Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng Artessunat trong nguyên liệu

Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI NGUYỄN THỊ KIM OANH GÓP PHẦN NGHIÊN cứu PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ARTESƯNAT TRONG NGUYÊN LIỆU • • • KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ (1997 - 2002) Người hướng dân: TS TRAN Nơi thực Bộ MÔN HOÁ Dược : đức h ậ u Thòi gian thực hiện: 03 / 2002 -» 05 / 2002 HÀ NỘI, THÁNG 05 - 2002 Lèữ eẩm ơR Trước tiên, cho phép bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến TS Trần Đức Hậu - người thầy đă trực tiếp hướng dẫn tận tình giúp đõ suốt trình thực khoá luận tốt nghiệp n ày Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS.ĐỖ Hữu Nghị, thầy cô giáo , cán kỹ thuật viên ỏ môn Hoá Dược phòng giáo tài quan tâm giúp đở tạo điều kiên đ ể có th ể hoàn thành tốt khoá luận Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè quan tâm giúp đỗ, động viên suốt năm học vừa qua Hà Nội, rtgàỵ tháng năm 2002 Sinh viên Nguyễn Thị Kim Oanh MỤC LỤC ĐẬT VÂN ĐỂ PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét bệnh sốt rét, công tác phòng điều trị sốt rét năm qua 1.2 Cây hao hoa vàng hoạt chất 1.2.1 Đặc điểm thực vật 1.2.2 Phân bố 1.2.3 Tác dụng công dụng 1.2.4 Thành^hoá học 1.3 Tổng quan artesunat 1.3.1 Bán tổng hợp artesunat 1.3.2 Đại cương artesunat 11 1.3.3 Điểm qua số phương pháp định lượng 15 1.3.4 Nhận xét lựa chọn 19 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Nguyên vật liệu trang thiết bị 20 20 2.1.1 Dụng cụ thiết bị 20 2.1.2 20 Hoáchất 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3 Kết nghiên cứu 21 2.3.1 Khảo sát trình tạo sản phẩm trung gianQ289 21 2.3.2 Khảo sát trình tạo sản phẩm cuối Q345 23 2.3.3 Xây dựng phương pháp định lượng 26 2.4 Đánh giá phương pháp 28 2.4.1 Xác định tính xác phương pháp 28 2.4.2 Xác định tính phương pháp 29 2.4.3 Xác định tính tuyến tính phương pháp 30 2.4.4 Xác định tính đặc hiệu phương pháp 32 PHẦN 3: KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 ĐẶT VẤN ĐỂ • Sốt rét bệnh xã hội gây ký sinh trùng sốt rét thuộc chi Plasmodium Những loài gây bệnh cho người chủ yếu gồm: - Plasmodium falciparum ( tỷ lệ mắc bệnh 70% ) Plasmodium malariae Plasmodium vivax ( tỷ lệ mắc bệnh 20 - 30% ) ( tỷ lệ mắc bệnh - 2%) Bệnh sốt rét bệnh truyền nhiễm, gây nguy hại lớn đến sức khoẻ người, gây suy giảm sức khỏe, thể ác tính dẫn tới tử vong Ở nước ta, nơi có bệnh sốt rét lưu hành chiếm 3/4 diện tích, vùng núi ven biển, 10% dân số sống vùng bị sốt rét đe dọa[22] Với tính chất nguy hiểm bệnh, thuốc men giữ vai trò quan trọng việc điều trị dự phòng bệnh sốt rét Nhưng tượng ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc nhóm - aminoquinolein, đặc biệt kháng Chloroquin lan rộng 60 nước, có Việt Nam Vì vậy, việc tìm kiếm thuốc chưa kháng ký sinh trùng sốt rét cấp bách[22] Artesunat dẫn chất Artemisinin thuộc nhóm thuốc điều trị sốt rét chiết xuất từ Thanh hao hoa vàng Nhiều nghiên cứu Việt Nam giới công nhận ưu điểm nhóm thuốc này: cắt sốt nhanh, diệt ký sinh trùng nhanh, gây độc cho thể, có tác dụng tốt với chủng Plasmodium kháng thuốc sốt rét khác, thấm qua hàng rào máu não để điều trị sốt rét thể não Điều trị sốt rét ác tính Artesunat dễ sử dụng, an toàn tỷ lệ tử vong thấp hom Quinin truyền tĩnh mạch Hiện nay, có nhiều thuốc thuộc nhóm nghiên cứu để đưa vào sử dụng thay dần thuốc sốt rét khác bị giảm hiệu lực ký sinh trùng kháng thuốc ( VD: Artesunat, Artemether, Arteether, A artelinic )[20] Ở Việt Nam, Artesunat có dạng viên nén dạng tiêm Các thuốc Bộ y tế công nhận thuốc điều trị sốt rét chủ yếu chương trình phòng chống sốt rét quốc gia Do vậy, việc kiểm tra chất lượng nguyên liệu thuốc thành phẩm thuốc quan trọng Trong giới hạn khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, nghiên cứu thực nghiệm để đưa cách tiến hành định lượng nguyên liệu Artesunat, góp phần làm phong phú phương pháp định lượng cho thuốc PHẦN TỔNG QUAN 1.1 VÀI NÉT VỂ BỆNH SỐT RÉT, CÔNG TÁC PHÒNG VÀ ĐIỂU TRỊ SÓT RÉT TRONG NHỮNG NÃM QUA Sốt rét bệnh truyền nhiễm, có tính chất dịch tễ quan trọng lan thành dịch không phát ngăn chặn kịp thời Bệnh phát triển nhiều nước Thế giới, đặc biệt nước thuộc vùng khí hậu nhiệt đới Châu Á, châu Phi, châu Mỹ La tinh Theo thống kê Tổ chức y tế Thế giới ( WHO ), hàng năm Thế giới có khoảng 100 - 200 triệu người bị sốt rét thuộc 95 quốc gia gồm tất châu lục Bệnh sốt rét gây hậu nghiêm trọng sức khoẻ nhân dân vùng sốt rét lưu hành[5,6] Việt Nam nước nằm vùng sốt rét lưu hành mạnh Thế giới Theo báo cáo Viện sốt rét ký sinh trùng côn trùng trung ương, hàng năm nước ta có khoảng 500.000 người mắc bệnh sốt rét 200 - 5000 người chết sốt rét, 30,1 triệu người sống vùng sốt rét lưu hành [20] Từ năm cuối thập kỷ 90, công tác phòng chống bệnh sốt rét Bộ y tế quan tâm thu nhiều thành tích đáng kể Tổng kết kết phòng chống sốt rét Việt Nam từ năm 1992 đến 1997 cho thấy: bệnh nhân sốt rét năm 1997 giảm 59% so với năm 1991, chết sốt rét giảm 97%, đồng thời số vụ dịch sốt rét giảm 92% Đầu tư hàng năm mua thuốc hoá chất phòng chống sốt rét chương trình phòng chống sốt rét quốc gia khoảng 35 - 40 tỷ đồng[19] Với tính chất nguy hiểm bệnh, việc ngăn chặn loại trừ sốt rét nhiệm vụ hàng đầu ngành y tế Việc kiểm soát bệnh sốt rét khó khăn, có tới 1,7 tỷ người sinh sống vùng mà trước sốt rét bị đẩy lùi, phát triển mạnh trở lại Hiện nay, ký sinh trùng sốt rét kháng hầu hết loại thuốc quen thuộc dùng để phòng điều trị thời gian qua Chloroquin bị Plasmodium falciparum kháng khoảng 60%, thuốc khác Fansida bị kháng khoảng 30 - 35% Mefloquin tác dụng tốt giá thành cao bắt đầu bị kháng Quinin bị ký sinh trùng kháng lại có số tác dụng phụ gây khó khăn cho bệnh nhân Chính vậy, nhóm thuốc Artemisinin dẫn chất đưa áp dụng điều trị sốt rét gây tiếng vang lớn thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học[20,21] Vào đầu thập niên 70, nhà khoa học Trung Quốc chiết xuất từ hao hoa vàng loại hoạt chất có tác dụng điều trị sốt rét gọi Quinghaosu ( QHS ) Artemisinin Chất chứng tỏ hiệu lực chống sốt rét tốt kể với bệnh nhân mắc chứng kháng thuốc Hơn nữa, Artemisinin dẫn chất có khả vượt qua hàng rào máu não nên có hiệu lực điều tri sốt rét thể não[14] Tuy nhiên, độ tan Artemisinin nước tỷ lệ tái phát sau dùng cao nên tác dụng điều trị Artemisinin phần bị hạn chế Để hoàn thiện khả Artemisinin, năm đầu thập kỷ 80, nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu bán tổng hợp số dẫn chất từ Artemisinin như: Artesunat, Artemether, Arteether, acid artelinic.v.v có tác dụng điều trị cao chất gốc, đồng thời sử dụng cho đường tiêm Trong số Artesunat chất dùng phổ biến Hiện nay, Việt Nam có nhiều sở sản xuất Artemisinin dạng viên để uống Artesunat dạng uống dạng tiêm để đáp ứng nhu cầu sử dụng nhân dân Vì vậy, vấn đề cần quan tâm nhà sản xuất quản lý đảm bảo công tác kiểm tra chất lượng thuốc Đã có nhiều công trình nghiên cứu nước mặt khác nhóm thuốc tác dụng, độc tính, dạng bào chế.v.v kiểm nghiệm, có nhiều công trình nghiên cứu định tính, thử tinh khiết, định lượng Artemisinin Artesunat; Dược điển Việt Nam III có chuyên luận hai thuốc 1.2 CÂY THANH HAO HOA VÀNG VÀ HOẠT CHẤT CỦA NÓ 1.2.1 Đặc điểm thực vật - Tên khoa học: Artemisia annua L.asteraceae - Tên dân gian: ngải si, ngải dại, ngải đắng, ngải hôi, ngải hoa vàng Cây thảo, mọc hàng năm, thơm, cao tới lm, thân có rãnh, gần không lông Lá có phiến xoan, - lần kép thành đoạn hẹp nhọn, không lông Chuỳ cao mang chùm dài, hẹp, hoa đầu cao 1,8 - 2mm, bắc hẹp, có lông xanh, bắc bắc xoan rộng, hoa hoàn toàn hình ống, cỡ 15 cái, hoa cái, hoa lưỡng tính Quả bế nhẩn, cao 0,5mm, mào lông Hoa tháng - 11, có tháng -3 Thường lụi vào tháng [17,21] Theo thông báo Tổ chức y tế Thế giới ( WHO ), Trung Quốc, Mỹ, khoảng 40 loài thực vật thuộc chi Artemisia, qua chọn lọc có loài Artemisia annua L có chứa hoạt chất chữa sốt rét Theo T.D.HOOKER, M.H.LECOMB 1922 số tài liệu khác chi Artemisia có 250 loài giới, Việt Nam biết có 15 loài, có loài dễ nhầm lẫn với nhau, là: Artemisia apiceaehance, Artemisia capilaris, Artemisia campestric ba loài hoạt chất chữa sốt rét loài Artemisia annua [17,22] 1.2.2 Phân bô Thanh hao hoa vàng phân bố nhiều nơi Thế giới chủ yếu tập trung nơi có khí hậu nhiệt đới ôn đới Bắc Mỹ, Đông Âu, Nga, Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn Độ.v.v Tại Việt Nam, mọc hoang dại thành cụm dọc ven sông, ven suối, chân đồi, nơi ẩm thấp ánh sáng nhiều Ta bắt gặp tỉnh phía Bắc như: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Hà Bắc, Vĩnh Phú, Tuyên Quang, Hoà Bình dọc theo tỉnh Thanh Hoá, Nghệ An Do vừa dược liệu quý có giá trị kinh tế, dễ trồng, dễ thích nghi với điều kiện khí hậu nên hao hoa vàng trồng với diện tích rộng, cho suất hàm lượng hoạt chất cao mọc hoang dại Thời gian thu hái tốt vào tháng lúc chuẩn bị hoa [4] 1.2.3 Tác dụng công dụng Theo y học cổ truyền Việt Nam, hao có vị đắng (khổ), tính lạnh (hàn), quy vào hai kinh can đởm Có tác dụng thư tịnh uế, trừ phục nhiệt âm phận Dùng chữa trường hợp cốt chưng lao nhiệt (đau xương, nóng), đạo hãn (ra mồ hôi trộm), ngược tật (sốt rét), lở ngứa Còn dùng chữa cảm mạo, nhiệt, giúp tiêu hoá, lợi gan mật Có thể dùng riêng phối hợp với số vị thuốc khác [17] Theo khoa học đại, dùng làm nguyên liệu chiết Artemisinin để chữa sốt rét 1.2.4 Thành phần hoá học Tất phận hao hoa vàng có chứa tinh dầu hàm lượng tinh dầu khác nhau, phụ thuộc vào giống nơi trồng, dao động từ khoảng 0,5 - 0,6% Tinh dầu có màu vàng nhạt có mùi long não với thành phần chủ yếu camphor, artemisia ceton, p myrcen [4,17,18] Ngoài thành phần tinh dầu hoạt chất có tác dụng điều trị sốt rét Artemisinin nhà khoa học Trung Quốc chiết tách xác định cấu trúc từ năm 1972, Artemisinin secquiterpen lacton có cầu nối peroxyd nội phân tử, nhóm định tác dụng diệt ký sinh trùng sốt rét.Bên cạnh Artemisinin, người ta xác định loạt hợp chất secquiterpen khác [5,18]: I - Thực nghiệm 5: thực hành giống thực nghiêm không cho 5ml dung dịch ZnCl2 0,5% Kết ghi bảng Bảng 3: Ảnh hưởng ZnCl2 0,5% đến độ hấp thụ sản phẩm cuối Độ hấp thụ mẫu Độ hấp thụ mẫu (có ZnCl2), (m, = 0,0999) (không có ZnCl2), (m2 = 0,1001) 0,475 0,490 10 0,489 0,481 15 0,488 0,470 20 0,486 0,464 25 0,488 0,455 30 0,481 0,442 35 0,480 0,436 t ( phút) Qua số liệu bảng cho thấy, ZnCl2 0,5% phản ứng xảy nhanh sản phẩm cuối lại không bền, độ hấp thụ giảm nhanh Còn có ZnCl2 0,5% phản ứng xảy từ từ thay đổi Trong khoảng thời gian từ 10 đến 25 phút, độ hấp thụ không thay đổi, chứng tỏ sản phẩm tạo thành cuối bền vững Vì vậy, dùng 5,0 ml ZnCl2 0,5% chọn thời gian để phản ứng 15 phút 2.3.3 Xây dựng phương pháp định lượng: Qua trình khảo sát chọn lựa điều kiện định lượng, xây dựng cách tiến hành định lượng Artesunat sau: Cân xác khoảng 0,lg Artesunat, hoà tan ethanol tuyệt đối, chuyển vào bình định mức 50ml, thêm Ethanol đến vạch ( dung dịch A ) 26 Lấy xác 5ml dung dịch A cho vào bình định mức dung tích 50ml, thêm lOml dung dịch NaOH 0,2N, đun cách thuỷ 50 ± l°c 45 phút Sau làm nguội nhanh nước máy Thêm tiếp 4ml dung dịch acid acetic 1,1M, lắc thêm 5ml dung dịch kẽm clorid 0,5%, lắc Sau thêm lOml dung dịch thuốc thử diazoni ( pha khoảng 15 phút trước theo cách pha khảo sát mục 2.3.2), thêm nước cất vừa đủ 50ml, trộn Để yên 15 phút Song song làm mẫu trắng điều kiện ( 5ml dung dịch A ) Tiến hành đo độ hấp thụ dung dịch thu bước sóng 345nm, cuvet dày lcm Song song làm mẫu Artesunat đối chiếu Hàm lượng % Artesunat mẫu thử tính theo công thức: % Artesunat = X Dcxmt X Trong đó: - Dt Dc độ hấp thụ đo dung dịch thử dung dịch chuẩn ( chất đối chiếu ) - mt mc khối lượng cân (g) Artesunat mẫu thử mẫu chuẩn - X hàm lượng % Artesunat chuẩn ( chất đối chiếu ) ♦ Ắp dung: áp dụng phương pháp vừa xây dựng để định lượng Artesunat Trường Đại học Dược Hà Nội sản xuất Kết thu được ghi bảng 4: 27 Bảng : Kết định lượng Artesunat phương pháp đo quang phổ tử ngoại bước sóng 345nm STT Khối lượng (g) Độ hấp thụ % Artesunat 0,0999 0,486 98,59 0,0998 0,488 99,10 0,1001 0,490 99,21 0,1002 0,490 99,11 0,1000 0,489 99,10 Chuẩn 0,1001 0,487 98,60 Các đại lượng thống kê với độ tin cậy p = 0,95 Giá tri trung bình: X = 99,02% Độ lệch chuẩn: s = 0,25 Khoảng tin cậy giá tĩị trung bình: AX = 0,31 x% = 99,02% ±0,31 Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) = 0,25% 2.4 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 2.4.1 Xác định tính xác phương pháp: Từ kết bảng cho thấy: - Giá trị trung bình : 99,02% - Độ lệch chuẩn: 0,25 - Khoảng tin cậy giá trị trung bình: ± 0,31 - Độ lệch chuẩn tương đối: 0,25% < 2% —» Vậy phương pháp xác 28 2.4.2 Xác định tính phương pháp: Để xác định tính phương pháp, sử dụng lượng cân Artesunat khác có hàm lượng biết, khối lượng từ 0,0800 đến 0,1200g ( tức khoảng 80% đến 120% so với lượng cân xây dựng phương pháp ) Tiến hành định lượng theo mục 2.3.3, kết ghi bảng Bảng 5: Xác định tính phương pháp % tìm lại STT Khối lượng cân Khối lượng hoạt Khối lượng tìm chất có thực (g) lại (g) (g) 0,0802 0,0791 0,0786 99,37 0,0901 0,0888 0,0883 99,44 0,1001 0,0987 0,0982 99,49 0,1099 0,1084 0,1077 99,35 0,1201 0,1184 0,1180 99,66 0,1014 0,1000 0,1000 100 Từ kết bảng 5, ta có: - Giá trị trung bình tỷ lệ tìm lại: 99,46% - Phương trình hồi qui mối tương quan lượng hoạt chất ban đầu lượng hoạt chất tìm lại là: y = 1,000 X - 0,0005 - Hệ số tương quan: r = 0,9999 - Độ lệch chuẩn y_intercept: SB = 0,004 - Khoảng tin cậy y_intercept: AB= 0,013 -0,0135 < B < 0,0125 - Độ lệch chuẩn độ dốc: SA= 0,0004 - Khoảng tin cậy độ dốc: Aa = 0,0013 0,9987 < A < 1,0013 29 Kết luán: Không có sai số hệ thống định khoảng tin cậy y- intercep chứa Không có sai số hệ thống tỷ lệ khoảng tin cậy độ dốc chứa Giá trị trung bình tỷ lệ tìm lại : 99,46% nằm khoảng 98,0% đến 102,0% —» Vậy phương pháp khoảng khảo sát 2.4.3 Xác định tính tuyến tính phương pháp: Để xác định tính tuyến tính phương pháp, thiết lập phụ thuộc độ hấp thụ dung dịch đo vào nồng độ dung dịch đo, lấy kết từ mục 2.4.2, ghi vào bảng Bảng 6: Sự phụ thuộc độ hấp thụ vào nồng độ dung dịch Nồng độ ( g/1) 0,1582 0,1776 0,1974 0,2168 0,2368 Độ hấp thụ 0,390 0,438 0,487 0,534 0,583 30 Đo íh\ bieu ditíìi phụ thuộc CUŨ đô hấp thu vào nồng đô dung dỉch - Phương trình hồi quy mối tương quan độ hấp thụ nồng độ dung dịch: y = 2,4540 X + 0,002 - Hệ số tương quan: r = 0,9990 - Độ lệch chuẩn y_intercept: SB= 0,006 - Khoảng tin cậy y_intercept: AB= 0,0191 -> -0,0171 < B < 0,0217 Kết luân: Hệ số tương quan đường hồi quy 0,9990 vượt 99 Tat ca cac gia tn đo đêu năm đường hồi quy phân bô đồng ,đồng hai phía đường hồi quy Khoảng tin cậy y - intercept chứa -> Vậy phương pháp tuyến tính khoảng nồng độ từ 80% đến 120% nồng độ làm việc 31 2.4.4 Xác định tính đặc hiệu phương pháp: Các tạp chất có lẫn Artesunat nguyên liệu, thường gặp Dihydroartemisinin ( DHA ), tạo Artesunat bị thuỷ phân trình sản xuất bảo quản nguyên liệu ban đầu để bán tổng hợp Artesunat chưa phản ứng hay chưa loại hết Theo [5], định lượng Artesunat theo phương pháp TCN, DHA ảnh hưởng lớn tới kết định lượng Trong phương pháp vừa xây dựng, có giai đoạn đầu tạo sản phẩm Q289 nên DHA ảnh hưởng tới độ hấp thụ sản phẩm trung gian Q289 Để khảo sát ảnh hưởng DHA đến độ hấp thụ sản phẩm cuối Q345 xác định tính đặc hiệu phương pháp vừa xây dựng, tiến hành thực nghiệm sau: • Thực nghiệm 1: Cân xác khoảng 0,lg Artesunat 0,1 g DHA, hoà tan riêng rẽ loại ethanol tuyệt đối chuyển vào bình định mức riêng biệt có dung tích 50ml, thêm ethanol tới vạch, lắc Thu dung dịch A ( chứa Artesunat) dung dịch B ( chứa DHA ) Lấy xác 5ml dung dịch A 5ml dung dịch B cho vào bình định mức 50ml riêng biệt, thêm vào bình lOml dung dịch NaOH 0,2N Đun cách thuỷ 45 phút 50 ± l°c, làm nguội nhanh nước máy Sau thêm vào bình 4ml dung dịch acid acetic 1,1M, lắc Thêm 5ml dung dịch ZnCl2 0,5% lOml dung dịch thuốc thử diazoni, thêm nước cất đến vạch, lắc Để yên 15 phút Song song làm mẫu trắng ( 5ml dung dịch A dung dịch B ) điều kiện Tiến hành đo độ hấp thụ dung dịch thu bước sóng 345nm Kết ghi bảng 32 Bảng 7: Độ hấp thụ DHA Artesunat bước sóng 345nm Khối lượng (g) Độ hấp thụ DHA Độ hấp thụ Artesunat 0,1000 0,656 0,490 0,1014 0,709 0,500 Nhận xét: DHA sau thuỷ phân môi trường kiềm tạo sản phẩm hấp thụ tử ngoại 289nm, sản phẩm sau phản ứng với thuốc thử Diazoni tạo sản phẩm cuối hấp thụ tử ngoại 345nm • Thực nghiệm 2: Để khảo sát ảnh hưởng DHA đến độ hấp thụ tử ngoại Artesunat tiến hành sau: Cân xác khoảng 0,lg Artesunat, hoà tan ethanol tuyệt đối, chuyển vào bình định mức dung tích 50ml, thêm ethanol đến vạch, trộn ( dung dịch A ) Cân xác khoảng 0,01g DHA, hoà tan ethanol tuyệt đối, chuyển vào bình định mức dung tích 50ml, thêm ethanol tới vạch, trộn ( dung dịch B ) Chuẩn bị bình định mức dung tích 50ml: lấy xác 5ml dung dịch A cho vào bình lấy xác lượng khác nhau: 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0ml dung dịch B cho vào bình Sau cho vào bình lOml dung dịch NaOH 0,2N, đun cách thuỷ 50 ± l°c, vòng 45 phút Làm nguội nhanh nước lạnh thêm vào 4ml dung dịch acid acetic 1,1M lắc Sau thêm 5ml dung dịch ZnCl2 0,5% thêm lOml dung dịch thuốc thử Diazoni, thêm nước cất vừa đủ, trộn Để yên 15 phút Đem dung dịch thu đo độ hấp thụ bước sóng 345nm, cuvet dày lcm, với mẫu trắng làm điều kiện ( dung dịch A B ) 33 Kết đo ghi bảng ọ _ Bảng 8: Anh hưởng DHA đến độ hấp thụ sản phẩm cuối Bình Dung dịch A ( m l) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Dung dich B 0,5 1,0 1,5 2,0 Làm phản ứng bổ sung nước vừa đủ 50ml, để yên 15 phút • % DHA thêm vào Độ hấp thụ 0,488 0,495 0,504 0,512 0,516 Thực nghiệm 3: cân tiến hành thực nghiêm song thay DHA Artesunat Kết thu ghi bảng Bảng 9: Ảnh hưởng % Artesunat đến độ hấp thụ sản phẩm cuối Bình Dung dịch A ( m l) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Dung dịch B 0,5 1,0 1,5 2,0 Làm phản ứng bổ sung nước vừa đủ 50ml, để yên 15 phút % Artesunat thêm vào Độ hấp thụ 0,489 0,495 0,502 0,504 0,509 Từ bảng bảng cho thấy, thêm 1% DHA kết định lượng tăng trung bình 0,007 đơn vị, thêm 1% Artesunat kết định lượng tăng trung bình 0,005 đơn vị Từ kết kết bảng 8, thấy với khối lượng cân độ hấp thụ sản phẩm tạo 34 thành từ DHA lớn độ hấp thụ sản phẩm tạo thành từ Artesunat điều kiện môi trường 1,4 lần Như vậy, lẫn 1% DHA kết định lượng tăng 1,4% Sự có mặt DHA làm sai kết định lượng, cụ thể làm tăng kết định lượng Tuy nhiên với mẫu Artesunat có hàm lượng DHA thấp, hay xấp xỉ hàm lượng DHA mẫu đối chiếu kết định lượng phụ thuộc vào hàm lượng DHA Trong TCN quy định lượng DHA phải 1% Tuy nhiên có chất chuẩn Artesunat với hàm lượng DHA không đáng kể 1% DHA có mặt làm tăng kết định lượng lên nhiều ( 1,4% ) Như vậy, mức độ ảnh hưởng DHA đến kết định lượng phương pháp 35 PHẦN KẾT LUẬN Trong khoá luận này, dựa vào tóm tắt phương pháp công bô [26], để nghiên cứu cách định lượng artesunat nguyên liệu cho phù hợp với điều kiện sẵn có Qua trình nghiên cứu , thực nghiêm, thu kết sau: ♦> Chúng khảo sát việc dùng dung dịch NaOH 0,2N để chuyển artesunat thành sản phẩm trung gian Q289 thay cho việc dùng NaOH IN phương pháp công bố [26] ❖ Trong điều kiện, thuốc thử Fast TR red salt không sẵn có ,chúng tiến hành với muối Diazoni khác pha từ hoá chất sẵn có Đó muối Diazoni acid sulíanilic pha dựa theo DĐQT Kết là, sản phẩm cuối có độ hấp thụ cực đại bước sóng 345 nm (không phải 420 nm [26]) ❖ Dựa vào trình khảo sát điều kiện ảnh hưởng tới kết định lượng, xây dựng thêm phương pháp định lượng artesunat *»* Đã đánh giá cách tiến hành định lượng kết cho thấy: phương pháp xác, tuyến tính Do thời gian có hạn chưa áp dụng phương pháp vào việc định lượng chế phẩm bào chế artesunat Phương pháp vừa xây dựng triển khai áp dụng vào định lượng artesunat nguyên liệu có kết tốt Phương pháp có số ưu- nhược điểm sau: 36 > Cực đại hấp thụ sản phẩm cuối 345 nm, vùng chất hấp thụ Vì vậy, phương pháp có tính đặc hiệu phương pháp ghi TCN, đặc biệt định lượng artesunat dạng bào chế hỗn hợp nhiều chất > Do DHA ảnh hưởng đến kết định lượng (cụ thể làm tăng kết định lượng) Vì vậy, chế phẩm có lẫn DHA kết định lượng không > Phương pháp phải sử dụng đến chất chuẩn mà nước ta chưa sản xuất ♦ Do thời gian có hạn điều kiện phòng thí nghiệm, trình nghiên cứu khảo sát tránh khỏi sai sót mong hướng dẫn, bảo thêm thầy cô giáo 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ y tế: Tiêu chuẩn nghành 52 TCN 370 - 92 Bộ y tế: Tiêu chuẩn nghành TCN 364 - 94 Bộ môn hoá dược:Trường đại học Dược Hà Nội-Lý thuyết hoá dược, tập II - Nhà xuất Y học Hà Nội - 1998 Võ Văn Chi: Từ điển thuốc Việt Nam - Nhà xuất Y học - 1997 Hoàng Mạnh Cường: Luận văn tốt nghiệp thạc sỹ Dược học “ Góp phần nghiên cứu định lượng artesunat ’’-Trường đại học Dược Hà Nội - 1998 Lê Đình Công,Trịnh Ngọc Hải, Hoàng Kim Huyền: Nghiên cứu đánh giá phác đồ điều trị sốt rét trẻ em & người lớn dựa số thông số Dược động học hiệu lực điều trị lâm sàng - Tạp chí Dược học số 4/1999 (tr.14) Phan Đình Châu, Phan Lệ Thuỷ: Bán tổng hợp hoạt chất trị sốt rét acid artelinic - dẫn chất có khả hoà tan nước artemisinin - Tạp chí Dược học số 1/1994 (tr.l 1) Dược Điển Việt Nam n,tập - Nhà xuất Y học- 1994 Dược Điển Việt Nam III - Nhà xuất Y học - 2002 10 Đào Đình Đức, Nguyễn Đức Tào cộng sự: Nghiên cứu artesunat tiêm công ty Dược liệu sản xuất, so sánh với artesunat Trung Quốc sản xuất người khoẻ mạnh bệnh nhân nhiễm Plasmodium falciparum không biến chứng - Tạp chí Dược học số 3/1995 (tr.18) 1l.T rần Đức Hậu: Nghiên cứu phương pháp hoá học để định tính định lượng artemisinin - Đề tài nghiên cứu khoa học cấp 1995 - Trường đai Hoc Dươc Hà Nôi 12.Trần Đức Hậu: Đánh giá phương pháp định lượng artesunat - Tạp chí Dược học 10/2001 (tr.18) 13.Trần Đức Hậu, Nguyễn Thị Vĩnh Hồng: Định lượng artesunat phương pháp đo quang phổ hấp thụ vùng khả kiến - Tạp chí Dược học số 3/2002 (tr.19) 14.Hoàng Kim Huyền: Sử dụng thuốc điều trị sốt rét - Tủ sách sau đại học- Chuyên đề Dược lâm sàng-Trường Đại học Dược Hà Nội-1996 15.ĐỖ Tất Lợi: Cây thuốc vị thuốc Việt Nam-Nhà xuất Y học-1999 16.Đỗ Hữu Nghị: Nghiên cứu chiết xuất-Bán tổng hợp đưa vào sản xuất số hợp chất tự nhiên có tác dụng điều trị sốt rét từ nguồn dược liệu Việt Nam Luận án phó tiến sỹ-Trường đại học Dược Hà Nội 17.ĐỖ Hữu Nghị: Một số phương pháp cải tiến bán tổng hợp artemether arteether từ artemisinin-Tạp chí Dược học số 5/1996(tr.7) 18 Vũ Thị Phan: Thuốc chữa sốt rét-Viện sốt rét KST- CT,8/ 1994 19.GS Đỗ Nguyên Phương: Bài phát biểu trưởng y tế - Tại hội nghị khoa học phòng chống sốt rét thừa thiên Huế 20 Bùi Thị Thanh Phương: Khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học “ Góp phần định lượng artesunat đo quang phổ tử ngoại Trường đại học Dược Hà Nội ,2001 21.Lê Ngọc Quỳnh: Khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học “ Góp phần định lượng artesunat đo quang phổ hấp thụ vùng khả kiến Trường đại học Dược Hà Nội ,2001 22.Nguyễn Đức Tào cộng sự: Những kết ban đầu đánh giá tác dụng dược lý lâm sàng artesunat công ty Dược liệu TW I sản xuất Tạp chí Dược học số 2/1994(tr 11) 23.Đỗ Thị Thảo: Luận văn tốt nghiệp thạc sỹ Dược học “ Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat chế phẩm viên nén Trường đại học Dược Hà Nội,2001 24.Từ điển Bách khoa Dược học - Nhà xuất y học ,1999 25.Viện sốt rét KST- CT: Nhận xét hiệu sốt rét thông thường Plasmodium falciparum kháng thuốc phác đồ artemisinin đơn artemisinin phối hợp với mefloquin Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học (1991-1996),(tr.ll6) 26.Michael D Green, D.L.Mount, and R.A Wirtz, Division of Parasitic Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georia, USA, and N.J White, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, Bangkok, Thailand http://www.mahidol.ac.th/abstracts/annual 2000/0298.htm 27.D.L Klayman Science 288-1985(tr.l049) 28.Dr.Lee S.Self,Regional adviser in malaria, WHO/WFRO: Update on malaria situation in the western Pacific region- 1996 29.Z.M Zhou, JC Ander, N Chung, Journal of Chromatography, 414/1987 (tr.77-90) 30.The international Pharmacopoeia(Vol2), 1984 31 WHO - The international Pharmacopoeia, third Edition, 199? (tr 22-24) [...]... đối 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u Dựa vào bản tóm tắt của phương pháp [26], song trong điều kiện không có thuốc thử Fast TR red salt, chúng tôi nghiên cứu xây dựng cách tiến hành định lượng artesunat phù hợp với điều kiện sẩn có.Cụ thể: - Xây dựng phương pháp định lượng và áp dụng phương pháp đó để định lượng nguyên liệu Artesunat do trường đại học Dược sản xuất 20 -Đánh giá phương pháp định lượng này... succinic tự do trong chế phẩm, do đó khó có thể áp dụng cho định lượng viên nén - Phương pháp chuẩn độ gián tiếp là phương pháp dễ thực hiện song phương pháp này mới chỉ được nghiên cứu áp dụng cho định lượng nguyên liệu Artesunat, muốn áp dụng trong định lương các'd ^ ^ b ào chế Artesunat thì cần được nghiên cứu thêm / K 'Ỹ \ í rìiiĩVVTÍAM* • Phương pháp đo quang phổ hấp thu vùng khả kiến T211: Nguyên tắc:... tim mạch 1.3.3 Điểm qua một số phương pháp định lượng hiện nay • Phương pháp đo quang phổ hấp thu vùng tử ngoai T5.91: Sau khi đun nóng trong môi trường kiềm, Artesunat chuyển thành Q289 là sản phẩm có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 289nm, do đó có thể định lượng Artesunat trong chế phẩm và trong nguyên liệu bằng phương pháp đo độ hấp thụ cuả Artesunat ( sau khi thuỷ phân trong môi trường kiềm ) trên... phép định lượng mới có kết quả đúng Tuy nhiên trong chế phẩm viên nén, khó có thể khống chế được lượng DHA • Phương pháp HPLC với detector UY f20.21.231: Định lượng Artesunat không qua đun nóng trong môi trường kiềm, dùng pha động là acetonitril : đệm phosphat pH = 5,1 ( 38 : 62 ), bước sóng 15 phát hiện là 235nm Hoặc để định lượng Artesunat trong dược liệu, trong các dịch sinh vật hay để định lượng. .. nhà khoa học Trung Quốc còn miêu tả hai phương pháp khác để định lượng Artemisinin và các dẫn chất cuả nó trong mẫu thử sinh học: * Phương pháp đo độ phóng xạ: sau khi uống thuốc đã được đánh dấu bằng Tritium [29] 4» Phương pháp đo mật độ quang trên sắc ký lớp mỏng - Định lượng Artesunat dạng nguyên liệu bằng đo quang phổ hấp thụ vùng khả kiến dựa vào phương pháp tách chiết (phân lập artesunat khỏi... quả định lượng[ 21] - Định lượng Artesunat dạng nguyên liệu bằng đo quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại ở bước sóng 289 nm dựa vào phương pháp tách chiết (phân lập Artesunat khỏi DHA ), khắc phục được ảnh hưởng của DHA đến kết quả định lượng[ 21] - Định lượng Artesunat trong viên nén bằng cách đo quang phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 289nm, song khắc phục được ảnh hưởng của 18 DHA đến kết quả định lượng. .. cũng là nguyên liệu bán tổng hợp ra chất này • Phương pháp đo quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại ở bước sóng 289 ± lnm và phương pháp đo quang phổ hấp thụ vùng khả kiến: đơn giản, dễ thực hiện và hiện nay đã khắc phục được ảnh hưởng của DHA bằng cách phân lập Artesunat ra khỏi DHA trước khi tiến hành định lượng Trong khoá luận tốt nghiệp này, chúng tôi nghiên cứu áp dụng một phương pháp mới định lượng Artesunat... sử dụng phương pháp HPLC với detector điện hoá để định lượng Artesunat Quá trình xảy ra trên bề mặt điện cực được mô tả như sau: or OCOC^CH2COOH or Nhận xét: phương pháp này có độ nhạy, tính đặc hiệu cao nên thích hợp trong việc định lượng với hàm lượng nhỏ như trong dịch sinh vật Tuy nhiên, phương pháp này không phải cơ sở nào cũng có đủ trang thiết bị và có điều kiện áp dụng được 16 • Phương pháp HPLC... tôi đã sử dụng những lượng cân Artesunat khác nhau có hàm lượng đã biết, khối lượng từ 0,0800 đến 0,1200g ( tức là khoảng 80% đến 120% so với lượng cân đã xây dựng trong phương pháp ) Tiến hành định lượng theo mục 2.3.3, kết quả được ghi trong bảng 5 Bảng 5: Xác định tính đúng của phương pháp % tìm lại STT Khối lượng cân Khối lượng hoạt Khối lượng tìm chất có thực (g) lại được (g) 1 (g) 0,0802 0,0791... 0,25% 2.4 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 2.4.1 Xác định tính chính xác của phương pháp: Từ kết quả bảng 4 cho thấy: - Giá trị trung bình : 99,02% - Độ lệch chuẩn: 0,25 - Khoảng tin cậy của giá trị trung bình: ± 0,31 - Độ lệch chuẩn tương đối: 0,25% < 2% —» Vậy phương pháp là chính xác 28 2.4.2 Xác định tính đúng của phương pháp: Để xác định tính đúng của phương pháp, chúng tôi đã sử dụng những lượng cân Artesunat ... hành định lượng Trong khoá luận tốt nghiệp này, nghiên cứu áp dụng phương pháp định lượng Artesunat dựa theo phương pháp công bố tài liệu nước (bản tóm tắt)[26] Theo tài liệu này, nguyên tắc phương. .. 2.4.1 Xác định tính xác phương pháp 28 2.4.2 Xác định tính phương pháp 29 2.4.3 Xác định tính tuyến tính phương pháp 30 2.4.4 Xác định tính đặc hiệu phương pháp 32 PHẦN 3: KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM... sẩn có.Cụ thể: - Xây dựng phương pháp định lượng áp dụng phương pháp để định lượng nguyên liệu Artesunat trường đại học Dược sản xuất 20 -Đánh giá phương pháp định lượng theo tiêu: tính xác,