Nghiên cứu phương pháp định lượng 1 deoxynojirimycin trong lá dâu, cao lá dâu và viên nang morussan bằng sắc ký lỏng khối phổ ( LC MS)

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO B ộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI DƯỢC HÀ NỘI • HỌC • • • ĐÀO THỊ THANH NHÀN NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 1-DEOXYNo JIRIMYCIN TRONG LÁ DÂU, CAO LÁ DÂU VÀ VIÊN NANG MORUSSAN BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHổ (LC/MS) LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC • • • • CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ Đ ộ c CHẨT MÃ SỐ: 607315 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Thái Duy Thìn Ths Trần Thị Bích Vân HÀ NỘI, 2010 m Lời cẵm n D ể hoồn thành luận văn tố t nghiệp thạc êỹ này, trước tiên xỉn bồỵ tỏ lòn 2, b iết ơn tới: PGƠ TÃ Thái Duy Thìn Thâ Trần Thị Bích Vân người đỗ hướng dẫn tận tỉnh suốt thời gian qua Tôi xin cỗm ơn sâu sắc Tô Trần Viột Hùng, người tận tâm giúp đ ỡ quổ trình tơi thực đ ề tồi Tơi xin gửi lời cẫm ơn tới DÔ Dương Minh Tân cốc cán b ộ phòng Vật lý đ o lường - Viện kiểm nghiệm Thuốc Trung ương tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ thời gian tơi làm thực nghiệm Phòng Tơi xin gửi tới toàn thổ giảng viên, cán b ộ Trường Đại học Dược Hồ Nội lời cam ơn chân thành dìu d ắ t tơi su ố t thời gian học tập Vồ cuối cùng, cho p h é p tơi hàỵ tỏ lòng b iết ơn tới b ố mẹ, gia đinh bạn b è người dành cho tỉnh thương yêu, quan tâm, động viên giúp đ ỡ chân tỉnh đ ổ tơi hồn thành tố t luận văn Hà nội, ngồỵ thống năm 2010 Đào Thị Thanh Nhàn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIế T TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT Vấ N Đ Ề CHƯƠNG TỒNG Q U A N 1.1 1- DEOXYNOJIRIMYCIN 1.1.1 Đặc điểm hóa l ý 1.1.2 Tác dụng dược lý 1.1.3 Các phương pháp định tính, định lượng l-deoxynojirimycin 1.2 LÁ D Â U .7 1.1.1 Thu hái chế biến dâu 1.1.2 Thành phân hóa học d â u 1.2.3 Công dụng d â u 1.3 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 13 1.3.1 Vài nét sơ lược sắc ký lỏng khối p h ố .13 1.3.2 Thiết bị sắc ký lỏng khối p h ổ 14 1.3.2.1 Pha đ ộ n g 14 1.3.2.2 Hệ thống b m 15 1.3.2.3 Hệ tiêm mẫu 15 1.3.2.4 Cột tách pha tĩnh 15 1.3.2.5 Detector khối p h ổ 15 1.3.3 Một số kỹ thuật LC/M S 21 1.3.3.1 Kỹ thuật phân tích tồn thang (Full scan) 21 1.3.3.2 Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (Selected Ion Monitoring) 21 1.3.3.3 Kỳ thuật MS/MS 21 1.3.3.4 Kỹ thuật SRM (Selected Reaction M onitoring) 21 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 22 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN c ứ u 22 2.1.1 Hóa chất 22 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 22 2.2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 23 2.2.1 Đối tượng nghiên u 23 2.2.2 Nội dung phương pháp nghiên c ứ u 24 2.2.2.1 Xử lý m ẫ u 24 2.22.2 Xây dựng chương trình sắc ký L C /M S 26 2.2.2.3 Thâm định phương pháp phân tích xây dựng 27 2.2.2.4 Định tính định lượng 29 2.2.2.5 Tính tốn kết xử lý số liệ u 29 CHƯƠNG KẾT QUẢ TH ựC N G H IỆM .31 3.1 KHẢO SÁT Đi ề u k i ệ n s ắ C KÝ LỎNG KHỐI PHổ 31 3.1.1 Xác định điều kiện khối phổ 31 3.1.2 Thiết lập chương trình LC /M S 33 3.1.2.1 Điều kiện sắc k ý .33 3.1.2.2 Điều kiện khối p h ổ 33 3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐÃ XÂY D ự N G 36 3.2.1 Độ tuyến tín h 36 3.2.2 Độ lặp lạ i 37 3.2.3 Độ đ ú n g 37 3.2.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng 38 3.3 KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG 1-DNJ TRONG LÁ DÂu ,DỊCH CHIẾT CAO LÁ DÂU, CAO LÁ DÂU VÀ VIÊN NANG MORUSSAN 39 CHƯƠNG BÀN L U Ậ N 47 4.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u 47 4.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 48 4.2.1 Xử lý m ẫu 48 4.2.2 Phương pháp nghiên cứu 48 4.3 KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u 49 Kế T LUẬN VÀ KIẾN N G H Ị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ACN : Acetonitril AF : Acid formic APCI : Atmospheric pressure chemical ionization (Ion hóa bang hóa học áp suất thường) API : Atmospheric pressure ionization (lon hóa áp suất thường) APPI : Atmospheric pressure photo Ionization (Ion hóa quang học áp suất thường) DCLD : Dịch chiết dâu DNJ : Deoxynoijirimyicn ĐTĐ : Đái tháo đường ED50 : Effective dose (Liều tác dụng tối đa lên 50% đối tượng thử) ELSD : Evaporative Light Scattering Detector (Bộ phận phát tán xạ ánh sáng bay hơi) ESI : Electron spray isonization (Nguồn ion hóa phun điện tử) FT-ICR : Fourier transform ion cyclotron resonance (Phân tích cộng hưởng ion) GC/MS : Gas Chromatography - Mass spectrometry (Sac ký khí ghép khoi phổ) HDL : High density Lipoprotein (Lipoprotein tỉ trọng cao) HILIC : Hydrophylic interactive Chromatography (Sac kv tương tác thân nước) HPAEC : High performance anion exchange Chromatography (Sac ký trao đổi anion hiệu cao) HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sac ký lỏng hiệu cao) IC50 : Inhibit concentration (Nồng độ ức che tối thiêu 50% đối tượng thử) LC/MS : Liquid chromatography - Mass spectrometry (Sac ký lỏng ghép khối phố) LDL : Low density Lipoprotein (Lipoprotein tỉ trọng thấp) LOD : Limit o f detection (Giới hạn phát hiện) LOQ : Limit of quantitive (Giới hạn định lượng) MALDI : Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (Ion hóa theo chế giải hấp phụ sử dụng nguồn laser) NMR : Nuclear magnetic resonance (Phô cộng hưởng từ hạt nhân) PAD : Pulsed amperometric detection (Detector đo xung ampe) QIT : Quadrupole ion Trap (Phân tích bẫy ion) SKLM : Sắc ký lóp mỏng SRM : Selected Reaction Monitoring (Chọn lọc ion sau phản ứng) STZ : Streptozotocin TC : Total cholesterol (Cholesterol toàn phần) TIC : Total ion chormatogram (Sac đồ toàn ion) TG : Triglycerid TOF : Time of flight (Phân tích thời gian bay) TEN BANG STT BẢNG Bảng 2.1 Cách pha dãy dung dịch chuân Bảng 3.2 Các thông sô khôi phô dùng đê xác định 1-DNJ Bảng 3.3 Kêt khảo sát khoảng tuyên tính 1-DNJ Bảng 3.4 Kêt khảo sát độ lặp lại phương pháp Bảng 3.5 Kêt khảo sát độ phương pháp Bảng 3.6 Kết định lượng 1-DNJ mẫu thử STT HINH Hình 1.1 Cây dâu tằm Morns aỉba Hình 1.2 Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng khối phố Hình 1.3 Các phận detector khối phổ Hình 1.4 Mơ hình ngun lý kỹ thuật APCI Hình 1.5 Mơ hình ngun lý kỹ thuật ESI Hình 1.6 Mơ hình ngun lý kỹ thuật APPI Hình 1.7 Mơ hình nguyên lý kỹ thuật MALDI Hình 1.8 Bộ phân tích tứ cực đơn (quadrupole) Hình 1.9 Bộ phân tích bây ion QIT (quadrupole ion trap) 10 Hình 1.10 Bộ phân tích thời gian bay TOF (top of flight) 11 Hình 1.11 Bộ phân tích cộng hưởng ion (FT-ICR) 12 Hình 2.12 Bộ phân tích từ 13 Hình 2.13 Bộ phân tích ba tứ cực (triple quadrupole) TEN HINH Máy săc ký lỏng khơi phơ 14 Hình 2.14 Thermo Finnigan LCQ advantage Max 15 Hình 2.15 Sản phâm viên nang Morussan công ty Vimedimex Hàm lượng 1-DNJ bột dâu 0,823 mg/g (tương ứng với 0,823mg/L) Hàm lượng 1-DNJ hai mẫu viên nang Morussan (lô 221208 lô 030409) lần lưọt 1,390 mg/viên 1,272 mg/viên Hàm lượng 1-DNJ bốn mẫu cao dâu 3,912 mg/g; 4,583 mg/g; 6,782 mg/g 2,544 mg/g Hàm lượng 1-DNJ dịch chiết cồn 50% 80,60^ig/ml dịch chiết cồn 70% 2,26 |ig/ml CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u Ngày nay, với phát triển khoa học cơng nghệ, ngày có nhiều dược chất tân dược nghiên cứu tống họp đáp ứng nhu cầu dự phòng điều trị bệnh Tuy nhiên, dược chất tổng họp thường gây nhiều tác dụng phụ cho người sử dụng, đồng thời giá thành cao gây khó khăn cho trình điều trị bệnh, đặc biệt với người có thu nhập thâp Những năm gần đây, sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh có nguồn gốc tự nhiên có xu hướng phát triển tăng cao hiệu tốt, an tồn sử dụng chi phí thấp thuốc tân dược Các sản phâm có chứa dâu dùng dự phòng hỗ trợ điều trị bệnh ĐTĐ nhiều quốc gia giới (trong có Việt Nam) nghiên cứu sản xuất Trong dâu có chứa 1-DNJ - hoạt chất phát - có tác dụng hạ đường huyết hạn chế rối loạn lipid máu đối tượng ĐTĐ Hiệu việc dự phòng hỗ trợ điều trị bệnh ĐTĐ sản phấm có chứa dâu phụ thuộc lớn vào hàm lượng 1-DNJ có đơn vị bào chế sản phẩm Tuy nhiên, việc kiểm soát hàm lượng dược chất sản phâm chứa dâu nói riêng việc kiếm sốt hàm lượng dược chất có sản phâm có ngn gốc tự nhiên nói chung khó khăn, gây ảnh hưởng đến công tác q u ả n lý c h ấ t l ợ n g , h i ệ u q u ả đ i ề u t r ị b ệ n h v t o đ ợ c n i ề m t i n c ủ a n g i sử dụng Bởi vậy, tiến hành nghiên cứu phương pháp định lượng 1DNJ dâu, cao dâu viên nang Morussan chứa dâu hỗ trợ điêu trị ĐTĐ nhằm bước đầu xây dựng phương pháp chung đế định lượng hoạt chất sản phẩm có chứa dâu góp phần dự thảo tiêu chuẩn cho viên nang Morussan 4.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 4.2.1 Xử lý mẫu 1-DNJ có tính thân nước nên có thê dùng dung mơi methanol 70% hòa tan hồn tồn hoạt chất Với mẫu thử, dùng methanol 70% làm dung môi, lắc siêu âm lọc qua màng lọc 0,45ịim đem phân tích 4.2.2 Phương pháp nghiên cửu Phương pháp LC/MS phương pháp đại, có thê dùng đê định tính, định lượng hoạt chất cách nhanh chóng, xác Phương pháp có the áp dụng việc định tính, định lượng hoạt chất khơng có liên kết đơi phân tử (nên không thê dùng detector u v đế phát hiện), hàm lượng hoạt chât mẫu thấp khó có thê phát định lượng phương pháp bình thường khác, hay mẫu chứa nhiều thành phần phức tạp cộng với hàm lượng hoạt chất cần định lượng mẫu thấp sản phâm có nguồn gốc tự nhiên Chương trình LC/MS mà chúng tơi xây dựng để định tính định lượng 1-DNJ mẫu thử cho độ lặp lại độ tốt Kết LOD LOQ 1-DNJ chuân cho thấy phương pháp có độ nhạy cao với chất cần phân tích Tuy nhiên, kỹ thuật phức tạp trang thiết bị đắt tiền nên sở có thê sử dụng phương pháp kiếm nghiệm Vậy nên, với mẫu thông thường, nên áp dụng kỹ thuật phân tích đơn giản đế định tính định lượng hoạt chất mẫu dùng HPLC detector tán xạ bay hơi, HPLC detector huỳnh quang Với hoạt chất có liên kết đơi phân tử có thê dùng phương pháp HPLC detector uv 4.3 KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u Áp dụng phương pháp LC/MS phân tích mẫu thử Hàm lượng 1DNJ mẫu thử xác định với độ xác cao, độ lặp lại tốt Giới hạn phát 1-DNJ chuẩn theo phương pháp 0,01 ng/ml, th ấ p h n lầ n so g iớ i h n p h t h iệ n LOD = 0,053 |Lig/ml tro n g n g h iê n c ú n định lượng 1-DNJ LC/MS Dai KJ cộng (Trung quốc) tiến hành[18] Điều chứng tỏ phương pháp chúng tơi xây dựng có độ nhạy cao so với phương pháp mà Dai JK đồng nghiệp đưa Những kết thu chúng tỏ rằng, phương pháp LC/MS xây dựng hồn tồn áp dụng để định tính, định lượng 1-DNJ mẫu dâu, cao dâu viên nang Morussan Phương pháp áp dụng đê kiêm tra chất lượng sản phâm cao dâu, chế phẩm chứa dâu điêu trị ĐTĐ nhập khâu từ nước KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ KÉT LUẬN Sau hoàn thành đề tài này, thực mục tiêu đề với kết cụ sau : Xây dựng hoàn chỉnh phương pháp định tính định lượng 1-DNJ dâu, cao dâu viên nang Morussan Quy trình thực sau: o Xử lý mẫu: lựa chọn dung môi methanol 70% hòa tan tốt thành phân có dâu, cao dâu viên nang Morussan o Xây dựng chương trình LC/MS: ■ Điều kiện sắc ký khối phơ chương trình LC/MS ■ Đánh giá phù họp hệ thống ■ Đánh giá phương pháp xây dựng thơng qua khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, xác định LOD LOQ 1-DNJ Phương pháp phân tích có độ nhạy cao, có tính đặc hiệu, thời gian phân tích ngắn, phân tích xác đối tượng cần phân tích Đã áp dụng qui trình phân tích để định tính định lượng 1-DNJ dâu, cao dâu, viên nang chứa dâu, cho kết có độ lặp lại tốt o Ket định lượng mẫu thử thể bảng 3.7 LOD LOQ 1-DNJ chuẩn 0,01fj.g/ml 0,033jug/ml o Định tính: 1-DNJ có thời gian lưu khoảng 5,5 phút, phổ MS lần cho mảnh mẹ có m/z 164, phổ MS2 1-DNJ cho mảnh m/z 146 KIẾN NGHỊ Áp dụng phương pháp xây dựng để kiểm nghiệm hoạt chất 1-DNJ dâu đê kiêm soát nguồn nguyên liệu đầu vào sản xuất, cao dâu để kiểm tra bán thành phấm trình sản xuất thành phẩm quy trình sản xuất viên nang Morussan nhằm góp phần nâng cao chất lượng, hiệu điều trị sản phấm Tiếp tục áp dụng phương pháp LC/MS xây dựng để định lượng 1DNJ mẫu dâu tằm Morus alba thu hái vùng trồng khác nhau, mùa khác nhau, độ già khác nhau, vị trí khác thân dâu tằm nhằm tìm loại dâu thu hái vào mùa nào, vùng miền cho hàm lượng 1-DNJ cao nhất, loại non hay già cho hàm lượng 1-DNJ cao Từ cung cấp thơng tin hữu ích đê nhà sản xuất tạo sản phẩm chứa dâu có hàm lượng 1-DNJ tối ưu Ap dụng phương pháp đã xây dựng đê định tính, định lượng 1-DNJ lồi dâu khác ngồi M om s alba, đê tìm xem lồi dâu khác ngồi dâu tằm ứng dụng sản xuất thuốc dự phòng điều trị ĐTĐ hay không Áp dụng phương pháp xây dựng đế định tính, định lượng 1-DNJ nguyên liệu dâu nhập khấu, sản phẩm cao dâu thuốc chứa dâu điều trị ĐTĐ nhập Nghiên cứu phương pháp định tính, định lượng 1-DNJ huyết tương, mô nhằm đánh giá hiệu điều trị sản phấm chứa dâu điều trị ĐTĐ Đưa dự thảo Tiêu chuẩn sở cho viên nang Morussan trang bên DỤ THẢO TIÊU CHUẨN c o SỎ CHO VIÊN NANG MORƯSSAN TIÊU CHUẨN CO SỞ CONG TY CO PHAN Y D Ư Ợ C PHẨM Số TC: Viên nang Morussan Có hiệu lực từ: VIMEDIMEX YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1 Công thức cho viên nang Cao dâu 200mg Lactose vừa đủ viên 1.2 Nguyên liệu Cao dâu đạt TCCS Lactose đạt tiêu chuẩn DĐVN III 1.3 Chất lượng thành phẩm 1.3.1 Hình thức Viên nang cứng, đồng đều, bên chứa thuốc màu nâu đen 1.3.2 Độ rã Viên nang có độ rã khơng q 30 phút 1.3.3 Độ đồng khắỉ lượng Khối lượng trung bình thuốc nang ±7,5% 1.3.4 Định tính Phải the phép thử định tính l-deoxynoijirimycin 1.3.5 Định lượng Hàm lượng l-deoxynojirimycin mồi viên nang khơng lmg, tính theo khối lượng thuốc trung bình nang 1.3.6 Độ nhiễm khuẩn Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 10.7, mức PHƯONG PHÁP THỬ 2.1 Hình thức: thử cảm quan chế phẩm phải đạt-các yêu cầu nêu 2.2 Độ rã: thử theo DĐVN IV, phụ lục 8.6 2.3 Độ đồng khối lượng: theo DĐVN IV, phụ lục 8.3 2.4 Định tính: Trong phần định lượng, sắc đồ dung dịch thử phải cho píc có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu sắc đồ dung dịch 1deoxynojirimycin chuân cho mảnh khối đặc trưng m/z 164 ± 2.5 Định lượng Sử dụng phương pháp LC/MS với chương trình cụ thể sau: 2.5.1 Điều kiện sắc kýr o Cột: sử dụng cột Agilent C18 (150cm X 4,6mm, 5|im) o Pha động: acetonìtrỉl —acid form ic 0,1% (80 : 20) o Tốc độ dòng: 0,2ml/phút o Thể tích tiêm mẫu: 25|iL o Thời gian phân tích: 10 phút 2.5.2 Điêu kiện khôi phô: o Nguồn ion hóa + ESỈ 4,5kV o Nhiệt độ mao quản truyền ion: 350 °c o Khí mang: 20 Arb o Khí bổ trợ: Arb o Chế độ chọn lọc SIM m/z 164 2.5.3 Chuẩn bị mẫu chuân Pha dung dịch chuẩn 1-DNJ 2,5 |ig/ml, lọc qua màng lọc milipore 0,45|j,m 2.5.4 Chuản bị mâu thừ Lấy 20 viên nang, cân xác tính khổi lượng trung bình thuốc nang, trộn đều, nghiền mịn làm đồng bột thuốc nang Cân xác lượng thuốc tương ứng viên bình định mức 50ml thêm 30ml dung dịch methanol 70% (TT), siêu âm 15 phút, thêm methanol 70% (TT) vừa đủ Lọc qua giấy lọc thường, hút lml dịch lọc bình định mức 10ml, thêm pha động vừa đủ, lọc qua màng 0,45 jjm Chất chuẩn 1-DNJ Thuốc thử methanol 70% 2.5.5 Kết qủa Tính hàm lượng l-deoxynojirimycin viên dựa vào diện tích píc thử chuấn, lượng cân mẫu thử mẫu chuân, hàm lượng chuẩn khối lượng trung bình thuốc nang 2.6 Đơ nhiễm khuẩn Thử theo DĐVN IV Phụ lục 10.7 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ môn Dược học cô truyền (2002), Dược học cô truyền, Trường Đại học dược Hà Nội, Nhà xuất Y học, tr 182 Bộ mơn Hố phân tích (2006), Hố phân tích II, Trường Đại Học Dược Hà Nội, tr 107-124, tr 326-333 Bộ mơn Hóa phân tích, (2004), Kiêm nghiệm thuốc, Trường Đại học dược Hà nội, tr 83-102 Bộ Y tế, Viện Kiểm Nghiệm thuốc TW (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc sô phương pháp kiêm nghiệm thuốc, Tài liệu đào tạo, tr 107-119 Nguyễn Minh Đức (2006), sắc ký lỏng hiệu cao số úng dụng vào nghiên cún, kiêm nghiệm dược phâm, dược liệu hợp chất tự nhiên, Nhà xuất y học chi nhánh Thành phố Hồ Chí Minh (tr 49-126) Phạm Gia Huệ, Nguyễn Tiến Khanh (1990), Một sơ phương pháp phân tích hóa lý phân tích dược, Nhà xuất Đà Nang, tr I.2-I.3 Lê Ngọc Liễn, Phạm Thiện Ngọc (2005), Chiết xuất, xác định hàm lượng polyphenol đánh giả tác dụng chống oxy hóa mẫu bột chiết lả dâu, Tạp chí nghiên cứu y học số 38, tr 34-39 Đồ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất y học, tr 720 - 723 Phạm Thiện Ngọc, Lê Thị Thúy (2005), Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyêt bột chỉêt dâu chuột nhăt trăng gây đái tháo đường thực nghiệm, Tạp chí nghiên cứu y học số 39, tr 20-25 10.Chu Phạm Ngọc Sơn (2006), Kỹ thuật HPLC/MS ứng dụng, Sở khoa học công nghệ môi trường TP.HCM l.Lê Thị Thúy, Phạm Thiện Ngọc, Nguyễn Quang Trung (2006), Chiết xuất sơ đánh giả tác dụng hạ glucose huyết bột chiết dâu, Y học Việt nam tập 320, số 3, tr 46-51 72 Nguyễn Quang Trung, Phạm Thiện Ngọc (2006), Nghiên cứu tác dụng hạn chế rối ỉoạn ỉipid máu bột chiêt ỉá dâu chuột nhẳt trắng, Tạp chí nghiên cứu y học số 45, tr 1-7 TÀI LIỆU TIÉNG ANH 13.Andallu B, Suryakantham V, Lakshmi Srikanthi B, Reddy GK (2001), Effect o f mulberry (Moms indica L.) therapy on plasma and erythrocyte membrane lipids in patients with type diabetes, Clinica Chimica Acta, 314, pp 47-53 14 Anna Przyborowska (2002), “Introduction to Liquid Chromatography/ Mas Spectrometry/ Mass spectrometry (LC-MS/MS) ”, School MS Facility H&LS /5.Bharani SE, Asad M, Dhamanigi s s , Chandrakala GK (2010), Immunomodulatory activity o f methanolic extract o f Morns alba Linn, (mulberry) leaves, Pak Journal of Pharmaceutical Science, 23(1), pp 63-68 16-Bondada Andallu, Varadacharyulu (2003), Antioxidant role o f mulberry (Morns indica L.cv Anantha) leaves in streptozotocin- diabetic rats, Clinica Chimica Acta, Volume 338, issue 1-2, Pp.3-10 17 Chen F, Nakashima N, Kinaura M, Hypoglycemic activity and mechanisms o f extracts from Mulberry leaves (Folium Mori) and Cortex Mori Radicis in streptozocin- Induced diabetic mice, Department of Chemical Pharmacology, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Toyama Medical Pharmaceutical univ, Toyama, pp 930-931 18.Dai KJ, Hou LB, Luo QZ, Quantitative determination o f 1- deoxynojirimycin in mulberry leaves by high-performance liquid chromatographic-tandem mass/mass spectrometry, Zhong Yao Cai 32(3), pp 375-377 19 E Bramer (1998), An introduction to Mass Spectromytry, pp 4-23 20.Flanagan JJ, Rossi B, Tang K, Wu X, Mascioli K, Donaudy F, Tuzzi MR, Fontana F, Cubellis MV, Porto c , Benjamin E, Lockhart DJ, Valenzano KJ, Andria G, Parenti G, Do HV (2009), The pharmacological chaperone 1deoxynojirimycin increases the activity and lysosomal trafficking o f multiple mutant form s o f acid alpha-glucosidase, Human Mutation,30(12), pp 1683-1692 1.Gow Chin Jen, She Ching Wu, Pin Der Du (1996), Extraction and indentification o f the antioxidant components from leaves o f M om s (Morus alba L), Journal of Agricultural and Food Chemistry 1996, 44, pp 16871690 22.Kayo Dol, Takashi Kojima, Yasuo Fujimoto (2000), Mulberry lea f extract inhibits the oxidative modification o f rabbit and human low density lipoprotein, Biology Pharmaceutical Bui 23 (9), pp 106-1071 23.Kazuhisa Yatsunami, Masatoshi Ichida and Satoshi Onodera (2007), The relationship between 1-deoxynojirimycin content and a-glucosidase inhibitory activity in leaves o f 276 mulberry cultivars ( Morus spp.) in Kyoto, Japan , Journal of Natural Medicines, pp 1340-3443 24.Kimura T, Nakagawa K, Kubota H, Kojima Y, Goto Y, Yamagishi K, Oita s, Oikawa s, Miyazawa T, (2007), Food-grade mulberry powder enriched with l-deoxynojirimycin suppresses the elevation o f postprandial blood glucose in humans, Journal of Agricultural and Food Chemistry , pp 58695874 25.Kiyotaka Nakagawa, Hiroyuki Kubota, Toshiyuki Kimura, Shinji Yamashita, Tsuyoshi Tsuzuki, Shinichi Oikawa Teruo Miyazawa (2007), Occurrence o f orally administered mulberry! 1-deoxynojirimycin in rat plasm a, Journal of Agricultural and Food Chemistry 55, pp 8928-8933 26.Kojima Y, Kimura T, Nakagawa K, Asai A, Hasumi K, Oikawa s, Miyazawa T (2010), Effects o f m ulbeny lea f extract rich in 1deoxynojirimycin on blood lipid proflies in humans, Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition, pp 155-161 Michael Lincheid and David G Westmoreland (1994), Application o f liquid chromatography-Mass spectrometry, Pure and Applied Chemistry, Vol 6, No 9, pp 1913-1930 28.Miyahara c , Miyazawa M, Satoh s, Sakai A, Mizusaki s (2004), Inhibitory effects o f mulberry lea f extract on postprandial hyperglycemia in normal rats, Journal of Nutriotion and Science Vitaminol (Tokyo) 50(3), pp 161164 29.Nakagawa K, Kubota H, Tsuzuki T, Kariya J, Kimura T, Oikawa s, Miyazawa T (2008), Validation o f an ion trap tandem mass spectrometric analysis o f mulberry 1-deoxynojirimycin in human plasma: application to pharmacokinetic studies, Bioscience Biotechnology and Biochemistry., 72(8), pp 2210-2213 30.Naowaboot J, Pannangpetch p, Kukongviriyapan V, Kukongviriyapan u , Nakmareong s, Itharat A (2009), Mulberry lea f extract restores arterial pressure in streptozotocin-indiiced chronic diabetic rats, Nutr Res 2009 Aug;29(8), pp 602-608 31.Nitra Nuengchamnong, Komkanok Ingkaninan, Wiroje Kaewruang, Sathapom (2007), Quantitative determination o f 1-deoxynojirimycin in mulberry leaves using liquid chromatography—tandem mass spectrometry, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Volume 44, Issue 4, pp 853-858 32.0uyang Zhen, Li Yong-hui, Xu Wei-dong, Chen Jun (2005), Determination o f l-deoxynojirimycin in leaves o f Morns alba by high performance liquid chromatography with fluorescence detection, China journal of Chinese materia medica, Vol 30 (issue ), pp 682-685 iJ.Tadashi Yoshihashi, Huong Thi Thu Do, Patchare Tungtrakul, Sumitra Boonbumrung, Kohji Yamaki (2010), Simple, Selective, and Rapid Quantification o f 1-Deoxynojirimycin in Mulberry L ea f Products by HighPerformance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection, Journal o f Food Science, Volume 75 Issue 3, Pp C246 - C250 J^.Taniguchi s., N Asano, F Tomino and I Miwa (1998), Potentiation o f glucose - induced insulin secretion by fagomin, a pseudo-sugar isolated from mulberry leaves, Horm Metab Res.30, Pp 679-683 35 Toshiyuki Kimura, Kiyotaka Nakagawa, Yuko Saito, Kenji Yamagishi, Masahiro Suzuki, Kohji Yamaki, Hiroshi Shinmoto, Teruo Miyazawa (2004), Simple and rapid determination o f l-Deoxynojirimvcin in mulberry leaves, BioFactors 22 (2004), pp 341- 345 36.Xie H, Wu F, Yang Y, Liu J (2008), Determination o f 1-deoxynojirimycin in Morns alba L leaves using reversed-phase high performance liquid chromatography fluorescence detection with pre-column derivatization, Se Pu., 26(5), pp 634-636 W EBSITE 37.http://pioneerherb.en.alibaba.com/product/250475106209451004/ l_Deoxynoj irimycin.html http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB9128150 39.http://www.tocris.com/dispprod.php7ItemIcN2080 40.http://www.vi wikipedia.org ... đề Nghiên cứu phương pháp định lượng l -deoxynojirimycin dâu, cao dâu viên nang Morussan sắc ký lỏng khối phổ (LC/ MS) với mục tiêu sau: Xây dựng phương pháp định tính, định lượng - D N J băng LC/ MS... ĐTĐ 1. 3 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ [2]’[3]' t4M5M6Ui0],[i4],[i9].[27] 1. 3 .1 Vài nét sơ lược sắc ký lỏng khối phổ Sắc kí lỏng khối phổ LC/ MS kỹ thuật phân tích chất dựa kết hợp sắc ký lỏng. .. .7 1. 1 .1 Thu hái chế biến dâu 1. 1.2 Thành phân hóa học d â u 1. 2.3 Công dụng d â u 1. 3 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 13 1. 3 .1 Vài nét sơ lược sắc ký lỏng khối