Xây dựng phương pháp định lượng voriconazol trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc uv)

Để phục vụ cho giám sát điều trị TDM, phương pháp định lượng VCZ trong huyết tương đòi hỏi phải có tính thực tiễn cao, chuẩn bị mẫu đơn giản và nhanh chóng, thời gian phân tích mẫu ngắn,

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHÙNG THỊ HƯỜNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VORICONAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO (HPLC-UV)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2021

HIỆU NĂNG CAO (HPLC-UV) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Khoá luận này được hoàn thành tại Bộ môn Hoá phân tích - Độc chất, trường Đại học Dược Hà Nội dưới sự hướng dẫn của ThS Nguyễn Thị Thuỳ Linh Để hoàn thành đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu đến từ các thầy cô, bạn

bè và gia đình Tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến họ Lời đầu tiên, với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới cô giáo ThS Nguyễn Thị Thuỳ Linh thuộc bộ môn Hoá phân tích - Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội - người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà và ThS Vũ Ngân Bình cùng toàn thể các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên đã giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi nhất trong quá trình tôi thực hiện khoá luận

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, gia đình đã luôn tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Do thiếu sót về kinh nghiệm và thời gian thực hiện nghiên cứu nên đề tài của tôi còn nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô và bạn

bè để đề tài hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 16 tháng 5 năm 2021

Sinh viên

Phùng Thị Hường

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về Voriconazol 3

1.1.1 Công thức cấu tạo, tính chất lý hóa của Voriconazol 3

1.1.2 Cơ chế kháng nấm của Voriconazol 3

1.1.3 Chỉ định của Voriconazol 3

1.1.4 Đặc điểm dược động học liên quan đến theo dõi TDM 4

1.1.5 Liều dùng và cách dùng 6

1.2 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và ứng dụng của HPLC trong giám sát điều trị Voriconazol 6

1.2.1 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao 6

1.2.2 Ứng dụng của HPLC trong giám sát điều trị Voriconazol 9

1.3 Sơ lược về các phương pháp định lượng Voriconazol trong huyết tương 10 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15

2.1.1 Máy móc, thiết bị, dụng cụ 15

2.1.2 Nguyên liệu, hoá chất, dung môi 15

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Chuẩn bị mẫu 15

2.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích 15

2.3 Thẩm định phương pháp phân tích 17

2.3.1 Độ chọn lọc 18

2.3.2 Độ ổn định của hệ thống 18

2.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 18

2.3.4 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) 19

2.3.5 Độ đúng, độ chính xác của phương pháp 20

2.3.6 Tỷ lệ thu hồi chất phân tích 21

2.3.7 Độ ổn định 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Kết quả xây dựng phương pháp nghiên cứu 24

3.1.1 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký 24

3.1.2 Khảo sát, lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 26

3.1.3 Kết quả xây dựng phương pháp định lượng Voriconazol trong huyết tương bằng HPLC- UV 31

3.2 Kết quả thẩm định phương pháp phân tích 31

3.2.1 Độ chọn lọc 31

3.2.2 Độ phù hợp hệ thống 33

3.2.3 Đường chuẩn, khoảng tuyến tính 33

3.2.4 Giới hạn định lượng dưới 34

3.2.5 Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày 35

3.2.6 Tỷ lệ thu hồi của chất phân tích 38

3.2.7 Độ ổn định 39

3.3 Bàn luận 45

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CV Coefficient of Variation Hệ số biến thiên

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HQC High Quality Control

Sắc ký lỏng khối phổ/Khối

phổ

LLOQ Lower Limit Of

Quantification Giới hạn định lượng dưới LQC Lower Quality Control

Sample

Mẫu kiểm soát chất lượng

nồng độ thấp

MIC Minimum Inhibitory

Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MQC Middle Quality Control

Quantification Giới hạn trên của định lượng

US - FDA The United States Food and

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.2 Tóm tắt các nghiên cứu đã định lượng VCZ trong huyết

3.4 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới LLOQ 35 3.5 Kết quả độ đúng, độ chính xác trong ngày của mẫu

3.6 Kết quả độ đúng, độ chính xác trong ngày của mẫu MQC,

3.7 Kết quả độ đúng, độ chính xác khác ngày 37 3.8 Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của VCZ 39 3.9 Kết quả độ ổn định sau thời gian ngắn bảo quản ở nhiệt

3.10 Kết quả độ ổn định của mẫu chuẩn trong huyết tương sau

3.11 Kết quả độ ổn định của mẫu chuẩn trong huyết tương sau

3.12 Độ ổn định 7 ngày của mẫu chuẩn trong huyết tương 43 3.13 Độ ổn định 14 ngày của mẫu chuẩn trong huyết tương 43 3.14 Độ ổn định 21 ngày của mẫu chuẩn trong huyết tương 44

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

3.2

Sắc ký đồ HTT/ 50 % MeCN (a), mẫu chuẩn C4/ 50% MeCN

(b), HTT / 37% MeCN (c), mẫu chuẩn C4/ 37% MeCN (d) với

f = 1ml/ phút

25

3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn C4/ 30% MeCN với f= 1,3 ml/phút 25 3.4 Sắc ký đồ chuẩn C4 với điều kiện sắc ký đã chọn 26 3.5 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng và mẫu chuẩn C4 kết tủa

3.6 Sắc ký đồ VCZ trong huyết tương kết tủa bằng MeCN với các

3.7 Sắc ký đồ mẫu C5 chiết loại tạp với dung môi cloroform 29 3.8 Sắc ký đồ mẫu C5 chiết loại tạp với dung môi n- hexan 30 3.9 SKĐ mẫu HTT (a), mẫu LLOQ (0,5 µg/mL) (b) 32 3.10 Đồ thị quan hệ tuyến tính của diện tích pic và nồng độ của

3.11 SKĐ mẫu VCZ trong HT nồng độ 0,5 μg/mL 35

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Voriconazol (VCZ) là một loại thuốc kháng nấm triazol thế hệ thứ hai, phổ rộng,

có khả năng chống lại hầu hết các loại nấm mốc và nấm men có ý nghĩa lâm sàng, bao gồm cả Aspergillus, Candida và Cryptococcus neoformans [37] VCZ là liệu pháp kháng nấm đầu tay để điều trị của bệnh Aspergillosis xâm lấn, đặc biệt là ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch [42] VCZ cũng được sử dụng để ngăn ngừa nhiễm nấm xâm lấn chính và phụ ở những bệnh nhân mắc bệnh huyết học và những người được ghép tế bào gốc tạo máu toàn thể [9, 45]

VCZ được chuyển hóa qua hệ enzym gan CYP450, trong đó chủ yếu là CYP2C19 Đa hình di truyền của CYP2C19 và các yếu tố không di truyền như tuổi tác, tương tác thuốc, bệnh gan,… đã tạo ra sự khác biệt lớn về nồng độ VCZ ở trong một cá nhân và giữa các cá nhân khỏe mạnh [18] Có nhiều báo cáo về mối quan hệ giữa hiệu quả của VCZ và nồng độ của nó trong huyết tương [24, 25, 33, 39] Các báo cáo này cho thấy nồng độ VCZ trong huyết tương thấp quá hoặc cao quá đều có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và an toàn của điều trị Nhiều nghiên cứu cho thấy bệnh nhân nhiễm nấm xâm lấn đáp ứng điều trị kém với VCZ nồng độ đáy (Cmin) nhỏ hơn

1 mg/L [33] hay hiệu quả dự phòng nhiễm nấm xâm lấn kém khi Cmin nhỏ hơn 1,5 -

2 mg/L [22, 38] và khi Cmin lớn hơn 5,5 mg/L có nguy cơ cao xuất hiện độc tính trên gan và thần kinh [3, 23, 24, 25, 36, 39] Nhiều nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả khi điều chỉnh VCZ trong huyết tương để khoảng nồng độ đáy từ 1,0 đến 5,5 mg/L cải thiện kết quả điều trị và giảm thiểu nguy cơ các tác dụng ngoại ý gây độc cho thần kinh [23, 24, 25, 39] và tỉ lệ nồng độ đáy/MIC là 2 - 5 có liên quan đến cải thiện kết quả lâm sàng trong điều trị nhiễm nấm xâm lấn [39] Định lượng VCZ trong huyết tương phục vụ cho giám sát điều trị (TDM) giúp điều chỉnh liều, tối ưu hóa hiệu quả điều trị và giảm thiểu nguy cơ độc tính trên thần kinh và trên gan [24, 25,

33, 39]

Hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu về định lượng VCZ trong huyết tương được công bố Nồng độ VCZ trong máu thấp, nền mẫu có nhiều thành phần phức tạp

2

có thể gây ảnh hưởng đến quá trình phân tích thuốc Để phục vụ cho giám sát điều trị (TDM), phương pháp định lượng VCZ trong huyết tương đòi hỏi phải có tính thực tiễn cao, chuẩn bị mẫu đơn giản và nhanh chóng, thời gian phân tích mẫu ngắn, LLOQ thấp, ULOQ (giới hạn trên của định lượng) đủ cao; được thẩm định để đảm bảo độ tin cậy và phù hợp với điều kiện thực tế để áp dụng thành công trên lâm sàng Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu các phương pháp định lượng VCZ trong huyết tương như xét nghiệm sinh học [28], sắc ký khí GC kết hợp với khối phổ [34] và sắc

ký lỏng hiệu năng cao HPLC detector huỳnh quang [21], UV [12, 19], khối phổ [6,16] Tuy nhiên, các xét nghiệm sinh học có độ nhạy kém so với sắc ký; sắc ký kết hợp khối phổ [16,34] có sự vượt trội về độ nhạy và độ đặc hiệu nhưng chi phí vận hành thiết bị cao Phương pháp HPLC - UV cho phép định lượng VCZ một cách đơn giản, không tốn kém, có độ nhạy, độ chính xác, độ đặc hiệu cao Vì vậy, với các trang thiết bị có sẵn trong phòng thí nghiệm, chúng tôi đặt vấn đề xây dựng phương pháp định lượng VCZ trong huyết tương bằng HPLC - UV đơn giản, độ chính xác cao và kinh phí thấp hơn với hi vọng có thể áp dụng trong lâm sàng, phục vụ giám sát điều trị cho bệnh nhân sử dụng VCZ thường quy

Xuất phát từ những lý do trên, khóa luận: “Xây dựng phương pháp định lượng Voriconazol trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - UV) ” được thực hiện với các mục tiêu:

1 Khảo sát các điều kiện HPLC và điều kiện xử lý mẫu để tách Voriconazol và định lượng được trong nền mẫu huyết tương

2 Thẩm định phương pháp định lượng đã xây dựng theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học của US - FDA

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Voriconazol

1.1.1 Công thức cấu tạo, tính chất lý hóa của Voriconazol

Bảng 1.1 Một số đặc điểm của Voriconazol

1.1.2 Cơ chế kháng nấm của Voriconazol

Ergosterol là thành phần quan trọng cấu trúc nên màng tế bào nấm VCZ ức chế chọn lọc 14α-sterol demethylasetrong nấm, ngăn chặn sự sản xuất ergosterol và dẫn đến ly giải tế bào nấm [26]

1.1.3 Chỉ định của Voriconazol

VCZ là một chất chống nấm triazol thế hệ thứ hai phổ rộng có hoạt tính chống

lại nấm Candida (bao gồm các loài kháng Fluconazol), C.neoformans, Aspergillus,

nhiều loại nấm lưỡng hình và một số loại nấm quan trọng về mặt y học khác

VCZ là tác nhân đầu tay để điều trị bệnh Aspergillosis xâm lấn, bệnh nấm

Candida xâm lấn do Candida spp giảm nhạy cảm với Fluconazol và nhiễm trùng

4

nghiêm trọng do Scedoporium hoặc Fusarium spp VCZ là thuốc được lựa chọn cho

aspergillosis thần kinh trung ương [5]

1.1.4 Đặc điểm dược động học liên quan đến theo dõi TDM

1.1.4.1 Đặc điểm dược động học

Dữ liệu dược động học đã được báo cáo cho thấy VCZ biểu thị dược động học tuyến tính ở trẻ em và dược động học phi tuyến tính ở người lớn [31] Dựa theo các nghiên cứu trước đây, nồng độ VCZ trong huyết tương rất khác nhau và không thể đoán trước [25] Sự thay đổi cao cũng đã được quan sát thấy trong nồng độ VCZ huyết tương trong và giữa các cá nhân [10] Mặc dù nồng độ VCZ trong huyết tương

là không thể đoán trước, theo dõi thuốc điều trị (TDM) có thể là biện pháp hữu ích nhất để xác định hiệu quả lâm sàng và để giảm thiểu độc tính

VCZ được chuyển hóa qua cơ chế oxy hóa, qua hệ isoenzym CYP450, trong đó CYP2C19 là chủ yếu, ở mức thấp hơn là CYP3A4, CYP2C9 [37] CYP2C19 thể hiện một số đa hình có liên quan về mặt lâm sàng như các biến thể allelic dẫn đến giảm hoặc loại bỏ hoạt động của enzyme đã được xác định cũng như các biến thể dẫn đến tăng hoạt tính của enzym CYP2C19 [40] Những đa hình di truyền này của CYP2C19 ảnh hưởng đáng kể đến sự tiếp xúc toàn thân với VCZ Những cá thể bị mất hoàn toàn hoặc một phần chức năng tổng hợp CYP2C19 đều làm ảnh hưởng đáng kể đến chuyển hóa của VCZ và nồng độ VCZ trong huyết tương [32, 43] Mặt khác, VCZ được chuyển hóa bởi CYP2C19, CYP3A4 và flavin có chứa monooxygenase chủ yếu tạo thành dạng N - oxyd [43] có hoạt tính không đáng kể so với VCZ [14] Vì vậy, theo dõi TDM Voriconazol trong huyết tương được cho là cải thiện hiệu quả lâm sàng của VCZ

Có nhiều báo cáo về mối quan hệ giữa hiệu quả của VCZ và nồng độ của nó trong huyết tương [23, 24, 25, 33, 39] Các báo cáo này cho thấy nồng độ VCZ trong huyết tương thấp quá hoặc cao quá đều có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và an toàn của điều trị Nồng độ VCZ trong dự phòng nhiễm nấm xâm lấn Cmin nhỏ hơn 1,5 - 2 mg/L làm nguy cơ nhiễm nấm tăng cao [22, 38] Một nghiên cứu quan sát trên 52

5

bệnh nhân sử dụng VCZ để điều trị các bệnh nhiễm nấm xâm lấn cho kết quả gần 60% bệnh nhân có bệnh lý ác tính huyết học và một nửa trong số đó điều trị cho Aspergillus xâm lấn, đáp ứng điều trị kém với VCZ nồng độ đáy nhỏ hơn 1 mg/L [33] Bên cạnh đó, khi nồng độ VCZ trong huyết tương Cmin lớn hơn 5,5 mg/L có nguy cơ cao xuất hiện độc tính trên gan và thần kinh [3, 23, 24, 25, 36, 39] Có nghiên cứu chứng minh mối liên hệ có ý nghĩa thống kê cho mỗi lần tăng 0,1 mg/ml của VCZ trong huyết thanh với sự xuất hiện của các biến cố bất lợi trên thần kinh [3, 24, 25] Có những báo cáo về nguy cơ tăng men gan khi nồng độ VCZ trong huyết thanh cao và dẫn đến chỉ định dừng thuốc [15, 36] và có các quan sát gần đây cho thấy rằng độc tố gan - rối loạn thị giác và thị giác có thể liên quan đến liều lượng [15, 36] Nhiều nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả khi điều chỉnh VCZ trong huyết tương

với khoảng nồng độ đáy từ 1,0 đến 5,5 mg/L được ủng hộ để cải thiện kết quả điều trị và giảm thiểu nguy cơ các tác dụng gây độc cho thần kinh và gan [23, 24, 25, 39]

1.1.4.2 Khuyến cáo theo dõi TDM ở bệnh nhân dùng Voriconazol

Một thử nghiệm điều tra sử dụng TDM Voriconazol đến từ Park W.B và cộng

sự [24] đã biểu diễn một thử nghiệm ngẫu nhiên, đánh giá mù, có kiểm soát, để xác định xem TDM thường quy của VCZ có làm giảm hay không các tác dụng phụ hoặc cải thiện đáp ứng điều trị trong các bệnh nhiễm nấm xâm lấn bao gồm nhiễm Aspergillus xâm lấn Kết quả cho thấy, mặc dù TDM của VCZ không giảm tỷ lệ chung của các tác dụng phụ liên quan đến VCZ, nó đã làm giảm đáng kể tỷ lệ ngừng VCZ do các sự kiện bất lợi Hiện nay, TDM Voriconazol được khuyến cáo thực hiện

ở phần lớn bệnh nhân dùng VCZ Nồng độ mục tiêu tối thiểu trong điều trị các bệnh

đã thành lập với nồng độ đáy lớn hơn 1mg/L hoặc tỷ lệ nồng độ đáy/MIC là 2 - 5 Nên dùng TDM VCZ để làm giảm thiểu độc tính liên quan đến thuốc, duy trì nồng

độ đáy nhỏ hơn 4 - 6 mg/L Nên đo nồng độ VCZ trong 5 ngày đầu tiên điều trị và thường xuyên sau đó [5]

6

1.1.5 Liều dùng và cách dùng

- Liều được cấp phép hiện tại là 6 mg/kg tiêm tĩnh mạch hai lần mỗi ngày, tiếp theo

là 4 mg/kg tiêm truyền hai lần mỗi ngày Nếu bắt đầu điều trị bằng VCZ đường uống, liều nạp 400 mg x 2 lần/ngày (đối với người > 40 kg), tiếp theo là 200 mg x 2 lần/ngày

và ở người < 40 kg, liều duy trì là 100 mg x 2 lần/ngày Có thể tăng liều lên 300 mg

x 2 lần/ngày nếu có chỉ định lâm sàng [5]

- Cách dùng: Truyền IV trong 1-2 giờ, không quá 3 mg/kg/giờ, uống 1 giờ trước hoặc sau bữa ăn

1.2 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và ứng dụng của HPLC trong giám sát điều trị Voriconazol

1.2.1 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.2.1.1 Nguyên tắc

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha, tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất với thời gian hợp lý [1,2]

Sắc ký phân bố là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay Có thể phân sắc ký lỏng phân bố thành hai dạng tùy thuộc vào pha tĩnh: sắc ký lỏng - lỏng và sắc

ký pha liên kết Hiện nay, sắc ký pha liên kết chiếm ưu thế, thay thế cho sắc ký lỏng

- lỏng Trong sắc ký pha liên kết, pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mang rắn (silica, alumina…) Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxyd (silica) Nhóm - OH trên bề mặt silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan

7

Ở đây, R có thể là mạch thẳng có 18 hoặc 8 carbon hoặc các nhóm chức hữu cơ khác nhau như amin mạch thẳng, nitril, hydrocarbon thơm Tính chất phân cực của pha tĩnh thay đổi tùy thuộc vào gốc R [1,2]

Dựa vào độ phân cực tương đối của pha động và pha tĩnh, người ta chia sắc ký phân bố thành hai loại: sắc ký phân bố pha thuận và pha đảo Sắc ký pha đảo là loại hình hay được sử dụng trong phân tích thuốc Loại sắc ký này sử dụng pha tĩnh không phân cực như hydrocarbon, pha động phân cực như nước, acetonitril, methanol… Trong sắc ký phân bố pha đảo, các chất phân cực nhất sẽ được rửa giải đầu tiên, khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu tăng lên [1,2]

Trong sắc ký có 3 thành phần tương tác với nhau: pha tĩnh, pha động và chất phân tích Để có thể tách bằng sắc ký phân bố thành công, cần chọn điều kiện để cân bằng tương tác giữa các thành phần này Độ phân cực của các thành phần là chỉ tiêu

mô tả định tính lực tương tác:

- Với pha tĩnh: dựa vào nhóm thế R của dẫn chất siloxan

- Với pha động: dựa vào chỉ số phân cực Snyder của dung môi

- Với chất phân tích: dựa vào nhóm chức

Để tách sắc ký người ta có thể lựa chọn theo một trong hai phương pháp sau:

- Độ phân cực của chất phân tích hợp với độ phân cực của pha tĩnh và khác xa độ phân cực của pha động

- Độ phân cực của chất phân tích hợp với độ phân cực của pha động và khác xa độ phân cực của pha tĩnh

Nhiều tác giả cho thấy chọn theo nguyên tắc 1 có xác suất thành công cao hơn

1.2.2.1 Cấu tạo máy HPLC

Một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao về cơ bản đều có các bộ phận sau:

- Hệ thống cấp pha động sắc ký lỏng

1.2.1.3 Một số thông số đặc trưng của HPLC

a, Thời gian lưu t R

- Thời gian lưu của một chất là khoảng thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại

- Thời gian lưu là đại lượng để định tính một chất [1,2]

b, Hệ số phân bố K

Đặc trưng cho tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh:

𝐾 = 𝐶𝑆

𝐶𝑀Trong đó, CS và CM lần lượt là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh và pha động:

- Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm

- Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn, tuy nhiên nếu khác nhau quá nhiều thì thời gian phân tích

t0 là thời gian để pha động ra khỏi cột phân tích (phút) Trên thực tế, 1 ≤ 𝑘′ ≤ 5 là tối ưu [1,2]

d, Hệ số chọn lọc α

Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỉ đối của hai chất A và B:

𝑡𝑅𝐴 (Theo quy ước KB>KA nên α >1)

Để tách riêng hai chất A và B cần α >1: chọn α dao động trong khoảng từ 1,05 đến

2 Nếu α quá lớn thì thời gian phân tích sẽ dài [1,2]

tRA, tRB: thời gian lưu của hai chất A và B (phút)

WA, WB: độ rộng pic đo ở đáy pic A và B (phút)

W1/2 (A), W1/2 (B): độ rộng pic đo ở nửa chiều cao của A và B (phút)

RS = 1,5, hai pic tách nhau rõ ràng, chỉ xen phủ 0,3% [1,2]

1.2.2 Ứng dụng của HPLC trong giám sát điều trị Voriconazol

Một số phương pháp phân tích có sẵn để đo nồng độ Voriconazol trong dịch sinh học bao gồm xét nghiệm sinh học [28], xét nghiệm miễn dịch [7], sắc ký khí GC kết hợp với khối phổ [34] và sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC detector huỳnh quang [21], UV [12, 13, 19, 27, 30, 35], khối phổ [6,16] Với các xét nghiệm sinh học [28], tuy không tốn kém về mặt thiết bị và chi phí hư hao, nhưng độ nhạy kém hơn và thời gian phân tích dài so với sắc ký Phương pháp sắc ký kết hợp khối phổ [6,16,34] có

sự vượt trội về độ nhạy và độ đặc hiệu so với cả phép định lượng sử dụng detector huỳnh quang [21] hay detector UV [12, 13, 19, 27, 30, 35] Tuy nhiên, chi phí mua

và vận hành của các thiết bị LC - MS và LC - MS/MS là cao Vì thế, các phương pháp này thường khó áp dụng trên lâm sàng để theo dõi TDM cho bệnh nhân dùng VCZ thường quy

VCZ có khả năng hấp thụ UV mạnh, cực đại ở bước sóng khoảng 260 nm, detector UV của hệ thống HPLC đủ nhạy để đo nồng độ Voriconazol có liên quan về mặt lâm sàng (1 - 5,5 g/mL) trong huyết tương người Ngoài ra, phương pháp HPLC

10

sử dụng detector UV cho phép phân tích thuốc một cách đơn giản, không tốn kém, thiết bị phân tích tương đối phổ biến so với thiết bị sử dụng detector MS Phương pháp phân tích đơn giản, có độ nhạy, độ chính xác và chọn lọc cao phù hợp cho giám sát điều trị trong lâm sàng [12,27]

1.3 Sơ lược về các phương pháp định lượng Voriconazol trong huyết tương Bảng 1.2 Tóm tắt các nghiên cứu đã định lượng VCZ trong huyết tương TLTK

- Dùng UK - 115,794 làm chuẩn nội; LLOQ là 0,2 g/mL

- Xử lý mẫu: chiết pha rắn SPE bằng cột Bond Elut C18 (100

- Dùng Ketoconazol làm chuẩn nội; LLOQ là 0,1 g/mL

- Xử lý mẫu: chiết lỏng - lỏng với heptan - isoamyl alcohol (90:10, v/v), lắc xoáy 5 phút, ly tâm 5000 vòng/phút/5 phút;

- Dùng Diazepam làm chuẩn nội; LLOQ là 0,2 mg/L

- Xử lý mẫu: chiết lỏng - lỏng với hexan - metylen clorua (70:30,v/v), lắc xoáy 20 phút, ly tâm 2200vòng/phút/5 phút; phần nổi phía trên được làm khô bằng Nitơ ở 30°C, cặn được hoàn nguyên bằng dung môi pha động để tiêm sắc ký

- Dùng Phenacetin làm chuẩn nội; LLOQ là 0,1 g/mL

- Xử lý mẫu: chiết lỏng - lỏng với ether, lấy pha nước, dịch chiết được làm khô bằng Nitơ ở nhiệt độ phòng và được hoàn nguyên trong dung môi pha động (tỷ lệ pha động là 50: 50, v/v)

12

20% A, 80% B; 14-19 phút: 75% A, 25% B; λphát hiện là 260

nm

- Dùng Linezolid làm chuẩn nội; LLOQ là 0,05 g/mL

- Xử lý mẫu bằng bộ chiết xuất tự động (ASPEC Xli, Gilson), chiết với hỗn hợp nước: MeOH (70: 30, v/v), sau đó lại rửa giải bằng MeOH, làm bay hơi dung môi bằng dòng Nitơ ở 50°C, cắn được hoàn nguyên bằng nước: MeOH (50: 50, v/v)

- HPLC - UV với cột Luna Phenyl Hexyl (250×4,6 mm,

5m); pha động MeCN: đệm Phosphat 10 mM (pH 7,0) (50:50, v/v), f = 2 ml/phút; λphát hiện là 255 nm

- Dùng L-754394 (một chất tương tự của ritonavir) làm chuẩn nội, LLOQ là 0,1 g/mL

- Xử lý mẫu: chiết lỏng - lỏng với 1-clorobutan, làm bay hơi dung môi hữu cơ đến khô, cặn được hoàn nguyên lại bằng dung môi pha động để tiêm sắc ký

- Dùng Ravuconazol làm chuẩn nội; LLOQ là 0,25 g/mL

- Xử lý mẫu: kết tủa protein trong huyết tương bằng MeCN

- Dùng Papaverin làm chuẩn nội; LLOQ là 0,1 mg/L

- Xử lý mẫu: kết tủa protein bằng ACN, lắc xoáy 30s, ly tâm

19000 vòng/phút/20 phút Phần dịch nối phía trên được cô

- Sử dụng Clonazepam làm chuẩn nội; LLOQ là 0,1 g/mL

- Xử lý mẫu: kết tủa protein trong huyết tương bằng MeOH, lắc xoáy 1 phút, ly tâm 10000 vòng/phút/10 phút, lấy phần nổi ở trên tiêm sắc ký

từ 6,5 phút: 20% A, 80% B, f= 1 ml/phút; detector là nguồn ion hóa tia điện ở chế độ ion dương

- Dùng Dimethyl diquinoxalin làm chuẩn nội; LLOQ là 0,3

- Dùng Fluconazol làm chuẩn nội; LLOQ là 0,1 g/mL

- Xử lý mẫu: kết tủa protein huyết tương bằng MeOH

15

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Máy móc, thiết bị, dụng cụ

- Thiết bị phân tích: Hệ thống HPLC Agilent 1100 (Nhật), Cột sắc ký InterSustain

C8 (4,6 x150mm, 5m) (Nhật)

- Thiết bị phụ trợ: Cân phân tích A&D, Model GR-200 (Nhật), máy ly tâm Kubota

6500 (Nhật), máy lắc xoáy Labinco L46 (Hà Lan), phễu lọc Buchner, màng lọc cellulose 0,45 m, tủ lạnh âm sâu (-86C) Panasonic (Nhật), máy đo pH Eutech Instruments (Singapore)

- Dụng cụ khác: Bình định mức 10ml, pipet pasteur, đũa thuỷ tinh (Trung Quốc),

micropipet LABMATE pro (loại 10-100 L và 100-1000 L ) (Ba Lan), đầu côn cho micropipet (Trung Quốc), ống ly tâm (1,5 mL và 2 mL) (Mỹ)

2.1.2 Nguyên liệu, hoá chất, dung môi

- Chất chuẩn: Voriconazol (độ tinh khiết 99,8%, chất chuẩn Sigma - Aldrich, CAS

number 137234-62-9, lot LRAC2092)

- Hóa chất: Acetonitril (Mỹ), Amoni acetat (Đức), Methanol (Pháp), n-hexan (Mỹ)

- Huyết tương trắng: (mã số 20PO184747, Viện huyết học - truyền máu trung ương)

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chuẩn bị mẫu

2.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích

- Dung dịch chuẩn gốc Voriconazol 2000 μg/mL(G 2000 ): cân chính xác 0,0201 g chất

chuẩn Voriconazol (độ tinh khiết 99,8%) vào bình định mức 10,0 ml, hòa tan và định mức vừa đủ bằng methanol, bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8°C Sau đó pha loãng bằng MeCN để được dung dịch chuẩn trung gian VCZ 100 μg/mL (G100), 20μg/mL (G20),

10 μg/mL (G5), 5,0 μg/mL (G4)

16

- Dung dịch chuẩn làm việc G 1 –G 6: pha loãng từ chuẩn trung gian với MeCN để được các dung dịch có nồng độ lần lượt là 0,5; 1; 2; 5; 10; 12,5 μg/mL (dãy dung dịch đường chuẩn G1 –G6, kí hiệu chuẩn Gx)

Bảng 2.1 Chuẩn bị các dung dịch làm việc G1 –G6

đủ rồi tiến hành xử lý mẫu Các mẫu được chuẩn bị như bảng 2.2

Bảng 2.2 Chuẩn bị mẫu HTT, mẫu chuẩn trong huyết tương và mẫu thử

2.2.2.1 Xác định điều kiện sắc ký

Dựa vào công thức cấu tạo, tính chất hóa lý của VCZ và tham khảo một số tài liệu thì nhóm nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng trên hệ thống HPLC Agilent 1100 series, detector DAD với cột sắc ký InterSustain C8 (4,6 x150mm,

5m), tiền cột C8 và khảo sát các điều kiện sắc ký khác nhau như:

- Lựa chọn bước sóng phát hiện

- Lựa chọn dung môi pha động: thành phần, tỉ lệ dung môi, tốc độ dòng

- Lựa chọn thể tích tiêm mẫu

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn những điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng VCZ trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector UV

2.2.2.2 Xây dựng qui trình xử lý mẫu chuẩn trong huyết tương

Dựa vào các tài liệu tham khảo [4,12.29,30], tiến hành khảo sát phương pháp

xử lý mẫu chiết tách VCZ từ huyết tương bằng phương pháp như:

- Tủa protein với các tác nhân gây tủa là các dung môi hữu cơ như MeCN, MeOH và acid pecloric HClO4

- Chiết lỏng - lỏng với các dung môi như cloroform, dicloromethan, n-hexan

2.3 Thẩm định phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp là một nội dung bắt buộc đối với các phương pháp phân tích nói chung và phương pháp định lượng dược chất trong dịch sinh học nói riêng Hiện nay ở Việt Nam, thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch

- Tiến hành: Xử lý và phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên 6 mẫu HTT có

nguồn gốc khác nhau và 6 mẫu chuẩn trong huyết tương chứa VCZ ở nồng độ 0,5 µg/mL (mẫu LLOQ) Ghi lại SKĐ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu chuẩn/mẫu HTT tại thời gian lưu của VCZ

- Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích khi:

+ Trên sắc ký đồ của mẫu HTT, xác định không xuất hiện các pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của hoạt chất chính, tạp chất liên quan và tạp chất phân hủy

+ Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của mẫu HTT không được vượt quá 20% đáp ứng của chất phân tích ở nồng độ LLOQ

2.3.2 Độ ổn định của hệ thống

- Độ ổn định hệ thố ng là phép thử nhằm đánh giá đô ̣ ổn đi ̣nh của toàn hê ̣ thống phân

tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bi ̣

- Tiến hành: Chuẩn bị một mẫu chuẩn trong dung dịch ở nồng độ 10 µg/mL (G5), tiến hành xử lý và phân tích lặp lại 6 lần theo quy trình đã xây dựng, tính giá trị CV của thời gian lưu, diện tích pic của VCZ

- Độ ổn định của hệ thống đạt khi:

+ Hệ số biến thiên CV của các giá trị thời gian lưu tR  1%

+ Hệ số biến thiên CV của các giá trị diện tích pic (S)  2%

2.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

- Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích Độ tuyến

+ Xây dựng phương trình hồi quy biểu diễn sự phụ thuộc của đáp ứng pic vào nồng

độ VCZ trong mẫu và xác định hệ số tương quan R

+ Từ phương trình hồi quy đã xây dựng, tính lại nồng độ của từng mẫu, xác định giá trị độ chệch tại mỗi nồng độ theo công thức sau:

∆𝑖= 𝐶𝑡− 𝐶𝑐

𝐶𝑐 × 100%

Trong đó:

i: Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn

Ct: Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn

Cc: Nồng độ của các điểm chuẩn

- Theo quy định của USFDA,đường chuẩn phải đáp ứng điều kiện sau:

+ Hệ số tương quan R thỏa mãn R2 > 0,99

+ Giá trị độ chệch Δi không được vượt quá 15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng

độ LLOQ có thể chấp nhận giới hạn 20%

+ Ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, bao gồm cả mẫu LLOQ và mẫu có nồng độ cao nhất của đường chuẩn

2.3.4 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

- Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong một mẫu cho kết quả định lượng đáng tin cậy, có độ đúng và độ chính xác phù hợp

20

- Tiến hành: phân tích 6 mẫu HTT và 6 mẫu chuẩn trong huyết tương chứa VCZ ở nồng độ 0,5 µg/mL (nồng độ thấp nhất của đường chuẩn) Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu chuẩn/mẫu HTT tại thời gian lưu của VCZ Tính nồng độ của VCZ trong mẫu dựa vào đường chuẩn được phân tích cùng ngày Tính

độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng độ định lượng được (tính từ đường chuẩn) với nồng độ thực, xác định giá trị CV của các mẫu

- Nồng độ chuẩn thấp nhất trên đường chuẩn được chấp nhận là LLOQ khi:

+ Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic của mẫu HTT

+ Nồng độ chất phân tích tính được từ đường chuẩn phải đạt từ 80 - 120% so với nồng độ thực tế

+ Độ chính xác thể hiện bằng giá trị CV khi tiến hành phân tích trên ít nhất 5 mẫu LLOQ độc lập ≤ 20%

2.3.5.1 Độ đúng, độ chính xác trong ngày

- Tiến hành: Tiến hành phân tích trong cùng một ngày trên 4 lô mẫu LLOQ, LQC, MQC, HQC Mỗi lô mẫu gồm 5 mẫu độc lập, tính nồng độ tìm lại của VCZ dựa vào đường chuẩn được xây dựng trong cùng ngày Độ đúng được xác định bằng tỷ lệ% giữa nồng độ tìm lại được (tính từ đường chuẩn) với nồng độ thực tế của VCZ trong mẫu Độ chính xác được biểu thị bằng giá trị CV của nồng độ định lượng được trong các lần phân tích trên cùng lô mẫu

- Độ đúng, độ chính xác trong ngày của phương pháp phân tích đạt khi:

21

+ Tại mỗi nồng độ, độ đúng phải nằm trong khoảng từ 85% đến 115% so với nồng

độ thực tế, riêng với giá trị giới hạn định lượng dưới LLOQ cho phép từ 80 - 120%.+ CV% giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ phân tích có giá trị  15%, riêng với giá trị giới hạn định lượng dưới LLOQ cho phép CV  20%

2.3.5.2 Độ đúng, độ chính xác khác ngày

- Tiến hành: tương tự độ đúng, độ chính xác trong ngày, phân tích trong 3 ngày khác

nhau Xác định độ đúng và độ chính xác khác ngày (biểu thị bằng CV% giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày và độ lệch CV% giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong 3 ngày khác nhau)

- Độ đúng, độ chính xác khác ngày của phương pháp phân tích đạt khi:

+ Tại mỗi nồng độ, độ đúng phải nằm trong khoảng từ 85% đến 115% so với giá trị thực tế đã pha, riêng với giá trị giới hạn định lượng dưới LLOQ cho phép từ 80 -120%

+ Độ chính xác trong ngày: CV% giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong ngày  15%, riêng với giá trị giới hạn định lượng dưới LLOQ cho phép CV  20%

+ Độ chính xác giữa các ngày: CV% giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích các ngày  15%, riêng với giá trị giới hạn định lượng dưới LLOQ cho phép

CV  20%

2.3.6 Tỷ lệ thu hồi chất phân tích

- Tỷ lệ thu hồi là giá trị phản ánh khả năng tìm lại của chất phân tích sau quá trình chiết tách xử lý mẫu Tỷ lệ thu hồi được xác định bằng cách so sánh kết quả đáp ứng của các mẫu QC có qua chiết tách với đáp ứng của các mẫu chuẩn có cùng nồng độ không xử lý qua chiết tách

- Tiến hành: phân tích các lô mẫu chuẩn trong huyết tương (C2, C4, C5), mỗi lô mẫu gồm 5 mẫu độc lập Song song tiến hành phân tích các mẫu chuẩn không qua xử lý chiết tách (V1, V5, V10) có nồng độ tương ứng với các mẫu đã qua xử lý chiết tách

2.3.7 Độ ổn định

- Các mẫu phân tích trong dịch sinh học trải qua quá trình lấy mẫu, xử lý mẫu, bảo quản mẫu (ngắn hạn, dài ngày), qua chu kỳ đông lạnh - rã đông và quá trình phân tích mẫu nên cần đánh giá độ ổn định của chất phân tích Độ ổn định được đánh giá bằng cách so sánh kết quả phân tích các mẫu sau bảo quảnvới các mẫu mới chuẩn bị

ít nhất 3 lần lặp lại ở mỗi mức nồng độ khác nhau (LQC và HQC)

- Trong thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học cần đánh giá các loại

độ ổn định sau:

2.3.7.1 Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc sau thời gian ngắn ở nhiệt độ

phòng

- Tiến hành: phân tích các lô mẫu dung dịch chuẩn gốc VCZ làm việc V1, V10, mỗi

lô 3 mẫu độc lập Các dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 6 giờ So sánh nồng độ VCZ của mẫu sau khi bảo quản với các mẫu được phân tích ngay sau khi chuẩn bị

- Yêu cầu: Nồng độ của dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch

mới pha không quá 2,0%

2.3.7.2 Độ ổn định mẫu chuẩn trong huyết tương sau thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng

- Tiến hành: phân tích các lô mẫu LQC và HQC trong huyết tương, mỗi lô 3 mẫu độc

lập So sánh nồng độ tìm lại của VCZ trong các mẫu được xử lý và phân tích sau 6 giờ ở nhiệt độ phòng với các mẫu tương ứng được xử lý và phân tích ngay sau khi chuẩn bị

2.3.7.4 Độ ổn định mẫu chuẩn trong huyết tương sau thời gian dài ở nhiệt độ bảo quản

- Tiến hành: phân tích các lô mẫu LQC và HQC trong huyết tương, mỗi lô 3 mẫu

độc lập Sau khi chuẩn bị, tiến hành bảo quản mẫu ở tủ lạnh âm sâu (khoảng -86ºC) Sau từng khoảng thời gian nhất định (7, 14, 21 ngày), tiến hành phân tích và xác định nồng độ VCZ trong các mẫu dựa trên đường chuẩn được phân tích cùng ngày So sánh nồng độ VCZ của mẫu sau những khoảng thời gian bảo quản với các mẫu tương ứng được phân tích ngay sau khi chuẩn bị

2.3.7.5 Độ ổn định của mẫu chuẩn trong huyết tương sau xử lý

- Tiến hành: phân tích các lô mẫu LQC và HQC trong huyết tương, mỗi lô 3 mẫu độc

lập Sau khi chuẩn bị, tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng, bảo quản mẫu sau xử lý ở nhiệt độ 2 - 8 ºC sau một thời gian xác định (khoảng 24 giờ) So sánh nồng độ VCZ của mẫu sau thời gian bảo quản với các mẫu tương ứng được phân tích ngay sau khi xử lý

 Yêu cầu: Các mẫu chuẩn trong huyết tương được coi là ổn định ở điều kiện

nghiên cứu nếu nồng độ của mẫu sau bảo quản sai khác so với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị CV giữa các lần phân tích ≤ 15%

24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả xây dựng phương pháp nghiên cứu

3.1.1 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký

Dựa vào tham khảo một số nghiên cứu đã được công bố [4,30], kết hợp với quá trình thực nghiệm thì nhóm nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng VCZ trên hệ thống HPLC Agilent 1100 series, detector DAD với một số điều kiện

Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV của VCZ

Phổ hấp thụ của VCZ có cực đại hấp thụ khoảng 260 nm nên bước sóng này được lựa chọn để ghi sắc ký đồ

3.1.1.2 Lựa chọn pha động và tốc độ dòng pha động

Khảo sát pha động với tỷ lệ thành phần MeCN thay đổi từ 30-50%, tốc độ dòng 1 ml/phút Với mỗi tỷ lệ pha động, phân tích đồng thời mẫu huyết tương trắng (HTT) và mẫu C4 có nồng độ 5 µg/ml được chuẩn bị như bảng 2.2, kết quả được thể hiện trong hình 3.2

λmax = 260nm VCZ

25

Hình 3.2 Sắc ký đồ HTT/ 50 % MeCN (a), mẫu chuẩn C4/ 50% MeCN (b), HTT / 37% MeCN (c), mẫu chuẩn C4/ 37% MeCN (d) với f = 1ml/ phút

Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn C4/ 30% MeCN với f= 1,3 ml/phút

Kết quả cho thấy:

- Khi tỷ lệ MeCN 50% thì VCZ được rửa giải ở 4,862 phút (b), trên nền huyết tương trắng xuất hiện pic ở 4,993 phút (a) nên VCZ không tách khỏi được pic tạp trong nền mẫu huyết tương

- Giảm dần tỷ lệ MeCN xuống khoảng 30%, giữ nguyên tốc độ dòng 1 ml/phút thời gian phân tích rất dài, pic VCZ bị doãng Nếu tỉ lệ MeCN 30% và tăng tốc

VCZ

C 4 / 30% MeCN; f=1,3 ml/phút

Kết luận: Từ các kết quả khảo sát trên, điều kiện sắc ký định lượng VCZ trong

huyết tương bằng phương pháp HPLC - UV được lựa chọn như sau:

Hình 3.4 Sắc ký đồ chuẩn C4 với điều kiện sắc ký đã chọn

3.1.2 Khảo sát, lựa chọn điều kiện xử lý mẫu

3.1.2.1 Lựa chọn dung môi kết tủa protein

Mẫu VCZ trong huyết tương được thử nghiệm tủa protein với acid pecloric HClO4 2-3% (v/v), dung môi MeOH và MeCN

- Khi thêm HClO4 2-3% vào mẫu huyết tương trắng và mẫu chuẩn thêm vào huyết tương trắng nhận thấy lượng protein bị tủa nhiều hơn, đường nền xấu Mẫu chuẩn trong huyết tương xuất hiện pic có thời gian lưu gần với thời gian lưu của VCZ nhưng phổ của nó không tương đồng với VCZ do HClO4 là một chất oxi hóa mạnh

VCZ

(a) HTT/ HClO 4

(b) C 4 / HClO 4

là (1: 2,5) được chọn để tiến hành tủa protein

3.1.2.2 Lựa chọn dung môi chiết loại tạp

Trong huyết tương, ngoài protein còn có nhiều thành phần khác như acid béo, cholesterol…là các chất thân dầu, kém phân cực, sau khi kết tủa protein, các thành phần này vẫn tồn tại trong mẫu chưa được loại hết Tiến hành phân tích mẫu chuẩn trong huyết tương sau khi kết tủa protein, kết quả cho thấy nền huyết tương không được sạch, nhiều thành phần kém phân cực tồn tại trong mẫu gây nhiễu đường nền, làm cản trở quá trình phân tích và làm giảm tuổi thọ của cột sắc ký

Để loại bỏ bớt các thành phần thân dầu trong nền huyết tương, một bước chiết lỏng - lỏng với dung môi hữu cơ để loại bớt tạp sau kết tủa protein được khảo sát với ba dung môi là dicloromethan, cloroform và n-hexan

- Với dung môi chiết là dicloromethan

Chuẩn bị mẫu C5 (nồng độ 10 µg/ml trong huyết tương trắng), sau khi kết tủa protein thì thêm tiếp 100 µl dicloromethan, lắc xoáy 30 giây, ly tâm 14000 vòng/phút, thời gian 10 phút Kết quả cho thấy sự phân lớp hai pha không rõ ràng,

VCZ

VCZ

29

cả hai pha đều bị đục nên không tiêm tiếp vào cột sắc ký Vì thế không lựa chọn dicloromethan cho quá trình chiết này

- Với dung môi chiết là Cloroform

Chuẩn bị mẫu tương tự như trên, thay 100 µl dicloromethan bằng 100 µl cloroform lắc xoáy 30 giây, ly tâm 14000 vòng/phút, thời gian 10 phút, thấy hai pha phân lớp khá rõ Lấy dịch ở hai pha chạy sắc ký theo chương trình gradient dung môi, tăng dần tỷ lệ MeCN trong pha động lên 80% để đẩy chất kém phân cực ra sớm hơn thì kết quả thu được ở hình 3.7

Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu C5 chiết loại tạp với dung môi cloroform

Kết quả cho thấy phần chất béo kém phân cực chuyển sang pha dung môi một lượng lớn, nền mẫu của pha nước còn lại sạch hơn nhiều Tuy nhiên lượng VCZ cũng chuyển sang pha cloroform, lượng VCZ nằm lại ở pha nước rất ít ảnh hưởng đến giới hạn phát hiện của phương pháp Nên cloroform cũng không được sử dụng làm dung môi chiết loại tạp

Pha nước

Pha cloroform VCZ

VCZ

30

- Dung môi chiết loại tạp là n- hexan

Chuẩn bị mẫu tương tự như trên, thay 100 µl dicloromethan bằng 200 µl n-hexan, lắc xoáy 30 giây, ly tâm 14000 vòng/ phút trong 10 phút Kết quả cho thấy hai pha tách lớp rõ, pha dung môi ở trên, pha nước nằm ở dưới Lấy dịch ở hai pha chạy sắc ký theo chương trình gradient dung môi, tăng tỉ lệ dung môi MeCN lên 80% để đẩy chất kém phân cực ra sớm hơn Kết quả được thể hiện trong hình 3.8

Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu C5 chiết loại tạp với dung môi n- hexan

Khi chiết bằng dung môi n-hexan, VCZ nằm lại ở pha nước, tạp chất không được loại bỏ hoàn toàn nhưng một phần tạp chất cũng được chiết sang pha hexan Như vậy, n-hexan có thể loại bớt các thành phần không phân cực trong mẫu, làm giảm bớt tích lũy tạp chất trong cột, giảm ảnh hưởng đến quá trình phân tích Vì vậy, n- hexan được chọn làm dung môi chiết loại bớt tạp trong mẫu chuẩn trong huyết tương

Pha nước

Pha n-hexan

VCZ

3.1.3.2 Quy trình xử lý mẫu trong huyết tương

3.2 Kết quả thẩm định phương pháp phân tích

32

Hình 3.9 SKĐ mẫu HTT (a), mẫu LLOQ (0,5 µg/mL) (b)

Trên sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng, không xuất hiện pic tại thời gian lưu của VCZ và sắc ký đồ huyết tương trắng thêm VCZ, xuất hiện pic của VCZ (tR

8,0 phút) và tách khỏi các pic nền huyết tương trắng (RS >1,5), độ tinh khiết của pic sắc ký đạt 0,9995 Tiến hành chồng phổ hấp thụ UV của pic VCZ của mẫu chuẩn trong huyết tương với phổ hấp thụ UV pic VCZ trong nước thì thấy phổ tương đồng, hệ số chồng phổ 99,9985 %

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nền HTT tại thời gian lưu của VCZ

STT

Đáp ứng tại t R VCZ Mẫu HTT

(mAU*s)

Mẫu LLOQ (mAU*s)