ĐẶT VẤN ĐỂ Hiện nay, trong điều trị bệnh tâm thần ở nước ta, chỉ định liều dùng chủ yếu dựa vào sự đáp ứng của thuốc với người bệnh và các triệu chứng trên lâm sàng, kinh nghiệm điều trị của bác sỹ. Biệt dược Aminazin có hoạt chất là Clorpromazin hydroclorid là một dẫn chất của phenothiazin với tác dụng chính là hướng thần, ngoài ra còn có tác dụng an thần, chống nôn, kháng histamin và kháng serotonin. Cũng như các thuốc hướng thần khác, Clorpromazin có cơ chế tác dụng phức tạp hay gặp trường hợp ngộ độc thuốc, hcfn nữa trong thực tế điều trị các thể thường thể hiện rất rõ và phức tạp, các bệnh nhân khác nhau có đáp ứng khác nhau với thuốc. Vì vậy phải theo dõi sát sao trong quá trình điều trị. Để đạt được kết quả tốt và hạn chế những tai biến có thể xảy ra khi dùng thuốc và tìm cho mỗi bệnh nhân một liều điều trị phù hợp, cần phải theo dõi thường xuyên nồng độ thuốc trong máu bệnh nhân. Các phương pháp phân tích hay dùng để xác định nồng độ thuốc trong dịch sinh học là sắc ký lỏng hiệu năng caoHPLQ, sắc ký khí, sắc ký khí gắn vói khối phổ, điện di mao quản... Trong đó, HPLC đặc biệt là HPLC pha đảo vói detector u v là phương pháp hay được dùng hơn cả do tính ưu việc nổi trội về độ nhạy, tính chính xác, độ chọn lọc, tính kinh tế. Để có một quy trình dùng HPLC đảm bảo độ tin cậy để phân tích thuốc trong dịch sinh học, chúng ta khảo sát các điều kiện sắc ký thích hợp như: cột; dung môi pha động; lưu lượng dòng; bước sóng, quy trình xử lý mẫu, khoảng nồng độ khảo sát,... Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Aminaùn trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Với muc tiêu:
BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI TRẦN THỊ MINH NGHĨA NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ■ ĐỈNH LƯỢNG AMINAZIN TRONG HUYẾT TUƠNG ĩ ■ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NẢNG CAO ■ (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ KHOÁ 2002-2006) Người hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Kiều Anh DS. Nguyễn Trung Nghĩa Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá phân tích và độc chất Phòng thí nghiệp Trung tâm Thời gian thực hiện : Từ tháng 3.2006 đến tháng 5.2006 HÀ NỘI, THÁNG 5-2006 \ [f l ' ■■■■ £ Ờ 3 ^ ũ J j l L Ơ n i Çî^miq. th ồ i gian, Utựe. kiịiL OỈL hơàn. tíứ u th Luận oAm. ữề đầ tà i: "QlạhiẰTL eứu xAụ. diỷnụ. phuổnạ. p jtá ft địn h lườttg. amÌMoxẦM trmtq, tujujA tường, íĩằttạ. sẮa UẠ lấttạ. lùẲtí nÚMjạ. ea&". ^ ò i đ ă nhận ituổíi n i ạiúp, it& qẮãẠ l%án eủxL eÓA ỉhẰ ụ, eầ ạiáiờ^ OỈL eÓA e ú tt lĩở tnjù*L hjơÁ fdtcuL tíelLf phồng, iiú, nạhiỀm. trunạ. lăm. Irưềtvạ, ^ ạ i hjMt (Dưổe. 'Jôà. Qljệi, Çîôi XÙL l%àụ. ỈẢ Lànụ. lù â ổn. eh âtt thòutli ixà iAu. iẨe. tê i ÇîhS. OtqẨiựỈM. Ç îk i 3CiỀu cÂnh nựưồi đã trưe. tíjỂft hẮÌấnụ, íiẪ n lỉÁ ạ iú ft lồ i tmng, suiết qầiá trình. UuỊe. hiện, đề, tà i. ^ ồ l xin. ehân th ành eảnt ổ*t eÓA thầụ. eầ gẦAớ^, eáe. eán í%ặ tm mỗ*L hũá. fih â jt tíeh, pUồtvạ. th í nạhiỀm. ừ ^ tạ . lăm, đ ă tọLờ^ ntọi đ tề ti UiệếL thuậtL lờ i đì. l&i hjôỉuL th àn h khữá. lu ận. Ç îù i e ũ n ự , dàn. ạ ử i lồ i ítả m ổ ^t đỂ n eAe. ih ầ ụ . eê^ QÌájô^f eán- e á r t íỉẠ tớỉui tễ^ttònq, đ ã lận. tình. gẦAttg. tLạự,f ụiúp. đễ^ tề i ÌM^Àỳng, qxtú, trin ft hờ4í tậfL tạ i trưềnjạ QUkùn. dịfL nàụ. tồ i eũnạ. æÙL ạử i ÍM, eám. ổtt tề i tùàếL thê. luỊtí lĩề, ¿tầtiạ. ẽiạhiỀệi ÜÁ n hữ ttạ nụưồi tkản i. đ ã giáp, đs^ đmiạ, úiỈM. tồ i ữế ntợi tn ặ l qxiá. tífinh kjỢ^ tậfL ữà L àn t k h ô ú . lu ậ n , i ụ i tr ư è n g , ^ ẹ ù k ạ tt nữ ưốíi '3ÔCL Q lệ í. 'Jôà Qtội, nụăụ. 15 IhÓLttg, 5 năm 200Ó '3ôtư>, tù Ế ềt ^tần Q’hi /Hình OlạỉũíL Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng số liệu Danh mục các hình Đặt vấn đề Phần I. Tổng quan 3 1.1- Tổng quan về Clorpromazin (CPZ) 3 1.1.1- Công thức hoá học 3 1.1.2- Tên khoa học 3 1.1.3- Tính chất 3 1.1.4- Dược lý và cơ chế tác dụng 3 1.1.5- Dược động học 4 1.1.6-Chỉ định 4 1.1.7- Chống chỉ định 5 1.1.8- Thận trọng 5 1.1.9- Liều dùng và cách dùng 5 1.1.10-Các dạng bào chế 6 1.1.11. Các phương pháp định lượng 6 1.2- Tổng quan về HPLC 7 1.2.1- Khái niệm 7 1.2.2- Sắc ký phân bố pha đặc 7 1.2.3-Kỹ thuật HPLC 8 1.2.4- Hệ thống máy HPLC ỉ 0 1.2.5- Các phương pháp định lượng bằng HPLC 10 1.3- Một vài phương pháp nghiên cứu định lượng CPZ bằng HPLC 12 MỤC LỤC 1.4- Thẩm định phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học 14 1.4.1- Khái niệm 14 1.4.2- Nội dung thẩm định 14 Phần n . Điều kiện thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu 17 2.1- Điều kiện thực nghiệm 17 2.2- Nội dung và phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1- Chuẩn bị mẫu 18 22.2- Khảo sát và tìm điều kiện chiết CPZ trong huyết tương 19 2.2.3- Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 21 2.2.4- Thẩm định phương pháp phân tích 21 Phần in . Kết quả thực nghiệm và bàn luận 24 3.1- Xây dựng phương pháp định lượng 24 3.1.1- Khảo sát tìm điều kiện để chiết CPZIHT 24 3.1.2- Khảo sát và xây dựng điều kiện sắc ký 26 3.1.3- Thẩm định phương pháp phân tích 32 3.2- Bàn luận 39 Phần IV. Kết luận và đề xuất 43 4.1- Kết luận 43 4.2- Đề xuất 44 Tài liệu tham khảo Phụ lục DANH MỤC CÁC CHỮ VIÊT TẮT CPZ : Clorpromazin CBZ : Carbamazepin HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao HT : Huyết tương IS : Chất chuân nội ( intemai Standard) l^g ; Microgam |Lim : Micromet 1^1 : Microlit MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol PA : Tinh khiết phân tích STT : Số thứ tự SK : Sắc ký DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 1 Một số nghiên cứu định lượng CPZ bằng HPLC 13 2 Danh mục hoá chất, chất chuẩn, thuốc thử 18 3 Kết quả khảo sự phù hợp của hệ thống sắc ký 31 4 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 34 5 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 36 6 Kết quả khảo sát độ tái lặp 36 7 Kết khảo sát độ đúng 37 8 Kết quả khảo sát độ ổn định trong thời gian phân tích 38 9 Kết qủa khảo sát độ ổn định trong thòi gian bảo quản 39 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Hình Nội dung Trang 1 2.1 Sơ đồ quy trình chiết CPZ trong huyết tương 20 2 3.1 Sắc đồ lựa chọn điều kiện chiết CPZ trong huyết tưcỉng 25 3 3.2 Sắc đồ khảo sát cột sắc ký cho phân tích CPZ trong huyết tương 27 4 3.3 Sắc đồ lựa chọn dung môi pha động 28 5 3.4 Phổ hấp thụ u v của CPZ trong dung môi pha động 29 6 3.5 Sắc đồ khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội 30 7 3.6 Sắc đồ khảo sát tính chọn lọc của phương pháp 33 8 3.7 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tỷ lệ diện tích CPZ/CBZ và nồng độ CPZ trong huyết tương 35 ĐẶT VẤN ĐỂ Hiện nay, trong điều trị bệnh tâm thần ở nước ta, chỉ định liều dùng chủ yếu dựa vào sự đáp ứng của thuốc với người bệnh và các triệu chứng trên lâm sàng, kinh nghiệm điều trị của bác sỹ. Biệt dược "Aminazin" có hoạt chất là Clorpromazin hydroclorid là một dẫn chất của phenothiazin với tác dụng chính là hướng thần, ngoài ra còn có tác dụng an thần, chống nôn, kháng histamin và kháng serotonin. Cũng như các thuốc hướng thần khác, Clorpromazin có cơ chế tác dụng phức tạp hay gặp trường hợp ngộ độc thuốc, hcfn nữa trong thực tế điều trị các thể thường thể hiện rất rõ và phức tạp, các bệnh nhân khác nhau có đáp ứng khác nhau với thuốc. Vì vậy phải theo dõi sát sao trong quá trình điều trị. Để đạt được kết quả tốt và hạn chế những tai biến có thể xảy ra khi dùng thuốc và tìm cho mỗi bệnh nhân một liều điều trị phù hợp, cần phải theo dõi thường xuyên nồng độ thuốc trong máu bệnh nhân. Các phương pháp phân tích hay dùng để xác định nồng độ thuốc trong dịch sinh học là sắc ký lỏng hiệu năng cao^HPLQ, sắc ký khí, sắc ký khí gắn vói khối phổ, điện di mao quản Trong đó, HPLC đặc biệt là HPLC pha đảo vói detector u v là phương pháp hay được dùng hơn cả do tính ưu việc nổi trội về độ nhạy, tính chính xác, độ chọn lọc, tính kinh tế. Để có một quy trình dùng HPLC đảm bảo độ tin cậy để phân tích thuốc trong dịch sinh học, chúng ta khảo sát các điều kiện sắc ký thích hợp như: cột; dung môi pha động; lưu lượng dòng; bước sóng, quy trình xử lý mẫu, khoảng nồng độ khảo sát, Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Aminaùn trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao" Với muc tiêu: - Xây dựng điều kiện phân tích thích hợp để định lượng Aminazin trong huyết tương với quy trình chiết cho hiệu suất cao, quy trình sắc ký, khả năng tách, định tính và định lượng đồng thời loại phần lớn tạp cản trở trong mẫu phân tích. - Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng, từ đó đề ra quy trình phân tích thường quy để định lượng Aminazin trong huyết tương. Chúng tôi hy vọng rằng kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở ứng dụng để xác định và đánh giá tương đưofng sinh dược học của Aminazin. PHẦN I. TỔNG QUAN 1.1- Tổng quan vê Clorpromazin (CPZ) Biệt dược Aminazin có hoạt chất là Clorpromazin dùng dưói dạng muối: Clorpromazin hydroclorid. 1.1.1- Công thức hoá học: [2][3][6] - Công thức phân tử: C17H19CIN2S. HCl; M = 355,5. - Công thức cấu tạo: 0 1-|, .HCl 1.1.2- Tên khoa học: [3][6] 2-Cloro - 10 - (3- Dimethylamino propyl) -phenothiazin hydroclorid. 1.1.3- Tính ctó;[3][6] Bột kết tinh trắng hoặc trắng ngà, dễ hút ẩm, bị phân hủy khi tiếp xúc với ánh sáng, không khí. Rất dễ tan trong nước (1:1), tan trong ethanol, loroform, không tan trong ether. Nóng chảy ở khoảng 196°c. Hấp thụ ư v cho 2 cực đại ở 254 và 306 nm. 1.1.4- Dược lý và cơ chế tác dụng: [2] [6] Clorpromazin là dẫn chất của phenothiazin với tác dụng chính là hướng thần, ngoài ra thuốc có tác dụng an thần, chống nôn, kháng histamin và kháng serotonin. * Trên thẩn kinh trung ương. - Tác dụng chính là an thần, chống rối loạn tâm thần thể hưng cảm, làm giảm hoang tưởng ảo giác thao cuồng, vật vã, làm mất các ý nghĩ kỳ lạ, tạo cảm [...]... 1.2.5- Các phương pháp định lượng bằng HPLC: [1][4] Tất cả các phép định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với diện tích hoặc chiều cao của chất phân tích Có 3 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký * Phương pháp chuẩn ngoại: 10 Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả 2 mẫu thử và chuẩn đều được sắc ký trong cùng điều kiện... Trong phân tích sinh dược học người ta hay sử dụng các tính kết quả theo phương pháp chuẩn hoá nhiều điểm có dùng chất chuẩn nội 1.3 Một vài phương pháp nghiên cứu định lượng CPZ trong huyết tương Clorpromazin trong dịch sinh học có thể định lượng bằng nhiều phương pháp Nhưng phương pháp HPLC được dùng nhiều hơn cả, Sau đây là một số phưoỉng pháp định lượng CPZ trong huyết tương 12 Bảng 1: Một sô nghiên. .. giây Ly tâm 15 phút Dung dịch trong < - Lọc qua đầu lọc 0,2|j.m Dịch lọc _► chạy sắc ký Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết CPZ trong huyết tương 20 2.2.3 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký [10][12][13][14][16] * Cột sắc ký: khảo sát khả năng tách và định lượng CPZ trong huyết tương trên các cột sắc ký: Cjg; phenyl, để chọn cột cho phù hợp * Pha động: tham khảo khả năng định lượng CPZ trên những hệ pha động... Detector huỳnh quang 1.4- Thẩm định phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học: [1] 1.4.1- Khái niệm: Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu) là quá trình xác định bằng thực nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế Mục đích của thẩm định phương pháp là xác nhận độ tin cậy... 1.1.11- Các phương pháp định lượng: [6][9] Clorpromazin hydroclorid là muối của các base được định lượng bằng các phương pháp * Đối vói nguyên liệu + Phương pháp acid - base trong dung môi là acid acetic khan; dung dịch chuẩn là HCIO4 0,1M phát hiện điểm tương đương bằng đo điện thế hoặc chỉ thị màu [5] [9] + Phương pháp acid base trong dung môi ethanol 96%; dung dịch chuẩn NaOH 0,1M pha trong nước... Hình 3.1: sẳc đồ khảo sát điổu kiện chiết CPZ trong HT 25 3.1.2- Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc kỷ cho định lượng CPZ trong huyết tương: Cột sắc ký: Qua khảo sát trên các cột Cig; phenyl, * , với kích cỡ (hạt nhồi, cột) khác nhau để tách và định lượng CPZ trong huyết tương cho thấy cột CN là phù hợp, có khả năng tách tốt và chọn lọc CPZ trong huyết tương Kết quả khảo sát lựa chọn cột SK được trình... dung lượng k' Quá trình tách trong cột sắc ký là sự tương tác của các chất phân tích với pha tĩnh (nhồi trong cột) dưới tác động của pha động, do đó bản chất của quá trình sắc ký là sự phân bố chất tan giữa 2 pha Sự phân bố này được đặc trưng bằng hệ số dung lượng k k được xác định bằng tỷ số giữa lượng chất tan A trong pha tĩnh và pha động theo công thức sau: k' = * QÁM) Trong đó Qa(S) và Qa(M) là lượng. .. 600 : 200 : 180 Luu lượng dòng là Iml/ phút Bước sóng: 254nm Chuẩn nội: methyl paraben, propyl paraben * Đối vái dịch sinh học: thường dùng phương pháp HPLC, sắc ký khí, điện di mao quản 1.2- Tổng quan về HPLC: 1.2.1-Khái niệm: [4][6] - Sắc ký lỏng hiệu năng cao hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tích các chất trên 1 pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng... hành sắc ký theo điều kiện ở mục 2.2.3 Rồi so sánh vói mẫu được chuẩn bị với 3 nồng độ như trên nhưng trong pha động Độ đúng được tính bằng % đáp ứng thu được của mẫu phân tích trong huyết tương so vói đáp ứng thu được của chất phân tích trong pha động * Khảo sát độ chính xác của phương pháp Độ chính xác được đánh giá bằng độ lặp lại và độ tái lặp của phương pháp phân tích - Độ lặp lại: các mẫu huyết tương. .. chiều cao hay diện tích pic là đặc trưng định lượng của chất phân tích Khi so sánh chiều cao hay diện tích pic trong sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện ta tính được hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử ỉ 2.4- Hệ thống máy HPLC: [4] Máy HPLC gồm các bộ phận sau: - Bình chứa pha động - Bơm cao áp - Bộ phận tiêm mẫu - Cột sắc ký - Detectơ - Bộ phận xử lý số liệu 1.2.5- Các phương pháp . nghiên cứu đề tài: " ;Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Aminaùn trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao& quot; Với muc tiêu: - Xây dựng điều kiện phân tích thích hợp để định. 3 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký. * Phương pháp chuẩn ngoại: 10 Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả 2 mẫu thử và chuẩn đều được sắc ký trong. BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI TRẦN THỊ MINH NGHĨA NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ■ ĐỈNH LƯỢNG AMINAZIN TRONG HUYẾT TUƠNG ĩ ■ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NẢNG CAO ■ (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ KHOÁ 2002-2006) Người