Nghiên cứu phương pháp định lượng rotundin trong viên bao sen vông r

Hình Nội dung Trang Hình 3.1 Sắc ký đồ triển khai với hệ 1 của dung dịch Rotundin Hình 3.5 Bản mỏng với các mẫu thử được xử lý khác nhau chụp Hình 3.6 Sắc ký đồ HPTLC của các mẫu trong

Võ thị quế

Nghiên cứu phương pháp định lượng

Luận văn thạc sĩ dược học Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất

Mã số: 60.73.15

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.Thái Nguyễn Hùng Thu

Hà Nội - 2008

Trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự chỉ bảo tận tình của các thầy cô, sự quan tâm của gia đình và bạn bè Những sự giúp

đỡ quý báu ấy đã giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận này, đồng thời cũng cho tôi hiểu biết thêm nhiều điều về tư duy trong công việc và ứng xử trong cuộc sống

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành

tới PGS TS Thái Nguyễn Hùng Thu người thầy đã giành nhiều thời gian, công

sức tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Các thầy cô giáo, anh chị em

kỹ thuật viên Bộ môn Hoá phân tích, Phòng Thí nghiệm Trung tâm, các đồng nghiệp và lãnh đạo của Công ty Cổ phần Dược phẩm Trung ương II đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khoá luận này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã

động viên, khích lệ tôi rất nhiều để tôi có thêm sự nhiệt tình và say mê trong nghiên cứu khoa học

Mục Lục

Đặt vấn đề 01

ChươngI - Tổng quan 02

1.1 RoTUNDIN 02

1.1.1.Công thức cấu tạo, một số tính chất và tác dụng dược lý 02

1.1.1 Các phương pháp định tính 03

1.1.2 Các phương pháp định lượng 03

1.2 Viên Sen Vông – R 06

1.2.1.Thành phần và tác dụng của viên Sen vông – R 06

1.2.2 Thành phần và tác dụng của lá Sen 06

1.2.3 Thành phần và tác dụng của lá Vông 07

1.3 Sắc ký lớp mỏng 08

1.3.1 Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng 09

1.3.2 Hệ số di chuyển RR f R 10

1.3.3 Pha tĩnh - Chất hấp phụ 11

1.3.4 Pha động 11

1.3.5 Kỹ thuật tiến hành sắc ký lớp mỏng 12

1.3.6 ứng dụng của sắc ký lớp mỏng trong phân tích kiểm nghiệm 15

1.3.7 Các chú ý khi chuẩn bị bản mỏng cho định lượng 18

1.3.8 Các biện pháp xử lý vết trên bản mỏng trong định lượng 19

1.4 Sơ lược về sắc ký lỏng hiệu năng cao 21

Chương II - Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng nhanh bằng SKLM và so sánh với HPTLC 23

2.2.2 áp dụng các phương pháp đã xác định được trên một số mẫu viên Sen vông – R 24

2.2.3 So sánh một số phương pháp định lượng Rotundin trong viên Sen vông – R 24

2.3 Điều kiện nghiên cứu 24

2.3.1 Máy móc và dụng cụ thí nghiệm 24

2.3.2 Hoá chất 25

2.4 Xử lý kết quả 25

Chương III- Kết quả Thực nghiệm và Bàn luận 26

3.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký 26

3.1.1 Bản mỏng 26

3.1.2 Chọn hệ dung môi khai triển 26

3.1.3 Khảo sát cách đưa mẫu lên bản mỏng 30

3.1.4 Hiện màu các vết trên bản mỏng 30

3.2 Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 31

3.2.1 Khảo sát chọn dung môi xử lý mẫu 31

3.2.2 Kiểm tra tính chọn lọc của phương pháp 34

3.2.3 Chuẩn bị mẫu 35

3.3 Xử lý bản mỏng trên HPTLC 36

3.4 Khảo sát khả năng định lượng bằng SKLM phối hợp với máy quét văn phòng và xử lý ảnh 37

3.4.1 Lý do phối hợp 37

3.4.2 Quét ảnh bản mỏng và xử lý vết trên ảnh thu được 37

3.4.3 Khảo sát sự tương quan giữa các kích thước vết và nồng độ mẫu 40

3.4.4 Khảo sát độ lặp lại của phương pháp 43

3.4.5 Khảo sát độ đúng của phương pháp 44

3.4.6 ứng dụng phương pháp định lượng bằng SKLM để định lượng chế phẩm 45

3.5 So sánh một số phương pháp định lượng Rotundin trong viên nén Sen vông – R 47

3.5.1 Định lượng Rotundin trong viên nén Sen vông – R bằng HPLC 47

3.5.2 So sánh một số phương pháp định lượng Rotundin trong viên Sen vông – R 51

3.6 Bàn Luận 54

3.6.1 Sự cần thiết phải có phương pháp định lượng nhanh trong sản xuất 54

3.6.2 Về cách pha mẫu 55

3.6.3 Về chọn lựa tương quan diện tích vết và nồng độ mẫu 55

3.6.4 Về cách thu hình ảnh bản mỏng 55

3.6.5 So sánh kết quả của phương pháp HPTLC, HPLC và đo bạc 57

3.6.6 ý nghĩa của đề tài 58

Chương IV-Kết luận 59

4.1.Kết luận 59

4.2 KIến nghị 60

Tài liệu tham khảo 61

ch÷ viÕt t¾t ý nghÜa

1 CCD camera (Charge – coupled device

camera)

HÖ thèng camera kÕt hîp

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát một số hệ dung môi khai triển 29

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tương quan giữa diện tích vết với nồng

Bảng 3.3 Tương quan giữa chiều cao pic trong HPTLC với nồng

So sánh việc xử lý ảnh trong SKLM với kết hợp xử lý

ảnh dùng máy ảnh kỹ thuật số, máy quét và trong HPTLC

56

Hình Nội dung Trang

Hình 3.1 Sắc ký đồ triển khai với hệ 1 của dung dịch Rotundin

Hình 3.5 Bản mỏng với các mẫu thử được xử lý khác nhau chụp

Hình 3.6 Sắc ký đồ HPTLC của các mẫu trong cồn 34 Hình 3.7 Bản mỏng với mẫu thử có thêm và không thêm palmatin 35 Hình 3.8 Chọn công cụ điều chỉnh độ sáng và độ tương phản 38 Hình 3.9 Chỉnh độ sáng và độ tương phản để có được vết rõ hơn 38

Hình3.10 Chọn công cụ Measure Tool từ thanh công cụ của

Hình 3.11 Chọn công cụ Color Range… từ menu select của

Hình 3.12 Chọn mầu khoanh vùng trong hộp thoại Color Range 39

Hình 3.13 Xác định kích thước các vết sau khi sử dụng Color

Hình 3.15 Đường chuẩn Rotundin trong sắc ký lớp mỏng kết hợp 43

Hình 3.17 Sắc ký đồ mẫu thử được pha trong methanol 48 Hình 3.18 Sắc ký đồ mẫu thử được pha trong pha động 49 Hình 3.19 Sắc ký đồ mẫu thử được chiết bằng chloroform 49 Hình 3.20 Sắc ký đồ của dung dịch mẫu chuẩn Rotundin 51 Hình 3.21 Sắc ký đồ mẫu thử Rotundin trong viên Sen vông - R 51

Hình 3.22

Phổ hấp thụ UV-VIS của mẫu Rotundin chuẩn và thử

Đặt vấn đề

Rotundin (L- tetrahydropalmatin) là một alcaloid chiết từ củ bình vôi có tác dụng an thần gây ngủ, giảm đau Hiện nay trên thị trường có nhiều chế phẩm chứa duy nhất một thành phần Rotundin với các hàm lượng khác nhau dùng làm thuốc ngủ Phương pháp định lượng Rotundin trong chế phẩm được quy định trong một số dược điển có thể là: phương pháp đo quang [4], [30],

phương pháp kết tủa với AgNOR 3 R[29], [30] Một số phương pháp khác như:

định lượng trong môi trường khan [30], bằng HPLC [10]R Rcũng được nghiên cứu ứng dụng

Để tăng tác dụng an thần gây ngủ, viên bao Sen vông- R của Công ty

Cổ phần dược phẩm Trung ương II sản xuất phối hợp Rotundin với cao lá sen

và cao lá vông Vì vậy trong thành phần có thêm nhiều alcaloid khác, việc định lượng bằng các phương pháp trên không tránh khỏi sai số

Theo tiêu chuẩn cơ sở [999], Rotundin trong viên Sen vông – R được

định lượng bằng phương pháp kết tủa với AgNOR 3 R ViệcR Ráp dụng phương pháp này cho kết quả có sai số lớn và đặc biệt mất nhiều thời gian không phù hợp với yêu cầu kiểm tra bán thành phẩm trong quá trình sản xuất Do vậy, đòi hỏi phải có một phương pháp định lượng nhanh hơn, phù hợp với điều kiện cơ sở Xuất phát từ yêu cầu đó chúng tôi thực hiện đề tài "Xây dựng phương pháp

định lượng Rotundin trong viên bao Sen vông- R" với 3 mục tiêu:

1 Xây dựng phương pháp định lượng nhanh Rotundin trong bán thành phẩm viên Sen vông-R bằng sắc ký lớp mỏng

2 áp dụng phương pháp xây dựng để định lượng Rotundin trong chế phẩm Sen vông-R và so sánh kết quả với phương pháp HPTLC

3 So sánh một số phương pháp có thể định lượng được Rotundin trong chế phẩm Sen vông – R

ChươngI

Tổng quan

1.1 RoTUNDIN:

1.1.1 Công thức cấu tạo, một số tính chất và tác dụng dược lý:

1.1.1.1 Biệt dược: Rotunda , stilux, Roxen

1.1.1.2 Tên khoa học: L- Tetrahydropalmatin

1.1.1.3 Công thức phân tử:

N

OCH3OCH3

Rotundin dạng base là tinh thể trắng hay hơi vàng, không mùi, không

vị Bị chuyển thành màu vàng khi tiếp xúc với ánh sáng hoặc nhiệt Tan trong cloroform, tan ít hơn trong ethanol và ether, không tan trong nước, tan rất tốt trong acid sulfuric loãng

0

P tính theo chất khan, xác định trên dung dịch 8mg/ml trong ethanol 95P

- Rotundin rất ít độc: Tiêm vào mạch máu thỏ với liều cao hơn 30mg/kg thể trọng, thỏ chỉ mệt 1-2 ngày, đồng tử chỉ bị liệt nhất thời rồi lại hết

- Tác dụng trấn kinh rõ rệt trên nhu động vị tràng Trên mẩu ruột lấy riêng,

nó gây hiện tượng giảm nhu động rõ rệt mà vẫn duy trì sự co bóp điều hoà và kéo dài Có thể dùng chữa những trường hợp tăng nhu động và ống tiêu hoá bị giật

- Có tác dụng điều hoà đối với tim và bổ tim nhẹ

- Có tác dụng an thần, gây ngủ và chống co quắp, hạ huyết áp

- Ngoài ra còn có tác dụng điều hoà hô hấp có thể dùng chữa hen hay chữa nấc [7], [14]

1.1.3 Các phương pháp định lượng:

1.1.3.1 Phương pháp kết tủa với AgNOR3 R: [9], [29], [30]

Tiến hành: Trong một bình định mức 50mL, hoà tan một lượng chế phẩm khoảng 0,3g Rotundin trong 2mL acid acetic, thêm 15mL nước cất, đun nóng nhẹ cho tan hết, trộn đều Thêm chính xác 25,0 mL dung dịch kali iodid 1,7%, pha loãng với nước cất đến vạch, lọc qua giấy lọc thô, hút chính xác 25

ml trộn thêm 3-5 giọt chỉ thị natri eosinat, chuẩn độ bằng dung dịch AgNOR 3 R

0,05M cho đến khi xuất hiện tủa mầu hồng Song song tiến hành chuẩn độ một mẫu trắng

1mL dung dịch AgNOR 3 R 0,05M tương ứng với 17,77mg CR 21 RHR 25 RNOR 4

Phương pháp này được Dược điển Trung Quốc năm 2000 áp dụng để định lượng Rotundin nguyên liệu Tiêu chuẩn cơ sở của viên bao Sen vông - R cũng

dùng phương pháp này để định lượng Rotundin nhưng trước đó phải chiết riêng Rotundin ra khỏi các chất khác, đòi hỏi phải tốn rất nhiều thời gian và công sức Cụ thể như sau:

Tiến hành theo tiêu chuẩn cơ sở: cân chính xác một lượng bột viên tương

đương với 20 viên Sen vông – R vào một cốc có mỏ khô sạch Thấm ướt với

cloroform Khuâý kỹ, để lắng, lọc dịch chiết qua giấy lọc khô (đã tráng với cloroform) vào cốc thuỷ tinh sạch Chiết tiếp với 20ml, 20ml, 10ml, 10ml cloroform đến hết Rotundin trong cắn còn lại Dùng cloroform để tráng phễu

và giấy lọc, tập chung dịch tráng vào với dịch lọc và làm bay hơi trên cách thuỷ đến khô Lấy 3 ml cloroform tráng thành cốc thuỷ tinh, tiếp tục làm bay hơi dung môi, cuối cùng dùng quả bóp làm cho khô kiệt Hoà tan cắn trong 2

ml dung dịch acid acetic 36 – 37%, để nóng trên nồi cách thuỷ (70P

0

P -80P

0

PC)

và khuấy kỹ bằng đũa thuỷ tinh Thêm 10 ml nước, khuấy đều trong khi vẫn

để cách thuỷ nóng Lấy ra, ngâm trong nước lạnh để cho lớp váng nổi trên bề mặt đặc lại dính vào thành cốc Gạn phần dung dịch vào bình định mức 50 ml, tráng cốc và phễu lọc với 3 ml nước Tiếp theo tiến hành giống như dược điển Trung Quốc qui định, bắt đầu từ thêm chính xác 25ml dung dịch kali iodid

1.1.3.2 Phương pháp chuẩn độ môi trường khan: [30]

Chuẩn độ môi trường khan là phương pháp chuẩn độ các acid và base yếu hoặc những muối của chúng trong môi trường không phải là nước Rotundin là một base yếu, nên Dược điển Trung Quốc năm 2000 đã áp dụng phương pháp này để định lượng Rotundin hydroclorid nguyên liệu

Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,35g Rotundin hydroclorid chế

phẩm, thêm 25mL acid acetic khan, 2mL anhydrid acetic và 5mL dung dịch thủy ngân (II) acetat, lắc cho tan hết, thêm 1 giọt dung dịch tím tinh thể làm chỉ thị và chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1M cho đến khi dung dịch chuyển sang mầu xanh lục Song song tiến hành chuẩn độ một mẫu trắng

1mL dung dịch acid percloric 0,1M tương đương với 39,19mg

CR 21 RHR 25 RNOR 4 R.HCl

1.1.3.3 Phương pháp đo quang phổ tử ngoại khả kiến: [4] [11] [29] [30]

Phương pháp này dựa trên định luật Lambert - Beer

Cách tiến hành: Hoà tan một lượng chế phẩm Rotundin với nồng độ

khoảng 0,003% trong dung dịch acid sulfuric 0,5% Rồi đo độ hấp thụ của dung dịch thu được ở bước sóng 281 nm, mẫu trắng là acid sulfuric 0,5% Tính hàm lượng Rotundin trong chế phẩm theo trị số A (1%,1cm) ở bước sóng cực đại 281 nm là 155

Dược điển Trung Quốc áp dụng phương pháp này để định lượng Rotundin trong các chế phẩm viên nén và thuốc tiêm

1.1.3.4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng:

Đưa dung dịch chuẩn Rotundin và dung dịch thử lên cùng một bản mỏng Tiến hành triển khai bằng dung môi thích hợp để tách Rotundin ra khỏi các alcaloid khác Phun thuốc thử hiện mầu hay soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm để xác định vết Rotundin trong dung dịch thử tương ứng với vết Rotundin của dung dịch chuẩn

Xử lý bản mỏng để xác định hàm lượng Rotundin trong vết dựa trên các vết của dung dịch chuẩn. [13]

* Chuẩn bị mẫu: pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử có nồng độ tương

đương khoảng 0,04 mg Rotundin khan trong 1mL pha động

Thời gian lưu của Rotundin là 4,32 phút So sánh diện tích của pic Rotundin chuẩn với diện tích của mẫu thử từ đó tính ra kết quả

1.2.Viên sen vông- R:

1.2.1 Thành phần và tác dụng của viên Sen vông - R:

Sen vông - R là một trong những mặt hàng truyền thống của Công ty cổ

phần Dược phẩm Trung Ương II đã được sản xuất trong nước và xuất khẩu Sen vông - R có tác dụng an thần, gây ngủ và có thành phần bao gồm: cao lá sen, cao lá vông và Rotundin 0,015g

1.2.2 Thành phần và tác dụng của lá Sen:

Từ trước đến nay, người ta chỉ chú ý đến tác dụng an thần của hạt sen

và tâm sen, ít người lại nghĩ rằng lá sen lại có nhiều tác dụng quí để chữa bệnh Về hoá học, lá sen chứa 0,2 – 0,3% tannin, 0,77 – 0,84% alcaloid toàn phần trong đó có tới 15 alcaloid Alcaloid chính là nuciferin 0,15%, ngoài ra còn có nor - nuciferin, roemetin (alcaloid A), pro – nuciferin, anonain, liriodenin, amepavin, N – nor – armepavin, methyl – corlaurin, nepherin, dehydroemetin, dehydronuciferin, dehydroanonain, N – methyllisocourlaurin và một số chất như vitamin C, acid citric, tatric, succinic, quercetin, isoquercitrin, nelumbosid, leucocyanidin, leuco – delphinidin Tỷ lệ hoạt chất có trong lá sen bánh tẻ cao hơn trong lá non và lá già [1], [4], [15], [14], [21]

Lá sen được dùng sắc uống chữa mất ngủ với liều 15 – 20g/ngày Lá sen kết hợp với một số vị dược liệu khác có tác dụng an thần [1], [7], [14], [15]

1.2.3 Thành phần và tác dụng của lá Vông:

Lá vông còn có tên khác Vông nem (vì lá được dùng để gói nem), Hải

đồng, Thích đồng… Tên khoa học là Erythrina orientalis (L.) Murr Họ đậu

1.3 Sắc ký lớp mỏng:

Trong các sắc ký, kỹ thuật sắc ký trên lớp mỏng là phương pháp ít đòi hỏi thiết bị phức tạp nhất và cách tiến hành cũng thuộc loại đơn giản nhất Nhờ có nhiều ưu điểm trong khả năng tách các hỗn hợp phức tạp bao gồm nhiều cấu

tử khác nhau mà sắc ký lớp mỏng ngày càng được sử dụng rộng rãi Có thể kể

ra các lợi thế của sắc ký lớp mỏng là:

- Yêu cầu trang thiết bị cần thiết đơn giản

- Cho kết quả nhanh, rất thuận tiện cho theo dõi phản ứng, dự đoán nhanh các chất Thời gian thực hiện ngắn hơn so với sắc ký cột và sắc ký giấy

- Khá kinh tế nên rất hiệu quả trong thăm dò kết quả của nhiều quá trình khác nhau

- Vết nhỏ và gọn hơn vết của sắc ký giấy

- Trong nhiều trường hợp tác dụng phân tách được rõ rệt hơn các phương pháp sắc ký giấy

- Có giới hạn tách các chất mạnh hơn sắc ký giấy nhiều lần

- Có thể dùng được các thuốc thử mạnh

ứng dụng chủ yếu của SKLM là định tính và thử độ tinh khiết Cùng với

sự phát triển của kỹ thuật xử lý hình ảnh bản mỏng và tiêu chuẩn hoá bản mỏng ngày nay SKLM đang dần tham gia vào việc bán định lượng và định lượng các chất trong hỗn hợp.[17]

1.3.1 Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng:

Cũng như tất cả các phương pháp sắc ký khác, quá trình tách hỗn hợp các chất bằng SKLM xẩy ra khi cho pha động chuyển động qua pha tĩnh Trong SKLM, pha tĩnh được rải thành lớp mỏng trên một giá đỡ phẳng Dưới tác dụng của lực mao quản, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua điểm xuất phát

- nơi hỗn hợp chất cần phân tích đã được đưa lên bản mỏng Trong quá trình

di chuyển của pha động qua lớp mỏng chất hấp phụ (pha tĩnh), nhờ các quá trình hấp phụ và giải hấp phụ được lặp đi lặp lại và do hệ số phân bố khác nhau mà những chất khác nhau di chuyển theo hướng chuyển động của pha

động với các tốc độ khác nhau Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp phân tích

Trong mỗi quá trình sắc ký có một cơ chế chủ yếu nhưng đồng thời có thể xẩy ra các cơ chế khác [14], [17]

1.3.2 Hệ số di chuyển RRfR:

Trong SKLM, đại lượng đặc trưng

quan trọng về mức độ tách là hệ số di

chuyển RR f R RR f R là tỉ số giữa đoạn

đường mà chất tan đi được (z) và

đoạn đường mà dung môi đi được (l):

l

z

R f = Đoạn đường chất tan đi được là

khoảng cách từ tuyến xuất phát đến

tâm của vết sắc ký Còn đoạn đường

dung môi (chất lý tưởng không bị hấp

phụ) đi được là khoảng cách từ tuyến

xuất phát đến tuyến dung môi RR f R

Như vậy đại lượng RR f R chỉ có giá trị từ 0 đến 1 Nếu RR f R= 0 có nghĩa là chất tan hoàn toàn không di chuyển, nằm nguyên tại điểm xuất phát Nếu RR f R

= 1 nghĩa là chất tan di chuyển cùng tốc độ với dung môi hay là không bị chất hấp phụ hấp phụ

Có rất nhiều yếu ảnh hưởng đến RR f R đó là:

- Chất lượng và hoạt tính của chất hấp phụ

- Bề dầy của lớp mỏng

- Tính chất, thành phần và độ tinh khiết của pha động

- độ bão hoà dung môi trong bình sắc ký

- Phương pháp khai triển sắc ký

- Tốc độ di chuyển của pha động

- đoạn đường pha động đi được

- Vị trí đưa chất tan lên bản mỏng

- Lượng mẫu đưa lên bản mỏng

- ảnh hưởng của các chất tan khác, chất tạo phức, pH, nhiệt độ, độ chính xác của phép đo khoảng cách [6], [20].

1.3.3 Pha tĩnh-Chất hấp phụ:

Trong SKLM người ta sử dụng nhiều loại chất hấp phụ khác nhau Các chất hấp phụ được sử dụng phổ biến là silicagel, nhôm oxid, kieselgur, cellulose, nhựa trao đổi ion Ngoài ra người ta còn dùng các chất hấp phụ biến tính là các chất hấp phụ thông thường nhưng được tẩm các chất lỏng hữu cơ như các amin cao phân tử, acid diethylhexyl phosphoric, tributyl -phosphat Cơ chế tách của các chất hấp phụ trên rất khác nhau một số dựa trên khả năng hấp phụ là chủ yếu số khác lại có tính trao đổi ion là chủ yếu

Các chất hấp phụ pha đảo trong SKLM cũng được điều chế chủ yếu từ silicagel Nguyên liệu thường được dùng là loại silicagel có kích thước lỗ cỡ 6nm Những nhóm chức hữu cơ liên kết thường được dùng là methyl (RP-2), octyl (RP-8), dodecyl (RP-12), octadecyl (RP-18) Đặc tính kỵ nước của những nhóm alkyl này giảm từ RP-18 đến RP-2

1.3.4 Pha động:

Trong sắc ký hấp phụ việc chọn đúng dung môi ý nghĩa rất quan trọng Khi chọn dung môi phải chú ý đến các yếu tố sau:

- phải hoà tan tương đối tốt tất cả các cấu tử cần phân tích

- bị hấp phụ tối thiểu trên pha tĩnh (chất hấp phụ)

- khả năng xẩy ra phản ứng hoá học với chất tan cũng như chất hấp phụ

- độ bay hơi, sự phân lớp khi dùng hỗn hợp dung môi

- sự tinh khiết của dung môi nhất là các dung môi không phân cực phải không được chứa các dung môi phân cực, đặc biệt là nước

Để nhanh chóng chọn dung môi có thể dựa vào dãy elutrop của Trappe

Đây là dãy các dung môi sắp xếp theo thứ tự giảm khả năng giải hấp phụ đối với các chất bị hấp phụ trên các chất hấp phụ phân cực Trừ một số trường hợp ngoại lệ, khả năng giải hấp phụ của các dung môi phụ thuộc vào hằng số điện môi của chúng Đối với chất hấp phụ không phân cực khả năng giải hấp phụ

theo thứ tự ngược lại Với SKLM, để chọn dung môi cho pha động thường phải tiến hành thí nghiệm thăm dò và điều chỉnh

Quan hệ giữa pha tĩnh, pha động và hỗn hợp tách:

Một qui tắc được rút ra trên cơ sở lý thuyết và thực nghiệm để chọn gần

đúng chất hấp phụ (pha tĩnh) và dung môi khai triển (pha động) khi tiến hành tách các hỗn hợp các chất có độ phân cực khác nhau bằng SKLM Qui tắc đó

được gọi là qui tắc tam giác: Quay tam giác ở tâm sao cho một đỉnh chỉ vào một yếu tố đã biết thì 2 đỉnh còn lại sẽ chỉ vào 2 yếu tố còn lại

I

II III

IV V

Phân cực (ưa nước)

Không phân cực (ưa dầu)

Độ phân cực của dung môi

Không phân cực (ưa dầu)

Phân cực (ưa nước)

Hỗn hợp tách

Hoạt tính hấp phụ

(Silicagel G Nhôm oxid G)

Qui tắc này áp dụng khá tốt với các hợp chất hữu cơ khi sử dụng các chất hấp phụ phổ biến là silicagel G và nhôm oxid G [20]

1.3.5 Kỹ thuật tiến hành sắc ký lớp mỏng:

Có thể chia quá trình SKLM thành các giai đoạn: chuẩn bị bản mỏng,

đưa mẫu lên bản mỏng, khai triển bản mỏng với pha động thích hợp và xử lý bản mỏng để thu kết quả

1.3.5.1 Chuẩn bị bản mỏng:

Hiện nay các bản mỏng thường được các hãng tráng sẵn và bán dưới các dạng chất hấp phụ khác nhau và có thể tẩm chất phát huỳnh quang hay không Việc dùng các bản tráng sẵn khá phổ biến hiện nay vì hiệu lực tách của các bản tráng sẵn thường rất cao so với bản tự tráng hơn nữa do kinh tế phát triển nên kinh phí cho học tập và nghiên cứu có phần nới rộng tạo điều kiện cho

việc áp dụng những thành tựu của công nghệ thuận lợi hơn Tuy nhiên trong một số trường hợp người dùng vẫn có thể phải tự tráng lấy bản mỏng đáp ứng cho yêu cầu riêng của họ

Hoạt hoá bản mỏng: Các bản mỏng tráng sẵn hay tự tráng trước khi sử

dụng phải được hoạt hoá Thông thường các bản mỏng được hoạt hoá trong khoảng 30 phút ở 110P

o

P

C

Những tấm đã có hoạt năng sẽ mất hoạt năng của nó khi để ở không khí

ẩm, cho nên ta nên bảo quản nó trong bình hút ẩm có silicagel, canxi clorid khan Chú ý khi để bản mỏng là kính nóng vào bình hút ẩm phải mở khoá đến nguội mới đóng khoá lại

1.3.5.2 Đưa mẫu lên bản mỏng:

 Lượng và thể tích mẫu:

Lượng hỗn hợp chất đưa lên bản có ý nghĩa quan trọng đối với kết quả tách sắc ký, đặc biệt là ảnh hưởng đến giá trị RR f R Lượng chất quá lớn làm cho vết chất sắc ký lớn và thường kéo dài Việc kéo đuôi làm cho các vết có RR f Rbị chồng chập nên không tách được khỏi nhau Lượng chất quá nhỏ có thể không phát hiện được vết trên sắc đồ Nói chung lượng mẫu đưa lên bản mỏng khoảng 0,1-50àg, trong SKLM điều chế lượng chất có thể lên đến 10-50mg Tuỳ theo kiểu đưa mẫu lên bản mỏng mà thể tích mẫu cũng khác nhau Trường hợp mẫu đưa dưới dạng điểm thể tích mẫu khoảng 1-5 àl, còn trường hợp đưa mẫu lên bản dưới dạng vạch (chấm này cạnh chấm kia) là khoảng 0,1- 0,2mL

Trường hợp mẫu quá loãng cần làm giàu mẫu phân tích trước khi chấm hay chấm mẫu nhiều lần kết hợp với chờ khô hay sấy nhẹ giữa các lần chấm

 Vị trí đưa mẫu lên bản mỏng:

Tuyến xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng và mép của dung môi pha động đủ lớn để tốc độ di chuyển của dung môi khi bắt đầu đến điểm đưa mẫu lên bản mỏng đã khá ổn định Tốt nhất là cách mép dưới của bản 1,5cm

và cách mép dung môi từ 0,8-1,0cm

Nếu mẫu đưa lên bản dưới dạng nhiều chấm thì các điểm chấm phải cách nhau và cách mép bản mỏng đủ xa để tránh hiệu ứng bờ Khoảng cách này tốt

nhất là 1 cm

Các khoảng cách trên là áp dụng với bản mỏng tự tráng còn đối với bản mỏng tráng sẵn với bề dầy lớp mỏng có độ đồng đều cao và số đĩa lý thuyết lớn, chúng có thể được thu hẹp hơn nhằm tiết kiệm hơn về bản mỏng mà vẫn

đạt được yêu cầu

Một vấn đề cần được lưu ý là kích thước các vết chấm phải bằng nhau vì kích thước của vết chấm sẽ ảnh hưởng đến diện tích vết và do đó làm sai lệch kết quả phân tích Do vậy số lần chấm và thể tích mỗi lần chấm phải như nhau giữa các mẫu chuẩn và mẫu thử

1.3.5.3 Khai triển sắc đồ và các kỹ thuật khai triển:

Quá trình cho pha động di chuyển qua pha tĩnh để tách hỗn hợp phân tích thành các cấu tử nằm ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng được gọi là khai triển sắc đồ Tuỳ theo hướng chuyển động của pha động mà có thể có các cách khai triển khác nhau Ngoài kiểu sắc ký đi lên ra còn có các kiểu sắc ký khác như: sắc ký đi xuống, sắc ký liên tục, sắc ký lặp, sắc ký đa bậc, sắc ký hai chiều, sắc ký tròn, sắc ký hình quạt Mathias, sắc ký gradien

1.3.5.4 Hiện sắc đồ:

Không phải tất cả các vết tách ra từ hỗn hợp mẫu phân tích đều có mầu nên sau khi khai triển có thể chưa có ngay sắc đồ Đối với những chất được sắc ký không màu hay màu rất nhạt thì sau khi khai triển cần phải hiện sắc đồ bằng phương pháp hoá học hay quang học, đôi khi bằng phóng xạ với các đông vị phóng xạ

 Hiện sắc đồ bằng phương pháp hoá học:

Đây là phương pháp phổ biến nhất Sắc đồ có thể được hiện lên sau phun lên bản mỏng một hoặc một vài thuốc thử có khả năng tạo màu đặc trưng với chất cần tách Các dung dịch này được gọi là dung dịch hiện màu Sắc đồ có thể hiện lên ngay sau khi phun hay sau khi sấy nóng ở 80-100P

o

P

C

Các thuốc thử phun của sắc ký giấy đều có thể áp dụng cho lớp mỏng

được Với SKLM còn có thể sử dụng thêm các thuốc thử mạnh như acid sulfuric đặc, acid sulfo-cromic, hỗn hợp acid sulfuric và nitric hoặc hơ kính

ở nhiệt độ cao để làm cháy các hợp chất hữu cơ Nếu ta thêm vào acid sulfuric 0,5% một aldehyd như là: p-dimetylaminobenzaldehyd, vanilin, anisaldehyd,

aldehyd salixylic, furfuron hay aldehyd formic ta sẽ được những chất màu

đậm Khi sấy giữa 100-300P

o

P

C ta còn thấy rõ những chất khác

Một số chất hữu cơ có thể hiện màu bằng thuốc phun có iod Dung dịch phun iod: phun trên lớp mỏng dung dịch iod 0,5% trong cloroform

Một thuốc thử chung cho các chất hữu cơ là dung dịch kali - permanganat trong acid sulfuric đặc Cần chú ý chỉ pha chế lượng ít thuốc thử vì aldehyd permanganic hợp thành có thể nổ khi bị phân huỷ Những vết sẽ hiện màu trắng trên nền hồng

Nhiều trường hợp có thể hiện màu bằng hơi iod bằng cách cho vào bình kín

có iod, sau 15-20 phút lấy bản mỏng ra để bay hơi hết iod trong không khí Cũng có trường hợp người ta hiện màu bằng cách nhúng (hay tẩm) bản mỏng bằng acid sulfuric đặc theo hướng vuông góc với chiều khai triển

1.3.6 ứng dụng của sắc ký lớp mỏng trong phân tích kiểm nghiệm: [33]

Định tính và thử tinh khiết là ứng dụng phổ biến và chủ yếu của SKLM Ngày nay với các tiến bộ của kỹ thuật và thiết bị xử lý bản mỏng sau khai triển và các phương tiện lượng hoá lượng mẫu đưa lên bản mỏng định lượng ngày càng được áp dụng một cách phổ biến hơn

1.3.6.1 Phân tích định tính:

Để nhận biết các chất trên sắc đồ có thể bằng 2 cách: nhận biết theo màu sắc đặc trưng của các vết trên sắc đồ và dựa vào giá trị RR f R

 Nhận biết theo màu đặc trưng của vết sắc ký:

Trong trường hợp này không cần thật sự quan tâm đến giá trị RR f R mà chỉ cần biết thứ tự chuyển động của các vết trong hỗn hợp Phương pháp này

thường áp dụng cho các chất vô cơ vì giá trị RR f R của chúng rất không ổn định, hơn nữa có nhiều thuốc thử thích hợp để tạo ra các màu đặc trưng với các ion vô cơ khác nhau

 Dựa vào giá trị RRfR:

Mỗi chất trong một hệ sắc ký nhất định có một giá trị RR f R đặc trưng Nhưng giá trị Rf phụ thuộc rất nhiều yếu tố: chất hấp phụ (loại, hoạt tính, bề dày ), pha động (thành phần, độ tinh khiết, tốc độ di chuyển ), độ bão hoà dung môi trong bình, chiều dài khai triển, nhiệt độ, lượng mẫu, pH và các chất lạ, cách xác định tâm (với các vết không cân xứng) độ chính xác của phép đo độ dài

Do vậy trong định tính việc so sánh với chất chuẩn là cần thiết

Hiện nay SKLM có thể kết hợp với các trang thiết bị hiện đại giúp cho việc xác định các chất được chính xác hơn Ví dụ như kết hợp HPTLC với FTIR hay HPTLC-MS

Một ứng dụng rất hay gặp khác của SKLM là để nhận biết sơ bộ thành phần của hỗn hợp phản ứng, các phân đoạn của chiết suất hay các phân đoạn của sắc ký cột

1.3.6.3 Định lượng:

Bằng các biện pháp chính xác hoá lượng mẫu đưa lên bản mỏng có thể áp dụng SKLM để định lượng Lượng chất tham gia quá trình tách được xác định với các cấp độ chính xác khác nhau tuỳ theo phương tiện sử dụng để đưa mẫu lên bản mỏng

Sau khi khai triển bằng hệ dung môi thích hợp các vết của các chất khác nhau được tách riêng rẽ trên bản mỏng Có một số biện pháp khác nhau để xác

định lượng chất trong các vết và có thể chia chúng thành 2 nhóm: tách chất khỏi bản mỏng và định lượng trực tiếp trên sắc đồ

UV/VIS IR Máy quét

CCD camera

Khai triển

 Phương pháp định lượng sau khi tách các chất khỏi bản mỏng:

Phương pháp này tiến hành chuyển tất cả vết cần phân tích trên bản mỏng vào một dung môi thích hợp Sau khi thực hiện tinh khiết hoá mẫu đo bằng các cách khác nhau, tiến hành thực hiện các phép đo thích hợp như đo quang,

đo huỳnh quang, cực phổ

Để lấy chất khỏi lớp mỏng dùng dao sắc cạo tất cả bột ở vết vào bình hoặc dùng phễu con có màng xốp úp ngược và hút chân không vào cuống phễu Sau

đó dùng dung môi hoà tan chất và lọc bỏ chất hấp phụ Xử lý và định lượng dịch lọc bằng các phương pháp thích hợp

Phương pháp này cho kết quả đáng tin cậy nhưng khá mất thời gian Ngoài những sai số có thể mắc phải trong quá trình sắc ký, phương pháp này có thể gặp thêm một số trở ngại và sai số sau:

- Độ tinh khiết của chất hấp phụ: ảnh hưởng của các tạp chất trong chất hấp phụ và chất kết dính (nếu có), đặc biệt là sắt phải không có hoặc được làm sạch trước khi tiến hành sắc ký

- Độ tinh khiết của dung môi: phải đuổi hết dung môi sau khi khai triển, dung môi hoà tan chất phải không ảnh hưởng đến phép đo tiếp theo

- Không chuyển hết chất trên bản mỏng vào dung dịch

 Các phương pháp định lượng trực tiếp trên bản mỏng:

Các phương pháp thuộc nhóm này dựa trên nguyên tắc xác định lượng chất

có trong vết dựa vào diện tích hay cường độ màu của vết Trường hợp không

có điều kiện và chấp nhận sai số lớn có thể so sánh trực tiếp bằng mắt về độ lớn và màu sắc của các vết Hiện nay có rất nhiều phương tiện có thể hỗ trợ cho việc tiến hành định lượng trên bản mỏng như: máy đo mật độ vết (densitometer), các hệ thống video (CCD camera: charge-coupled device camera), máy quét (flatbed scanner)

1.3.7 Các chú ý khi chuẩn bị bản mỏng cho định lượng:

Để có thể hạn chế tối đa các sai số khi chuẩn bị bản mỏng cho định lượng cần thực hiện đúng các qui tắc sau đây:

- Các dung dịch chuẩn và dung dịch thử phải được chuẩn bị như nhau: trong cùng một loại dung môi, các yếu tố ảnh hưởng khác

- Mẫu thử và mẫu chuẩn phải được đưa lên bản mỏng ở các vị trí cạnh nhau

- Nồng độ mẫu thử và dung dịch chuẩn phải gần nhau

- Nếu xây dựng dẫy chuẩn thì mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất phải ở mức có thể phát hiện vết trên sắc đồ, mẫu có nồng độ lớn nhất gấp 5-10 lần mẫu thấp nhất

- Số lần chấm và thể tích chấm các dung dịch chuẩn và dung dịch thử phải như nhau

- Đoạn đường di chuyển của chất chuẩn và chất thử phải như nhau nên việc bão hoà dung môi rất quan trọng

- Chọn dung môi triển khai sao cho các vết lận cận không chồng chập

 Đo diện tích vết:

 Quan hệ diện tích vết và lượng chất trong vết:

Việc đo diện tích vết sẽ khách quan hơn nhiều so với phương pháp so bằng mắt Sai số cũng nhỏ hơn khoảng 5 -10% và có thể đạt đến 3% Diện tích của vết phụ thuộc vào lượng chất, bề dày và hoạt tính của lớp mỏng, thể tích dung dịch mẫu được đưa lên bản mỏng, kích thước của điểm xuất phát cũng như vị trí của nó trên bản mỏng

Trong khoảng lượng chất từ 1 đến 100àg, giữa diện tích của vết S và

logarit của lượng chất M có quan hệ tuyến tính: S = a.lgM + b với a, b là

các hằng số thực nghiệm

Theo Kurt Randerath cho rằng căn bậc hai của diện tích vết có quan hệ tuyến tính với logarit khối lượng chất trong một phạm vi khá rộng về nồng độ theo công thức:

D A A

A A M

=

trong đó:

M và A là lượng chất và diện tích vết của dung dịch thử

M R S R và A R S R là lượng chất và diện tích vết của dung dịch chuẩn

A R D R là diện tích vết của dung dịch mẫu pha loãng D lần

 Một số biện pháp xác định diện tích vết cổ điển:

Diện tích của các vết có thể được xác định bằng nhiều cách khác nhau Sau

đây là một số biện pháp cổ điển đã được sử dụng để xác định diện tích vết: -

Sử dụng thiết bị đo diện tích (diện tích kế)

- Vẽ lại trên giấy ô ly rồi tính số milimet vuông

- Vẽ lại trên giấy can, rồi so sánh diện tích qua trọng lượng bằng phương pháp cân

 Đo mật độ vết bằng densitometer:

Nguyên tắc của phương pháp là chiếu chùm tia sáng vào vết sắc ký trên bản mỏng và đo cường độ ánh sáng truyền qua, cường độ ánh sáng phản xạ hay cường độ huỳnh quang Trong các trường hợp, chiều cao của pic tỷ lệ với cường độ màu ở tâm và chiều rộng pic tỷ lệ chiều dài của vết theo hướng quét Thông thường hướng quét của chùm sáng theo hướng khai triển sắc ký đồ và các vết phải tách rời nhau Có các kiểu xác định khác nhau: phản xạ, truyền qua hay huỳnh quang

 Xử lý hình ảnh với camera kỹ thuật số:

Những năm gần đây, việc quét bản mỏng mới các hệ thống phân tích hình

ảnh, đặc biệt với CCD camera trở nên phổ biến hơn Lợi thế của kỹ thuật này

là có thể quét bản mỏng với một vùng rộng hơn và số điểm ảnh lớn hơn với các thiết bị kỹ thuật số có độ phân giải ngày càng cao Các dữ liệu ảnh được

xử lý bằng máy tính

 Xử lý hình ảnh với máy quét văn phòng:

Các hệ thống phân tích hình ảnh thường có giá thành cao, một phương pháp khác cũng được áp dụng là dùng máy quét văn phòng (scanner) để thu

được hình ảnh bản mỏng [13], [16], [17] Hình ảnh bản mỏng có thể được đo kích thước bằng tay hay tự động trong các chương trình đồ hoạ trên máy tính hay xử lý với các phần mềm chuyên dụng Đây là phương pháp có thể thu

được kết quả nhanh và giá thành thấp

1.4 Sơ lược về sắc ký lỏng hiệu năng cao:

HPLC: High performance liquid chromatography là kỹ thuật phân tích dựa

trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng

di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao

Pha động cùng với mẫu thử được bơm qua cột dưới áp suất cao và các chất cần phân tích di chuyển theo pha động qua cột với tốc độ khác nhau, tuỳ theo

ái lực của chúng với 2 pha dẫn đến sự tách ra của các chất Sự tách này đạt

được là do quá trình hấp phụ, phân bố, trao đổi ion của các chất tan khác nhau về cấu trúc hoá học và tính chất

So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với mẫu chuẩn tính

đ-ược nồng độ của mẫu thử Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hoá 1 điểm hoặc nhiều điểm

- Phương pháp chuẩn nội (Internal standard):

Thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai vào cả chuẩn ngoại lẫn mẫu thử rồi tiến hành sắc ký Chất chuẩn thứ hai này được gọi là chuẩn nội

Yêu cầu đối với chất chuẩn nội:

-Trong điều kiện sắc ký, chuẩn nội phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với chất cần phân tích

- Có cấu trúc hoá học tương tự như chất thử

- Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ của chất thử

- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử

- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm

- Phương pháp thêm chuẩn (Standard addition) :

Kỹ thuật này phối hợp phương pháp chuẩn ngoại và chuẩn nội

Ưu điểm của kỹ thuật thêm chuẩn là có độ chính xác cao vì nó loại trừ

được sai số:

- Do các yếu tố ảnh hưởng

- Đặc biệt là quá trình xử lý mẫu (chiết xuất, tinh chế các chất từ các dạng bào chế )

Có các kỹ thuật: Kỹ thuật so sánh và kỹ thuật thêm đường chuẩn

- Phương pháp chuẩn hoá diện tích (Area Normalization) :

Hàm lượng % của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính

bằng tỷ lệ % diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic trên sắc đồ

Phương pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều phải được rửa giải

và phát hiện Tất cả các thành phần đều có đáp ứng detector (response) như nhau

Hiện nay phương pháp HPLC đã và đang được áp dụng ngày càng nhiều trong kiểm nghiệm thuốc Vì thành phần của các thuốc có chứa các loại cao dược liệu rất phức tạp nên cần phải tinh chế mẫu trước khi tiêm vào cột để hạn chế việc đưa quá nhiều tạp chất vào trong cột gây hỏng cột [6], [22]

Chương II

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Viên bao Sen vông- R do Công ty cổ phần dược phẩm Trung ương 2 sản xuất có thành phần:

Cao khô lá sen: 50 mg Cao khô lá vông: 60mg

- Khảo sát dung môi khai triển và các biện pháp xử lý mẫu khác nhau

để chọn ra các điều kiện thực nghiệm cho các bản mỏng có các vết gọn và vết Rotundin được tách khỏi các vết khác

- Xử lý trên HPTLC bản mỏng thu được: xác định trị số RR f R, đo mật độ các vết

- Chính bản mỏng đã qua xử lý bằng HPTLC được xử lý tiếp bằng hiện màu với thuốc thử phù hợp, quét ảnh (hay chụp ảnh) và xử lý file ảnh bản mỏng bằng phần mềm đồ hoạ trên máy tính cá nhân để xác định kích thước các vết

- Xây dựng và thẩm định phương pháp về khoảng nồng độ tuyến tính,

độ lặp lại, độ đúng và so sánh với phương pháp HPTLC

2.2.2 áp dụng các phương pháp đã xác định được trên một số mẫu viên

Tiến hành áp dụng các phương pháp đã được xây dựng có thể định lượng

Rotundin trong viên Sen vông – R trên cùng một số mẫu chế phẩm cụ thể, xử

lý thống kê các kết quả thu được và nhận xét

2.3 Điều kiện nghiên cứu:

2.3.1 Máy móc và dụng cụ thí nghiệm:

- Bàn chấm CAMAG chia vạch tới 0,001μl

- Bình triển khai bản mỏng

- Bản mỏng Silicagen 60 GFR 254 R (MERCK)

- Máy quét ảnh (Scanner) HP Scanjet 3770 (1200 * 2400 dpi - 48 bit)

- Máy ảnh kỹ thuật số SONY Cyber-shot 5.1 megapixel MPEGMOVIE VX

- Máy CAMAG REPROSTAR 3, xử lý số liệu trên phần mềm Videoscan của

Phòng TNTT, Trường Đại học Dược Hà Nội

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hewlett Packard 1100, cột Nucleosil C18

(250 ì 4mm; 10àm), detecter UV (281nm) của Phòng KTCL, Công ty cổ phần Dược phẩm Trung ương II

- Máy quang phổ UV - Vis Hewlett Packard 8453 của Phòng KTCL, Công

ty cổ phần Dược phẩm Trung ương II

- Máy tính cá nhân

- Máy lắc siêu âm Ultrasonic

- Cân phân tích

- Nồi cách thuỷ

- Các dụng cụ thuỷ tinh: Bình nón có nút mài, bình định mức, pipet

- Dụng cụ phun thuốc thử hiện mầu

- Thuốc thử Dragendoff pha theo DĐVN III (Phụ lục 65)

- Acetonitril, methanol, triethylamin dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao

2.4 Xử lý kết quả:

- Tính toán kết quả trong các bảng tính của EXCEL

- Xử lý thống kê dữ liệu thực nghiệm đo được bằng phần mềm trên máy tính

để nhận xét và rút ra kết luận Một số đại lượng cần được tính toán trong xử lý thống kê số liệu thực nghiệm:

• Giá trị trung bình n

x x

chương III

Kết quả Thực nghiệm và Bàn luận

3.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký:

3.1.2 Chọn hệ dung môi khai triển:

L – tetrahydropalmatin là một alcaloid có tính base yếu, khi dùng chất hấp phụ là silicagel G và khai triển bằng dung môi trung tính thì các base bị giữ lại ở đường xuất phát do có sự tạo thành muối [20] Ngoài ra còn có hiện tượng hấp phụ hai chiều (thuận nghịch) vì vậy thường có hiện tượng kéo đuôi trên lớp mỏng Để khắc phục hiện tượng này, ta thêm một lượng nhỏ kiềm vào dung môi Kiềm thường dùng là triethylamin hoặc ammoniac [12]

L – tetrahydropalmatin dạng base tan trong cloroform, hơi tan trong ehanol, không tan trong nước, là một alcaloid có tính phân cực yếu [4], [31] Muốn tách những chất ít phân cực như vậy thì phải dùng một chất hấp phụ có hoạt độ cao và một dung môi “yếu”, nghĩa là các dung môi hàng đầu của dãy phản hấp phụ [20]

Chất hấp phụ được chọn là silicagel G vì đây là chất hấp phụ thông dụng nó có hoạt tính hấp phụ mạnh hơn nhôm oxyd và kieselgel Qua tham khảo một số tài liệu, chúng tôi đã tiến hành triển khai bản mỏng trên một số

hệ dung môi sau:

1) Cloroform: Aceton: Methanol: Amoniac (20:20:3:1)

2) Cloroform:Methanol (16:4)

3) Cloroform: Methanol: Amoniac (95:5:1)

4) Toluen:Aceton: Ethanol: Amoniac (45:45:7:3)

5) Ethylacetat: Cloroform: Methanol:Amoniac (16:4:1:1)

6) Ethylacetat:Methanol: Amoniac (17:2:1)

7) n- Butanol:Acid acetic:HR2RO: Ammoniac (12:2:3:3)

8) Cloroform:Ethanol:Ammoniac (98:2:0,5)

9) Cloroform: Aceton: Diethylamin (10:10:2)

Tất cả các hệ dung môi trên đều được bão hoà trong bình sắc ký trước khi khai triển

So sánh sử dụng tác nhân kiềm hoá trong hệ dung môi:

Chúng tôi sử dụng tác nhân kiềm hoá trong các hệ dung môi là amoniac hoặc diethylamin Kết quả thực nghiệm cho thấy:

 Với NHR3R:

* ưu điểm: nhanh bay hơi sau khi khai triển bản mỏng

* Nhược điểm:

- Không trộn lẫn vào các thành phần ít phân cực trong hệ dung môi

- Dùng hơi ammoniac: kết quả có độ lặp lại kém

- Nếu hoà tan NHR 3 R trong MeOH để giảm bớt sự phân cực của NHR 3 R thì pha động ít phân lớp hơn, tuy nhiên khi có mặt thêm aceton trong môi trường có kiềm thì có sự tạo thành thêm một chất khác (hình 3.1) nên xuất hiện thêm vết phụ như trong hệ 1

Với diethylamin:

* ưu điểm:

- Trộn lẫn với các dung môi ít phân cực trong pha động

- Không tạo vết phụ, kết quả có độ lặp lại cao

- Không ảnh hưởng đến sự phát hiện vết khi soi dưới đèn tử ngoại và hiện màu bằng thuốc thử