Xây dựng quy trình định lượng metthotrexat trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với dầu dò dãy diod quang (hplc pda)

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Y D NG Y TR NH Đ NH ƯỢNG M THOTR AT TRONG H YẾT TƯ NG B NG CK NG HIỆ N NG CAO V I Đ D D Y DIOD ANG (HPLC-PDA) Mã số: Chủ nhiệm đề tài: D Nguyễn Thanh Tuyền Tp Hồ Chí Minh, 10/2018 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Y D NG Y TR NH Đ NH ƯỢNG M THOTR AT TRONG H YẾT TƯ NG B NG CK NG HIỆ N NG CAO V I Đ D D Y DIOD ANG (HPLC-PDA) Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) DS Nguyễn Thanh Tuyền Tp Hồ Chí Minh, 10/2018 DANH ÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨ ĐỀ TÀI VÀ Đ N V PHỐI HỢP CHÍNH Thành viên tham gia nghiên cứu Nguyễn Thanh Tuyền Đơn vị phối hợp Bộ mơn Sinh hóa, khoa Dược, ĐH Y Dược TL.HCM M C C Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED DANH MỤC BẢNG VIII DANH MỤC HÌNH IX CHƯƠNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 METHOTREXAT 2.1.1 Cấu trúc hóa học 2.1.2 Tính chất 2.1.3 Dược lý chế tác động 2.1.4 Dược động học 2.1.5 Chỉ định 2.1.6 Chống định 2.1 Th n trọng .5 2.1.8 Tác dụng không mong muốn 2.2 ĐỘC TÍNH CỦA METHOTREXAT 2.2.1 Nồng độ gây độc Methotrexat 2.2.2 Theo d i điều trị v i HDMT 2.3 HƯƠNG H SẮC L NG HIỆU NĂNG CAO 2.3.1 Cấu t o 2.3.2 Các thông số đặc trưng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 2.3.3 ng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 12 2.4 HÂN TÍCH HOẠT CHẤT TRONG DỊCH SINH HỌC 14 2.4.1 hương pháp xử lý mẫu .14 2.4.2 hương pháp chuẩn hóa v i nội chuẩn 15 2.5 Đ NH GI QUY TRÌNH HÂN TÍCH 16 2.5.1 Tính tương thích hệ thống 16 2.5.2 Thẩm định uy tr nh phân tích 16 2.6 MỘT VÀI NGHI N C U LI N QUAN ĐỊNH LƯ NG METHOTRE AT TRONG DỊCH SINH HỌC 18 CHƯƠNG HƯƠNG H NGHI N C U 21 3.1 NGUY N LIỆU - TRANG THIẾT BỊ 21 3.1.1 Nguy n v t liệu 21 3.1.2 Trang thiết ị 21 3.2 Đ I TƯ NG NGHI N C U 22 3.3 HƯƠNG H NGHI N C U 22 3.3.1 Chuẩn ị dung dịch chuẩn dung dịch đệm .22 3.3.2 h o sát điều kiện sắc ký H LC 23 3.3.3 ây d ng đư ng chuẩn .24 3.3.4 h o sát uy tr nh xử lý mẫu 24 3.3.5 Thẩm định phương pháp định lượng 27 CHƯƠNG ẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29 4.1 HẢO S T ĐI U IỆN SẮC H LC 29 4.1.1 h o sát pha động 29 4.1.2 Bư c sóng hấp thu 32 4.1.3 Tính tương thích hệ thống 33 4.1.4 ết u d đoán ph m vi định lượng 34 4.2 ĐI U IỆN L M U 35 4.3 TH M ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯ NG MT TRONG HUYẾT TƯƠNG B NG H LC-PDA 38 4.3.1 Tính đặc hiệu 38 4.3.2 Tính tuyến tính – đư ng chuẩn 41 4.3.3 Gi i h n định lượng dư i LLOQ 43 4.3.4 Độ độ xác .44 4.3.5 Hiệu suất chiết 47 CHƯƠNG ẾT LUẬN VÀ Đ NGHỊ .48 TÀI LIỆU THAM HẢO 49 HỤ LỤC 51 HỤ LỤC S LIỆU TH NG KÊ 51 DANH M C CHỮ VIẾT T T STT Ch t t Ch nguyên 7OHMTX 7-hydroxymethotrexate 7-hydroxymethotrexat AMTX Areas methotrexate Diện tích pic methotrexat APAAP Areas p-aminoacetophenone AMTX/PAAP AS-MTX Hệ số k o đuôi MT AS-PAAP Hệ số k o đuôi AA CMTX Nồng độ methotrexat DNA ngh a Diện tích pic paminoacetophenon T lệ diện tích pic MT tr n PAAP Deoxyribonucleic acid Đ Acid deoxyribonucleic Điều kiện Enzyme multiplied immunoassay thu t miễn dịch đa en ym 10 EMIT 11 FPIA 12 HDMTX 13 HPLC 14 IS Internal standard Nội chuẩn 15 LLOQ Lower Limit of Quantification Gi i h n định lượng dư i 16 LV Lecovorine Lecovorin 17 MTX Methotrexate Methotrexat 18 PAAP Para-aminoacetophenone Para-aminoaetophenon technique Fluorescence polarization hương pháp miễn dịch immunoassay huỳnh uang phân c c High-dose methotrexate Liều cao methotrexat High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao 19 PDA Detector diode array Đ u d d y diod uang 20 RS Resolution Độ phân gi i 21 SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn 22 TB Trung nh DANH M C BẢNG Trang B ng 2.1 Nh ng phương pháp định lượng MT ng H LC tr n gi i 18 B ng 3.1 Danh sách hóa chất, dung mơi sử dụng uá tr nh nghi n c u 21 B ng 3.2 Các thiết ị sử dụng nghi n c u 21 B ng 3.3 Các điều kiện phân tích sắc ký kh o sát 23 B ng 3.4 Các điều kiện chiết kh o sát 27 B ng 4.1 ết u kh o sát c sóng độ hấp thu MT AA 32 B ng 4.2 ết u đánh giá tính ph hợp hệ thống v i mẫu chuẩn 33 B ng 4.3 Mối li n uan nồng độ MT v i diện tích pic MT AA 34 B ng 4.4 ết u kh o sát hiệu suất chiết điều kiện xử lý mẫu 35 B ng 4.5 Mối tương uan gi a diện tích MT v i t lệ diện tích MT AA 42 B ng 4.6 ết u đánh gi độ độ xác gi i h n định lượng dư i43 B ng ết u đánh giá độ độ xác ngày 45 B ng 4.8 ết u đánh giá độ độ xác khác ngày 46 B ng Hiệu suất chiết MT 47 DANH M C H NH Trang H nh 2.1 Cơng th c hóa học Methotrexat H nh 2.2 Cơ chế tác dụng MTX H nh 2.3 Hư ng dẫn dược động Lecovorin đ gi i độc sau d ng HDMT H nh 2.4 Sơ đồ khối hệ thống HPLC H nh 2.5 H nh minh họa pic chất phân tích 11 H nh 3.1 Sơ đồ tóm tắt uy tr nh chiết MT AA tr n cột S E 26 H nh 4.1 Sắc ký đồ MT AA v i pha động methanol-nư c (50:50, v/v) Đ 30 H nh 4.2 Sắc ký đồ MT AA v i pha động methanol-nư c (25:75, v/v) Đ 30 H nh 4.3 Sắc ký đồ MT AA v i pha động methanol-nư c acid pH 3, (30:70, v/v) Đ 30 H nh 4.4 Sắc ký đồ MT AA v i pha động methanol-đệm triethylamonium pH 6,0 (20:80, v/v) Đ 31 H nh 4.5 Sắc ký đồ MT ACN AA v i pha động đệm H2PO4 (pH 6,0) : MeOH : :2 :1 , v v v Đ 31 H nh 4.6 Sắc ký đồ MT AA v i pha động đệm H2PO4 (pH 6,0) : ACN :1 , v v Đ 31 H nh Sắc ký đồ MT :2 , v v Đ AA v i pha động đệm H2PO4 (pH 6,0) : MeOH 32 H nh 4.8 h hấp thu UV chuẩn MT AA 33 H nh Đư ng i u diễn mối li n uan gi a nồng độ MT v i t lệ diện tích pic MTX/PAAP 35 H nh 4.1 Sắc ký đồ tương ng Đ chiết 36 H nh 4.11 Sắc ký đồ tương ng Đ chiết 36 H nh 4.12 Sắc ký đồ tương ng Đ chiết 37 H nh 4.13 h UV sắc ký đồ i u diễn độ tinh khiết pic MT huyết tương 37 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 42 B ng 4.5 Mối tương uan gi a iện tích MT v i t lệ iện tích MTX/PAAP Nồng độ MT ppm AMTX/PAAP Độ lệch 0,5 0,1258 1,8 0,3408 11,5 1,7993 4,6 10 3,5292 1,1 15 4,9915 5,1 20 6,9266 1,5 25 9,0254 2,5 Đư ng i u diễn mối tương uan gi a t lệ diện tích pic MT tr n PAAP v i nồng độ MT tương ng tr nh ày h nh 4.24 H nh 4.24 Đư ng i u iễn s tương uan gi a nồng độ MT v i t lệ iện tích pic MTX/PAAP tương ứng - Trắc nghiệm t phân phối student : ki m tra ý ngh a hệ số hồi uy Pa = 6,83×10-8 , 5: Hệ số a có ý ngh a thống k Pb = 0,61 > , 5: hệ số - Trắc nghiệm khơng có ý ngh a thống k phân phối isher : ki m tra tính tương thích phương tr nh hồi quy: F = 6,83×10-8 , 5: phương tr nh hồi uy có tính tương thích - Nh n x t: đư ng chuẩn v i giá trị R2 = 0,9979 m c độ tương uan cao tất c m tr n đư ng chuẩn có độ kho ng 85-115 Trong kho ng nồng độ Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 43 đ kh o sát có s tương uan tuyến tính gi a nồng độ MT huyết tương t lệ diện tích pic MT - PAAP thu ết lu n: phương tr nh tuyến tính nồng độ MT diện tích pic MT PAAP có d ng y 4.3.3 Gi i h n định lượng i i m tra huyết tương theo t lệ ,3454x, kho ng tuyến tính từ ,5-25 ppm O ng th c nghiệm: Tiến hành sắc ký mẫu trắng mẫu chuẩn có nồng độ MT ,5 pm v i mẫu độc l p ết u xác định gi i h n định lượng dư i LLOQ phương pháp tr nh ày ng 4.6 B ng 4.6 Kết u đánh gi độ độ xác gi i h n định lượng i Nồng độ Mẫu AMTX t t o APAAP AMTX/PAAP t m thấy (ppm) Độ (%) 17876 139471 0,1282 0,5156 103,11 17255 142927 0,1207 0,4740 94,79 17435 127754 0,1365 0,5184 103,68 17521 139270 0,1258 0,4883 97,66 17351 138865 0,1249 0,4859 97,18 17765 133984 0,1326 0,5075 101,49 Nh n x t: c ký đồ m u chuẩn nồng độ O xác RSD %) H nh 4.25 Độ 3,63 0,5 ppm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 44 - Tr n sắc ký đồ mẫu trắng th i gian 2,1 phút có tính hiệu nhiễu , - Tr n sắc ký đồ mẫu chuẩn ch a MT , ,5 ppm, tín hiệu pic 18 gấp l n tín hiệu mẫu trắng, cho t số S N th i gian 2,1 phút l n, kết u đ t độ độ xác theo uy định - ết lu n: V y nồng độ ,5 ppm xác nh n gi i h n định lượng dư i LLOQ phương pháp S N >6 Độ độ xác MT n m gi i h n cho ph p RSD nồng độ ,5 ppm , n n đ t y u c u 4.3.4 Độ độ xác ết u kh o sát độ độ xác ngày khác ngày tr nh ày ng 4.7 4.8 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 45 B ng 4.7 Kết u đánh giá độ độ xác ngày CMTX (ppm) 0,5 Nồng độ AMTX APAAP AMTX/PAAP t m thấy (ppm) (%) (%) 139471 0,1287 0,5156 103,11 3,11 17255 142927 0,1207 0,4946 94,79 5,21 17521 139270 0,1258 0,5089 97,66 2,34 17351 138865 0,1249 0,5065 97,18 2,82 17765 133984 0,1326 0,5280 101,49 1,49 0,4942 SD 0,0169 RSD (%) 3,4257 503296 149665 3,3628 9,6401 96,40 3,60 490520 154172 3,1816 9,1290 91,29 8,71 502049 147179 3,4111 9,7764 97,76 2,24 499963 134084 3,8211 10,9328 109,33 9,33 496290 145023 3,4221 9,8075 98,07 1,93 TB 9,8572 SD 0,6601 RSD (%) 6,6971 20 Độ lệch 17876 TB 10 Độ 927633 145791 6,3628 18,1026 90,51 9,49 993654 149636 6,6405 18,8860 94,43 5,57 955559 144707 6,6034 18,7814 93,91 6,09 984016 138644 7,0974 20,1750 100,87 0,87 990134 127088 7,7909 22,1313 110,66 10,66 TB 19,6152 SD 1,5937 RSD (%) 8,1246 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 46 B ng 4.8 Kết u đánh giá độ độ xác khác ngày n đo Nồng độ th c (ppm) Ngày Nồng Độ độ t m thấy xác (ppm) (%) Ngày Độ (%) Nồng Độ độ t m thấy xác (ppm) (%) Ngày Độ (%) Nồng Độ độ t m thấy xác (ppm) (%) Độ (%) 0,52 103,1 0,49 98,0 0,44 88,0 0,47 94,8 0,47 93,5 0,41 81,9 97,7 0,47 94,7 0,43 0,5 0,49 2,43 4,49 3,61 85,6 0,49 97,2 0,48 96,8 0,41 81,0 0,51 101,5 0,44 87,1 0,43 86,8 TB 0,49 98,9 0,47 94,0 0,42 84,7 9,64 96,4 10,92 109,2 10,53 105,3 9,13 91,3 9,44 94,4 9,64 96,4 97,8 9,43 94,3 10,55 10 9,78 6,70 7,21 5,29 105,5 10,93 109,3 10,38 103,8 9,37 93,7 9,81 98,0 9,32 93,2 9,90 99,0 TB 9,74 97,4 9,90 99,0 10,00 100,0 18,10 90,5 18,80 94,0 21,19 106,0 18,89 94,4 18,98 94,9 20,92 104,6 93,9 20,36 101,8 18,94 20 18,78 8,12 4,36 5,79 94,7 20,18 100,9 19,98 99,9 20,51 102,5 22,13 110,7 18,36 91,8 18,68 93,4 TB 19,62 98,1 19,30 96,5 20,05 100,2 Đ t Đ t Nồng độ MTX (ppm) R D ngày Độ trung nh ngày Đ t Đ t Đ t Đ t 0,5 10 20 7,50 6,00 6,05 Đ t 92,5 99,2 98,3 Đ t Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 47 Nh n x t: kho ng nồng độ kh o sát, độ ngày khác ngày n m nồng độ LLOQ, ngày khác ngày v i giá trị RSD 15 nồng độ c n l i Độ xác nồng độ LLOQ RSD 15 nồng độ c n l i ết lu n: Quy tr nh phân tích có độ xác độ đ t y u c u 4.3.5 Hiệu suất chiết ết u kh o sát hiệu suất chiết MT mẫu chuẩn có nồng độ ,5 ppm, ppm, 25 ppm theo uy tr nh chiết tr nh ày ng B ng 4.9 Hiệu suất chiết MT Hiệu suất chiết n đo MT nồng độ 0,5 ppm 10 ppm 20 ppm 68,76 85,07 79,28 72,03 82,84 83,51 69,44 78,05 77,79 TB 70,08 81,98 80,19 ết lu n: nồng độ kh o sát, có hiệu suất chiết MT kho ng từ tr lên Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 48 CHƯ NG KẾT ẬN VÀ ĐỀ NGH Kết lu n Qua tháng th c đề tài nghi n c u từ kết u th c nghiệm thu được, đ đ t nh ng kết u theo mục ti u đ đề sau ây d ng uy tr nh chiết xuất MT từ huyết tương ng phương pháp chiết SPE ây d ng uy tr nh định lượng MT huyết tương ng H LC- DA có sử dụng nội chuẩn AA Quy tr nh đ thẩm định đ t ti u chí uy định theo DA [30] độ đặc hiệu, tính tuyến tính, hiệu suất chiết, độ độ xác Gi i h n định lượng dư i phương pháp ,5 ppm Đề nghị Do th i gian nghi n c u có gi i h n n n ph n nghi n c u độ n định chưa th c Chúng đề nghị: - h o sát độ n định ngắn h n 24-48 gi huyết tương dịch chiết - dài h n > tháng MT nhiệt độ ph ng nhiệt độ o u n - 20 oC) ng dụng uy tr nh định lượng MT đ xây d ng tr n số mẫu huyết tương ệnh nhân điều trị ng MT nh m tối ưu hóa hiệu u điều trị đồng th i gi m độc tính MT tr n nh ng đối tượng Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 49 TÀI IỆ THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ Y Tế , Dược Thư Quốc Gia Việt Nam, METHOTRE AT Bộ Y Tế 13 , h n t h (t ), N B Y Học, Hà Nội, tr 154-174, 187200, 238-262 Bộ Y Tế 14 , n h th , N B Giáo Dục Việt Nam, Hà Nội, tr 135-180 Tài liệu tiếng nư c 10 11 12 13 14 15 16 Abelson H T et al (1983), "Methotrexate-induced renal impairment: clinical studies and rescue from systemic toxicity with high-dose leucovorin and thymidine", Journal of Clinical Oncology (3), pp 208-216 Aboleneen H et al (1996), "Determination of methotrexate in serum by highperformance liquid chromatography", Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 681 (2), pp 317-322 Al-Turkmani M R et al (2010), "Difficulty Measuring Methotrexate in a Patient with High-Dose Methotrexate–Induced Nephrotoxicity", Clinical chemistry 56 (12), pp 1792-1794 Albertioni F et al (1996), "Evaluation of clinical assays for measuring highdose methotrexate in plasma", Clinical chemistry 42 (1), pp 39-44 Asselin B L et al (2011), "Effectiveness of high-dose methotrexate in T-cell lymphoblastic leukemia and advanced-stage lymphoblastic lymphoma: a randomized study by the Children's Oncology Group (POG 9404)", Blood 118 (4), pp 874-883 Begas E et al (2014), "Simple and reliable HPLC method for the monitoring of methotrexate in osteosarcoma patients", Journal of chromatographic science 52 (7), pp 590-595 Bleyer W A (1977), "Methotrexate: clinical pharmacology, current status and therapeutic guidelines", Cancer treatment reviews (2), pp 87-101 Bleyer W A (1978), "The clinical pharmacology of methotrexate", Cancer 41 (1), pp 36-51 British Pharmacopoeia (2014), monograph 0560 Methotrexate Chabner B A et al (1973), "Threshold methotrexate concentration for in vivo inhibition of DNA synthesis in normal and tumorous target tissues", Journal of Clinical Investigation 52 (8), pp 1804 Cociglio M et al (1995), "Determination of methotrexate and 7hydroxymethotrexate by liquid chromatography for routine monitoring of plasma levels", Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 674 (1), pp 101-110 Dasgupta A (2009), Advances in Chromatographic Techniques for Therapeutic Drug Monitoring, CRC Press, pp 308-309 David S Tatro et al (2003), A to Z Drug Facts, Methotrexate (Amethopterin; MTX) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 50 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Djerassi I (1975), "High-dose methotrexate (NSC-740) and citrovorum and factor (NCS-3590) rescue- ackground and rationale , Cancer chemotherapy reports part program information-supplemant (1), pp 3-6 Ferreri A J et al (2009), "High-dose cytarabine plus high-dose methotrexate versus high-dose methotrexate alone in patients with primary CNS lymphoma: a randomised phase trial", The Lancet 374 (9700), pp 1512-1520 Fotoohi K et al (2005), "Interference of 7-hydroxymethotrexate with the determination of methotrexate in plasma samples from children with acute lymphoblastic leukemia employing routine clinical assays", Journal of Chromatography B 817 (2), pp 139-144 Frei E et al (1980), "High dose methotrexate with leucovorin rescue: rationale and spectrum of antitumor activity", The American journal of medicine 68 (3), pp 370-376 Hammor Y A et al (2013), "Prevention and Management of High Dose Methotrexate Toxicity", Journal of Cancer Science & Therapy Hansen S et al (2011), Introduction to pharmaceutical chemical analysis, John Wiley & Sons, pp 458-464 Lawrenz-Wolf B et al (1993), "[Severe renal impairment of methotrexate elimination after high dose therapy]", Klinische Padiatrie 206 (4), pp 319-326 Moghbel A et al (2010), "High-performance liquid chromatography determination of methotrexate in plasma", Iranian Journal of Pharmaceutical Research, pp 149-152 Nagulu M et al (2010), "Development and validation of rapid and sensitive HPLC method for the determination of methotrexate in human serum", Stamford Journal of Pharmaceutical Sciences (1), pp 8-13 Perazella M A et al (2010), Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy, Seminars in nephrology, Elsevier, pp 570-581 Pui C.-H et al (2009), "Treating childhood acute lymphoblastic leukemia without cranial irradiation", New England Journal of Medicine 360 (26), pp 2730-2741 Relling M V et al (1994), "Patient characteristics associated with high-risk methotrexate concentrations and toxicity", Journal of Clinical Oncology 12 (8), pp 1667-1672 Stark A N et al (1989), "Severe renal toxicity due to intermediate-dose methotrexate", Cancer chemotherapy and pharmacology 24 (4), pp 243-245 F.D.A (2001), U.S Department of Health and Human Services Guidance for industry, Bioanalytical method validation Widemann B C et al (2006), "Understanding and managing methotrexate nephrotoxicity", The oncologist 11 (6), pp 694-703 Widemann B C et al (1997), "Carboxypeptidase-G2, thymidine, and leucovorin rescue in cancer patients with methotrexate-induced renal dysfunction", Journal of Clinical Oncology 15 (5), pp 2125-2134 Yusuf A et al (2014), "Rapid determination of methotrexate level in human plasma by high performance liquid chromatography",World journal of pharmacy and pharmaceutical sciences (10), pp 125-135 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 51 PH C PH C Ố IỆ THỐNG KÊ Ph l c Tính ph hợp hệ thống n tiêm Th i gian lưu Hệ số k o đu i Diện tích pic MTX PAAP MTX PAAP MTX PAAP 2,330 5,227 1,405 1,134 208522 2,330 5,224 1,373 1,151 2,331 5,225 1,362 2,325 5,222 2,327 AMTX/APAAP RS 655594 0,318 5,863 210491 656984 0,320 5,698 1,146 210309 655809 0,321 5,616 1,367 1,146 211128 657469 0,321 5,552 5,224 1,345 1,152 208256 657098 0,317 5,441 2,316 5,217 1,388 1,146 209464 655678 0,319 5,449 TB 2,327 5,223 1,373 1,146 209695 656439 0,319 5,6 SD 0,006 0,003 0,021 0,006 1145,785 834,536 0,002 0,161 RSD 0,241 0,066 1,524 0,559 0,546 0,127 0,514 2,871 Ph l c D đoán ph m vi định lượng Diện tích pic MTX 4455 13091 28412 63051 324320 639297 1267348 1576556 Nồng độ MT (ppm) 0,2 0,5 10 20 40 50 PAPA 342309 341417 344913 339226 340522 336729 334208 334932 AMTX/PAAP 0,01301 0,03834 0,08237 0,18587 0,95242 1,89855 3,79209 4,70709 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 52 Ph l c Kết u kh o sát quy trình chiết Quy trình QT1 QT2 QT3 Diện tích pic MTX 765182 764455 776048 777500 753291 788304 620294 738676 753597 PAAP 145905 106228 114704 152818 122363 121181 50996 95854 127892 Diện tích pic chuẩn MTX PAAP 1267348 T lệ thu hồi 334208 MTX 60,38 60,32 61,23 61,35 59,44 62,20 48,94 58,29 59,46 Ph l c Mối tương uan gi a iện tích MT PAAP 43,66 31,78 34,32 45,73 36,81 36,26 15,26 28,68 38,27 T lệ thu hồi trung nh MTX PAAP 60,64 36,59 61,00 39,53 55,56 27,40 v i t lệ iện tích MT /PAAP m u chuẩn Nồng độ MTX 0,5 10 15 20 25 AMTX APAAP AMTX/PAAP T lệ hồi ph c 17521 47339 257500 491947 727976 976557 1228087 139270 138918 143114 139394 145843 140987 136070 0,1258 0,3408 1,7993 3,5292 4,9915 6,9266 9,0254 0,5089 1,1153 5,2295 10,1094 14,2344 19,6930 25,6136 Độ lệch (%) 1,8 11,5 4,6 1,1 5,1 1,5 2,5 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 53 SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0,998951 R Square 0,997904 Adjusted R Square 0,997485 Standard Error 0,168885 Observations ANOVA df SS 67,89693 0,142611 68,03954 Coefficients -0,05462 0,354521 Standard Error 0,101885 0,007266 Regression Residual Total Intercept X Variable MS 67,89693 0,028522 t Stat -0,53611 48,79024 Significance F F 2380,487 6,83E-08 P-value 0,614863 6,83E-08 Upper Lower 95% 95% -0,31652 0,207281 0,335843 0,373199 Ph l c Kết u gi i h n định lượng i M u t t o AMTX APAAP AMTX/PAAP 17876 17255 17435 17521 17351 17765 139471 142927 127754 139270 138865 133984 0,1282 0,1207 0,1365 0,1258 0,1249 0,1326 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Nồng độ t m thấy (ppm) 0,5156 0,4740 0,5184 0,4883 0,4859 0,5075 Độ (%) Độ xác R D %) 103,11 94,79 103,68 97,66 97,18 101,49 3,63 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 54 Ph l c Kết u đánh giá độ độ xác ngày CMTX (ppm) SMTX SPAAP SMTX/SPAAP 0,5 17876 17255 17521 17351 17765 139471 142927 139270 138865 133984 0,1287 0,1207 0,1258 0,1249 0,1326 503296 490520 502049 499963 496290 149665 154172 147179 138404 145023 3,3628 3,1816 3,4111 3,6123 3,4221 927633 993654 955559 984016 990134 145791 149636 144707 138644 127088 6,3628 6,6405 6,6034 7,0974 7,7909 TB SD RSD (%) 10 TB SD RSD (%) 20 TB SD RSD (%) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Nồng độ t m thấy (ppm) 0,5156 0,4946 0,5089 0,5065 0,5280 0,4942 0,0169 3,4257 9,6401 9,1290 9,7764 10,9328 9,8075 9,8572 0,6601 6,6971 18,1026 18,8860 18,7814 20,1750 22,1313 19,6152 1,5937 8,1246 Độ (%) Độ lệch (%) 103,11 94,79 97,66 97,18 101,49 98,85 3,11 5,21 2,34 2,82 1,49 96,40 91,29 97,76 109,33 98,07 98,57 3,60 8,71 2,24 9,33 1,93 90,51 94,43 93,91 100,87 110,66 98,08 9,49 5,57 6,09 0,87 10,66 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 55 Ph l c Kết u đánh giá độ độ xác khác Trong ngày CMTX (ppm) 0,5 TB 10 TB 20 TB Nồng độ t m thấy (ppm) Độ (%) 0,5156 0,4946 0,5089 0,5065 0,5280 0,4942 9,6401 9,1290 9,7764 10,9328 9,8075 9,8572 18,1026 18,8860 18,7814 20,1750 22,1313 19,6152 103,11 94,79 97,66 97,18 101,49 98,85 96,40 91,29 97,76 109,33 98,07 98,57 90,51 94,43 93,91 100,87 110,66 98,08 Độ lệch (%) 3,11 5,21 2,34 2,82 1,49 3,60 8,71 2,24 9,33 1,93 9,49 5,57 6,09 0,87 10,66 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Khác ngày Nồng Độ độ t m thấy (%) (ppm) 0,4899 97,98 0,4675 93,49 0,4737 94,73 0,4838 96,76 0,4414 87,14 0,4713 94,02 10,9197 109,20 9,4404 94,40 9,4263 94,36 10,3771 103,77 9,3243 93,24 9,8975 98,98 18,7993 94,00 18,9772 94,89 20,3649 101,82 19,9812 99,91 18,3599 91,80 19,2965 96,48 Độ lệch (%) R D ngày khác ngày 2,02 6,51 5,27 3,24 12,86 4,30 9,20 5,60 5,74 3,77 6,76 6,56 6,00 5,11 1,82 0,09 8,20 6,24 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 56 Ph l c Kết u đánh giá độ độ xác khác 3) Trong ngày CMTX (ppm) Nồng độ t m thấy (ppm) Độ (%) 0,5156 0,4946 0,5089 0,5065 0,5280 0,4942 9,6401 9,1290 9,7764 10,9328 9,8075 9,8572 18,1026 18,8860 18,7814 20,1750 22,1313 19,6152 103,11 94,79 97,66 97,18 101,49 98,85 96,40 91,29 97,76 109,33 98,07 98,57 90,51 94,43 93,91 100,87 110,66 98,08 0,5 TB 10 TB 20 TB Khác ngày Độ lệch (%) 3,11 5,21 2,34 2,82 1,49 3,60 8,71 2,24 9,33 1,93 9,49 5,57 6,09 0,87 10,66 Nồng độ t m thấy (ppm) 0,4401 0,4097 0,4281 0,4051 0,4339 0,4234 10,5279 9,6377 10,5536 9,3737 9,8963 9,9979 21,1910 20,9181 18,9353 20,5097 18,6804 20,0469 Độ (%) 88,02 81,94 85,63 81,03 86,77 84,68 105,28 96,38 105,54 93,74 98,96 99,98 105,95 104,59 94,68 102,55 93,40 100,23 Độ lệch (%) R D ngày khác ngày 11,98 18,06 14,37 18,97 13,23 8,79 5,28 3,62 5,54 6,26 1,04 5,73 5,95 4,59 5,32 2,55 6,60 6,73 Ph l c Kết u hiệu suất chiết n đo Diện tích pic MT chuẩn tương ứng nồng độ 0,5 ppm 23722 10 ppm 630555 20 ppm 1271300 Diện tích pic MT thử nồng độ 0,5 ppm 16311 17086 16473 TB Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 10 ppm 20 ppm 536393 522336 492117 1007862 1061676 988908 Hiệu suất chiết MT nồng độ 0,5 10 20 ppm ppm ppm 68,76 85,07 79,28 72,03 82,84 83,51 69,44 78,05 77,79 70,08 81,98 80,19 ... 2.3 HƯƠNG H SẮC L NG HIỆU NĂNG CAO 2.3.1 Cấu t o 2.3.2 Các thông số đặc trưng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 2.3.3 ng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 12 2.4 HÂN... 4.1 Sắc ký đồ tương ng Đ chiết 36 H nh 4.11 Sắc ký đồ tương ng Đ chiết 36 H nh 4.12 Sắc ký đồ tương ng Đ chiết 37 H nh 4.13 h UV sắc ký đồ i u diễn độ tinh khiết pic MT huyết. .. ng 2.3 PHƯ NG PHÁP CK NG HIỆ N NG CAO 2.3.1 Cấu t o Sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiệu cao (high performance liquid chromatography, HPLC) k thu t sắc ký tách h n hợp tr n cột nhồi đ y h