Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng rutin trong chế phẩm phytosome rutin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhằm góp phần tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm.
Tạp chí y - d-ợc học quân số 9-2017 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG RUTIN TRONG PHYTOSOME RUTIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Tơ Hiệu*; Nguyễn Văn Bạch** TĨM TẮT Mục tiêu: xây dựng thẩm định phương pháp định lượng rutin chế phẩm phytosome rutin sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) nhằm góp phần tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm Đối tượng phương pháp: nguyên liệu phytosome rutin Tiến hành định lượng rutin phương pháp HPLC với cột XBrigde C18 (250 x 4,6 mm; μm), detector PDA, bước sóng 255 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 15 μl, pha động acetonitrile-axít formic 0,1% (24:76, tt/tt) Kết quả: phương pháp xây dựng đảm bảo tính đặc hiệu, tính tương thích, độ tuyến tính, khoảng xác định, độ độ xác Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng rutin nguyên liệu phytosome rutin Kết luận: phương pháp định lượng đảm bảo yêu cầu áp dụng để định lượng rutin chế phẩm * Từ khoá: Định lượng rutin; Phytosome rutin; Sắc ký lỏng hiệu cao Develop and Validate Quantificative Method for Rutin in Phytosome Rutin by High Performance Liquid Chromatography Summary Objectives: To develop and validate rutin quantitative determination method in rutin phytosome by high performance liquid chromatography (HPLC) to contribute to product standardization Subjects and methods: Phytosomal rutin material Rutin quantification by HPLC with XBrigde C18 (250 x 4.6 mm; μm), PDA detector, wave length of 255 nm, flow rate of 1.0 mL/min, injection volume of 15 μL, mobile phase acetonitrile - formic acid 0.1% (24:76, v/v) Results: The development method had assured specificity, compatability, linearity and range, accuracy and precision Conclusion: Quantitative method ensures requirements and can be used to quantify rutin in the preparations * Keywords: Rutin quantification; Phytosome rutin; High performance liquid chromatography ĐẶT VẤN ĐỀ Rutin hoạt chất thuộc nhóm flavonoid, sản phẩm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học dược lý cao [1] Nhiều nghiên cứu chứng minh sản phẩm có khả chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư khối u [3] Nhưng rutin có nhược điểm khó tan nước dẫn đến sinh khả dụng Việc nghiên cứu đưa hoạt chất rutin vào hệ thống mang thuốc phytosome để cải thiện hiệu điều trị, đồng thời giảm liều dùng vấn đề có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao [2, 4, 5] * Bệnh viện Quân y 105 - Tổng cục Hậu cần ** Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tô Hiệu (tohieu88@gmail.com) Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 10/11/2017 Ngày báo đăng: 01/12/2017 12 T¹p chÝ y - d-ợc học quân số 9-2017 Nghiờn cu nh lng rutin chế phẩm phytosome rutin quan trọng, góp phần xây dựng công thức bào chế, tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm Có nhiều phương pháp định lượng rutin phương pháp quang phổ hấp phụ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) hay phương pháp cân [2, 7] Tuy nhiên, phương pháp có độ xác khơng cao, sai số định lượng lớn Vì vậy, nghiên cứu: “Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng rutin phytosome rutin HPLC” nhằm góp phần tiêu chuẩn hố chất lượng sản phẩm NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết bị - Phytosome rutin có thành phần phần dược chất rutin phần phospholipid phosphatidyl choline, bào chế phương pháp bốc dung môi Bộ môn Kiểm nghiệm, Trung tâm Đào tạo Nghiên cứu Dược - Hóa chất: acetonitril, methanol, axít formic, nước cất đạt tiêu chuẩn cho HPLC; chất chuẩn rutin (Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP HCM, Việt Nam, 88,2%); hóa chất dung mơi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích - Hệ thống HPLC Water e 2695 (Mỹ) gồm hệ bơm kênh dung môi, auto sample, detector PDA, cột XBrigde C18 (250 x 4,6 mm; μm) + Mẫu trắng: cân xác 125,0 mg phosphatidyl cholin, hòa tan bình định mức 25 ml methanol Hút xác 1,0 ml dung dịch cho vào bình định mức 50 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 μm - Dụng cụ: cân phân tích Mettle Toledo (độ xác 0,1 mg) dụng cụ phân tích đạt tiêu chuẩn thí nghiệm Phƣơng pháp nghiên cứu - Điều kiện sắc ký: + Cột: XBrigde C18 (250 x 4,6 mm; μm); detector UV bước sóng 255 nm; tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; thể tích tiêm 15 μl; pha động; acetonitril - axít formic 0,1% (theo gradient thể tích) - Chuẩn bị mẫu [8, 9]: + Mẫu chuẩn: cân xác 14,0 mg rutin chuẩn hòa tan bình định mức 25 ml methanol Hút xác 1,0 ml dung dịch cho vào bình định mức 50 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 μm + Mẫu thử: cân xác 68,0 mg chế phẩm phytosome rutin, hòa tan bình định mức 25 ml methanol Hút xác 1,0 ml dung dịch cho vào bình định mức 50 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 μm Dung dịch axít formic 0,1%: hút xác 1,0 ml axít formic đậm đặc pha vào lít nước cất, lọc qua màng lọc 0,45 μm [7] - Thẩm định phương pháp: với tiêu chí tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, độ tuyến tính khoảng xác định, độ độ xác [10] 13 T¹p chÝ y - d-ợc học quân số 9-2017 KT QU NGHIấN CỨU VÀ BÀN LUẬN Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng * Khảo sát bước sóng phân tích: Hình 1: Kết quét phổ hấp thụ Tiến hành quét phổ phân tích mẫu chuẩn dải bước sóng từ 200 - 500 nm Kết cho thấy bước sóng 255 nm, mẫu chuẩn cho độ hấp thụ lớn, đặc trưng cho chất cần phân tích, phù hợp yêu cầu định lượng * Khảo sát tỷ lệ dung môi: 0.08 AU 0.06 0.04 0.02 0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 Minutes Hình 2: Sắc ký đồ mẫu chuẩn tỷ lệ acetonitril-axít formic 24:76 Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn 10 phút với gradient thể tích dung mơi pha động acetonitril-axít formic 0,1% Tại thời điểm bắt đầu, tỷ lệ acetonitril-axít formic (10:90), kết thúc tỷ lệ 40:60 Từ đó, tìm tỷ lệ dung môi pha động đạt yêu cầu phương pháp định lượng Từ kết sắc ký đồ máy, chọn tỷ lệ dung mơi acetonitrile-axít formic 24:76 để sử dụng cho phương pháp định lượng Ở tỷ lệ dung môi này, thời gian lưu chất ngắn nhất, píc cân đối, chất cần phân tích tách 14 Tạp chí y - d-ợc học qu©n sù sè 9-2017 * Khảo sát cột chạy sắc ký: Hình 3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn chạy cột cột SunFire C18 (250 x 4,6 mm; µm) 0.08 AU 0.06 0.04 0.02 0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 nutes XBrigde C18 (250 x 4,6 mm; µm) Hình 4: Sắc ký đồ mẫu chuẩn chạy trênMicột Tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn hai hệ thống cột khác cột XBrigde C18 (250 x 4,6 mm; µm) cột SunFire C18 (250 x 4,6 mm; µm) Kết ghi nhận sắc ký đồ cho thấy sắc ký đồ chạy cột SunFire C18 (250 x 4,6 mm; µm), píc chất chuẩn khơng tách khỏi tạp, chạy cột XBrigde C18 (250 x 4,6 mm; µm), píc tách khỏi tạp Do vậy, nghiên cứu chọn cột XBrigde C18 (250 x 4,6 mm; µm) làm cột chạy sắc ký cho phương pháp Từ điều kiện khảo sát xây đựng điều kiện hệ thống sắc ký định lượng rutin chế phẩm phytosome rutin HPLC sau: + Cột: XBrigde C18 (250 x 4,6 mm; μm) + Detector UV bước sóng 255 nm + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Thể tích tiêm: 15 μl + Pha động: acetonitrile-axớt formic 0,1% (24:76) 15 Tạp chí y - d-ợc häc qu©n sù sè 9-2017 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng * Tính đặc hiệu: Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu trắng Sắc ký đồ mẫu thể hình 5, hình hình Hình 5: Sắc ký đồ mẫu trắng 0.08 AU 0.06 0.04 0.02 0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 4.00 4.50 5.00 5.50 Minutes Hình 6: Sắc ký đồ mẫu thử 0.08 AU 0.06 0.04 0.02 0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 Minutes Hình 7: Sắc ký mu chun 16 5.50 Tạp chí y - d-ợc häc qu©n sù sè 9-2017 Kết sắc ký đồ cho thấy mẫu thử cho píc rutin có thời gian tương ứng với thời gian lưu píc rutin mẫu chuẩn Píc rutin mẫu thử cân đối, tách hồn tồn khỏi píc tạp Đồng thời mẫu trắng khơng thấy xuất píc có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu rutin mẫu chuẩn mẫu thử Vì vậy, phương pháp đảm bảo yêu cầu tính đặc hiệu * Tính tương thích hệ thống: Tiến hành tiêm lặp lại lần dung dịch rutin chuẩn có nồng độ khoảng 25 μg/ml vào hệ thống sắc ký Bảng 1: Kết đánh giá tính tương thích hệ thống sắc ký Số thứ tự Thời gian lƣu píc (phút) Diện tích píc (mAU.s) Hệ số bất đối xứng Số đĩa lý thuyết 4,543 596086 1,26 9538 4.551 596905 1,25 9417 4,541 596407 1,26 9481 4,545 598416 1,25 9370 4,544 597852 1,24 9471 4,547 559130 1,23 9465 Trung bình 4,545 590799 1,24 9488 RSD % 0,1 2,6 Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu diện tích píc mẫu chuẩn rutin 0,1% 2,6% Hệ số bất đối xứng píc rutin 1,24 (đạt yêu cầu < 2), số đĩa lý thuyết 9.488 (đạt yêu cầu > 3.000) Như vậy, phương pháp phân tích hồn tồn phù hợp với hệ thống sắc ký * Độ tuyến tính khoảng xác định: Pha dãy nồng độ dung dịch rutin chuẩn pha động có nồng độ từ 10 - 35 μg/ml [3] Tiến hành sắc ký dung dịch theo điều kiện sắc ký nêu Bảng 2: Kết khảo sát tuyến tính phương pháp định lượng rutin Số thứ tự Nồng độ rutin (μg/ml) Diện tích píc (mAU.s) 10 424802 15 470666 20 559130 25 596086 30 638760 35 716597 17 T¹p chí y - d-ợc học quân số 9-2017 Hỡnh 8: Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính nồng độ diện tích píc rutin Trong khoảng nồng độ khảo sát, có tương quan tuyến tính chặt nồng độ rutin diện tích píc với hệ số tương quan R2 = 0,9865 Khoảng tuyến tính phù hợp để định lượng rutin phytosome rutin * Độ đúng: Tiến hành thêm chuẩn vào mẫu trắng để thu dung dịch mẫu tự có nồng độ 20, 25, 30 μg/ml, nồng độ tiến hành mẫu riêng biệt Tiến hành định lượng mẫu chuẩn có nồng độ tương ứng, mẫu tiêm lần Bảng 3: Kết khảo sát độ phương pháp định lượng rutin STT Nồng độ rutin ban đầu (μg/ml) Diện tích píc (mAU.s) Nồng độ rutin thu hồi (μg/ml) Tỷ lệ thu hồi 20,03 539446 20,03 100,00 20,45 544247 20,45 100,00 20,18 541160 20,18 100,00 25,35 600254 25,34 99,96 25,44 601282 25,43 99,96 25,28 599453 25,27 99,96 30,15 655118 30,14 99,97 30,47 658775 30,46 99,97 30,05 653975 30,04 99,97 Trung bình 99,98 RSD (%) 0,018 Phương pháp có độ thu hồi từ 99,96 - 100,0% Do đó, phương pháp đạt yêu cầu độ 18 T¹p chÝ y - d-ợc học quân số 9-2017 * chớnh xỏc: Độ xác phương pháp định lượng xác định định lượng mẫu thử điều kiện sắc ký trên, lần ngày ngày khác Bảng 4: Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp định lượng rutin (n = 6) Mẫu Diện tích píc (mAU.s) Ngày Diện tích píc (mAU.s) 592731 598301 596086 600652 601324 601982 602982 603721 608451 596523 603791 604865 X 600894 X 598301 RSD (%) 0,94 RSD (%) 0,53 Phương pháp có độ lặp lại cao với giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD = 0.94 0,53 (đạt yêu cầu < 2%) KẾT LUẬN - Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng rutin HPLC với điều kiện sắc ký: cột XBrigde C18 (250 x 4,6 mm; μm), detector UV bước sóng 255 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 15 μl, pha động; acetonitrile-axít formic 0,1% (24:76) Bộ Y tế Dược điển Việt Nam IV NXB Y học 2009 Devendra S, M.S.M Rawat, Ajay S, Mona S Rutin-phospholipid complex: an innovative technique in novel drug delivery system - NDDS Current Drug Delivery 2012, pp.305-314 Anupama S, Vikas A S, Manjeet S et al Phytosome: drug delivery system for polyphenolic phytoconstituents Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences 2011, (4), pp.209-219 Patel A, Tanwar Y.S, Suman R et al Phytosome: phytolipid drug dilivery system for improving bioavailability of herbal drug Journal of Pharmaceutical Science and Bioscientific Research 2013, 2, pp.51-57 Ayşegül K, Fatih T Phyto-phospholipid complexes as drug delivery system for herbal extracts/molecules Turk J Pharm Sci 2015, 12 (1), pp.93-102 V Dighe, D Mestry Simultaneous quantification of rutin and isoquercitrin from Jasminum Sambac AIT, by high performance thin layer chromatography Internation Journal of Pharmaceutical Siences and Research 2012, pp.2086-2092 Yu Guo, Li-xian Shen1, Yan-feng Lu, Hai-yanLi, Ke Min, Lan-fang Li, Cui-yun Yu, Xing Zheng Preparation of rutin-liposome drug delivery systems and evaluation on their in vitro antioxidant activity Chinese Herbal Medicines 2016, pp.371-375 - Đã thẩm định phương pháp có tính tương thích, độ đặc hiệu, độ tuyến tính khoảng xác định, độ độ xác cao Yao Huang, Fang Feng, Jie Jiang, Ying Qiao, Tao Wu, Josef Voglmeir, ZhiGang Chen Green and efficient extraction of rutin from tartary buckwheat hull by sing natural deep eutectic solvents Food Chemistry 2016, pp.1-24 TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 US Department of Health and Human Services Food and drug evaluation and reseach Guidance for Industry - bioanalytical method validation 2001 Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội Bài giảng Dược liệu NXB Y học Hà Nội 2004, tr.279-293 19 ... (UV-Vis) hay phương pháp cân [2, 7] Tuy nhiên, phương pháp có độ xác khơng cao, sai số định lượng lớn Vì vậy, chúng tơi nghiên cứu: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng rutin phytosome rutin HPLC”... Nghiên cứu định lượng rutin chế phẩm phytosome rutin quan trọng, góp phần xây dựng cơng thức bào chế, tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm Có nhiều phương pháp định lượng rutin phương pháp quang... XBrigde C18 (250 x 4,6 mm; µm) làm cột chạy sắc ký cho phương pháp Từ điều kiện khảo sát xây đựng điều kiện hệ thống sắc ký định lượng rutin chế phẩm phytosome rutin HPLC sau: + Cột: XBrigde C18 (250