác định cấu trúc nâng cao khả phân tích định tính, định lượng 1.2.3 Cấu tạo Thành phần hệ thống LC/MS (Hình 1.1) gồm: hệ thống HPLC, máy MS mặt phân giới ion hóa (trung gian gữa LC MS) - 10 - ... Diltiazem huyết tương người sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS)” với mục tiêu sau: Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu định lượng DTZ huyết tương người LC- MS Thẩm định phương pháp phân tích xây dựng -2-... nhiều nghiên cứu chế phẩm có hàm lượng thấp Tuy nhiên, Việt Nam kỹ thuật mẻ khả ứng dụng cịn hạn chế Vì vậy, tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu phương pháp định lượng Diltiazem huyết tương người sắc. .. Sắc ký lỏng khối phổ kỹ thuật phân tích có kết hợp khả phân tách chất hỗn hợp phận sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography - HPLC) khả phân tích số khối (m/z) phận khối phổ