Xây dựng phương pháp định lượng bromelain trong viên nén

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THU TRANG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BROMELAIN TRONG VIÊN NÉN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2022 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THU TRANG Mã sinh viên: 1701610 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BROMELAIN TRONG VIÊN NÉN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Thuận Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa Dược, Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Trước trình bày nội dung thuộc đề tài nghiên cứu mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người đồng hành, giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu khoa học mơn Hóa dược - Trường Đại học Dược Hà Nội Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Thuận người tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện học tập nghiên cứu tốt quãng thời gian em tham gia thực nghiệm môn, động viên khích lệ em suốt q trình thực đề tài Bên cạnh em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến giảng viên anh chị kỹ thuật viên công tác Bộ mơn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội ln giúp đỡ, tạo điều kiện cho em hồn thành khóa luận Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành cho gia đình, bạn bè ủng hộ động viên em suốt năm tháng học tập nghiên cứu mái trường Đặc biệt, em xin cảm ơn anh Dương Tiến Anh, chị Trần Thị Huyền Trang, chị Đinh Thị Lý, bạn Bùi Văn Sơn, bạn Nguyễn Bình Minh, em Lã Hải Long, em Phạm Thúy Hà người bạn, người em nghiên cứu mơn Hóa dược bên cạnh, đồng hành, chia sẻ buồn vui giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu mơn Trong q trình thực hồn thành khóa luận, việc thiếu sót khơng thể tránh khỏi Em mong nhận lời góp ý dẫn thầy để khóa luận em hoàn thiện Một lần em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 08 tháng 05 năm 2022 Sinh viên Phạm Thị Thu Trang MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .2 1.1 Tổng quan enzym 1.1.1 Trung tâm hoạt động enzym 1.1.2 Cơ chế hoạt động enzym .3 1.1.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzym 1.1.4 Đơn vị hoạt tính enzym 1.2 Tổng quan enzym bromelain 1.2.1 Cấu tạo hóa học 1.2.2 Cấu trúc không gian bromelain .6 1.2.3 Tính chất bromelain .6 1.2.4 Hoạt tính bromelain .6 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain .7 1.2.6 Cơ chế tác dụng bromelain hoạt động phân giải protein .9 1.2.7 Ứng dụng bromelain 1.3 Các phương pháp định lượng bromelain 11 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .13 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị đối tượng nghiên cứu 13 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.1.2 Nguyên vật liệu, dung môi, hóa chất 13 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích 14 2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 14 2.2.3 Ứng dụng 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Nguyên tắc định nghĩa đơn vị FIP .14 2.3.2 Pha hóa chất, thuốc thử 15 2.3.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch thử 15 2.3.4 Tiến hành 16 2.3.5 Khảo sát điều kiện 16 2.3.6 Thẩm định phương pháp phân tích 17 2.3.7 Ứng dụng thực tế 20 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Khảo sát .21 3.1.1 Khảo sát bước sóng 21 3.1.2 Khảo sát thời gian tối ưu xảy phản ứng 22 3.1.3 Khảo sát khoảng tuyến tính 22 3.2 Phương pháp định lượng bromelain viên nén 23 3.3 Thẩm định phương pháp định lượng bromelain viên nén 25 3.3.1 Độ đặc hiệu 25 3.3.2 Độ tuyến tính 28 3.3.3 Độ 29 3.3.4 Độ xác (độ lặp lại độ xác trung gian) 30 3.4 Ứng dụng thực tế .33 3.5 Bàn luận .34 3.5.1 Về lựa chọn phương pháp phân tích 34 3.5.2 Về xây dựng phương pháp 35 3.5.3 Về thẩm định phương pháp 37 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .38 4.1 Kết luận .38 4.2 Đề xuất .38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PL-1 Phương pháp định lượng bromelain viên nén PL-2 Khảo sát khoảng tuyến tính PL-3 Khảo sát thời gian tối ưu xảy phản ứng PL-4 Độ đặc hiệu PL-5 Độ tuyến tính (Đường chuẩn) PL-6 Độ PL-7 Độ xác DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ala AOAC ASEAN Asn Cys GlcNAc Gln Gly HPLC HQC ICH LQC Lys MQC ODS Pro R RSD Ser TCA Tryp UV - VIS Val Alanin Association of Official Analytical Chemists Association of South East Asian Nations Asparagin Cystein N-acetylglucosamin Glutamin Glycin High-performance liquid chromatography High quality concentration International Conference on Harmonization Low quality concentration Lysin Medium quality concentration Octadecyl silica Prolin Hệ số tương quan Độ lệch chuẩn tương đối Serin Acid tricloacetic Tryptophan Ultra violet - Visible Valin DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Mơ hình “ổ khóa” “chìa khóa” Hình 1.2 Mơ hình “cảm ứng không gian” .3 Hình 1.3 Sự biến đổi lượng tự Hình 1.4 Cơ chế làm giảm lượng hoạt hóa enzym Hình 1.5 Cấu trúc sợi hydratcacbon bromelain chiết xuất từ thân .5 Hình 1.6 Cấu trúc bậc bromelain Hình 1.7 Hình vẽ minh họa tác động pH mơi trường lên hoạt tính enzym Hình 1.8 Sơ đồ chế xúc tác enzym bromelain hoạt động phân giải protein Hình 3.1 Phổ vi sai dung dịch chuẩn .21 Hình 3.2 Phổ vi sai dung dịch thử 21 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan hiệu mật độ quang thời gian đo 22 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan hiệu mật độ quang nồng độ bromelain .23 Hình 3.5 Phổ vi sai dung dịch placebo 27 Hình 3.6 Phổ vi sai dung dịch placebo + chuẩn 27 Hình 3.7 Phổ vi sai dung dịch thử 27 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính hiệu đáp ứng nồng độ bromelain .28 Hình 3.9 Hoạt tính bromelain đệm 35 Hình 3.10 Hoạt tính bromelain đệm phosphat pH khác 36 Hình 3.11 Hoạt tính bromelain đệm phosphat nồng độ khác 36 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các phương pháp xác định hoạt tính enzym 12 Bảng 2.1 Cách tiến hành phản ứng 16 Bảng 2.2 Dãy dung dịch chuẩn cần chuẩn bị .18 Bảng 3.1 Kết khảo sát động học 22 Bảng 3.2 Kết khảo sát khoảng tuyến tính .23 Bảng 3.3 Kết độ đặc hiệu 26 Bảng 3.4 Kết mẫu nước 26 Bảng 3.5 Kết thẩm định độ tuyến tính 28 Bảng 3.6 Tỷ lệ thu hồi bromelain 29 Bảng 3.7 Kết độ lặp lại 30 Bảng 3.8 Kết độ xác khác ngày 31 Bảng 3.9 Kết độ xác khác người 32 Bảng 3.10 Kết định lượng bromelain viên nén bao tan ruột 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Enzym chất xúc tác sinh học đặc biệt, có chất protein có tác dụng xúc tác cho hầu hết phản ứng hóa sinh xảy thể sống Những năm gần đây, enzym thu hút quan tâm nhiều nhà nghiên cứu nhiều lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y tế, chăn nuôi Trong lĩnh vực y tế, thuốc có chất enzym nghiên cứu đầy đủ cấu trúc, chế tác dụng ứng dụng lâm sàng Bromelain thuốc có chất enzym, nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi dược phẩm Enzym chứa nhóm thiol có khả phân giải protein tìm thấy nhiều thân trái dứa [3, 19, 21] Từ xa xưa, người sử dụng dứa phương thuốc tự nhiên để điều trị chứng khó tiêu dị ứng Cùng với phát triển y học, enzym bromelain trọng nghiên cứu sâu rộng khả điều trị hỗ trợ điều trị bệnh khác hỗ trợ tiêu hóa, điều trị kháng viêm, chống phù nề ngoại khoa, điều trị nhồi máu tim, viêm tắc mạch huyết khối, hỗ trợ điều trị ung thư [21]… Ngày nay, bromelain sản xuất cách tinh chế từ hỗn hợp chiết xuất trực tiếp từ dứa Thành phẩm tạo dạng viên nang viên nén, dùng điều trị nhiều chế phẩm thuốc chứa bromelain cấp số đăng ký cho phép lưu hành Việt Nam Tuy nhiên, phương pháp định lượng enzym dạng nguyên liệu chế phẩm, dược điển Việt Nam dược điển nước dược điển Anh, dược điển Mỹ chưa có chun luận riêng Xuất phát từ thực tế đó, tơi thực đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng bromelain viên nén” với mục tiêu sau: - Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng bromelain viên nén - Ứng dụng định lượng hàm lượng bromelain viên nén 0.513 Comment: DC C1 0.622 Comment: C1.6 0.514 Comment: DC C1.6 0.639 Comment: C2 0.520 Comment: DC C2 0.666 Comment: C2.4 0.520 Comment: DC C2.4 0.679 Comment: C2.6 10 0.521 Comment: DC C2.6 11 0.685 Comment: C3 12 0.513 Comment: DC C3 Report Date: '16:02:38, 04/15/2022 Sample: 'Duong chuan File Name: Duong chuan Run Date: '15:30:12, 04/15/2022 Operator: Trang Comment: ' Instrument Model: U-5100 Spectrophotometer Serial Number: '1999-001 ROM Version: 3J25300 16 Option: 6-Cell Positioner (On) Instrument Parameters Measurement Type: Photometry, Wavelength Data Mode: Abs Number of Wavelengths: Wavelength 1: 275.0 nm Delay: s Slit Width: 5.00 nm Path Correct: On Path Length: 10.0 mm Samp No / Name 0.613 Comment: C1 0.526 Comment: DC C1 0.617 Comment: C1.6 0.511 Comment: DC C1.6 0.634 Abs (275.0) Comment: C2 0.512 Comment: DC C2 0.669 Comment: C2.4 0.522 Comment: DC C2.4 0.678 Comment: C2.6 10 0.516 Comment: DC C2.6 11 0.683 Comment: C3 12 0.511 Comment: DC C3 PL-6 Độ Report Date: '17:04:59, 04/16/2022 Sample: 'Do dung File Name: Do dung Run Date: '16:03:27, 04/16/2022 Operator: Trang Comment: ' Instrument Model: U-5100 Spectrophotometer Serial Number: '1999-001 ROM Version: 3J25300 16 Option: 6-Cell Positioner (On) Instrument Parameters Measurement Type: Photometry, Wavelength Data Mode: Abs Number of Wavelengths: Wavelength 1: 275.0 nm Delay: s Slit Width: 5.00 nm Path Correct: On Path Length: 10.0 mm Samp No / Name Abs (275.0) 0.618 Comment: Chuan LQC 0.505 Comment: DC chuan LQC 0.620 Comment: LQC 0.510 Comment: DC LQC 0.637 Comment: LQC 0.522 Comment: DC LQC 0.648 Comment: LQC 0.531 Comment: DC LQC 0.644 Comment: LQC 10 0.523 Comment: DC LQC 11 0.651 Comment: Chuan MQC 12 0.522 Comment: DC chuan MQC 13 0.672 Comment: MQC 14 0.547 Comment: DC MQC 15 0.655 Comment: MQC 16 0.533 Comment: DC MQC 17 0.660 Comment: MQC 18 0.522 Comment: DC MQC 19 0.665 Comment: MQC 20 0.540 Comment: DC MQC 21 0.668 Comment: Chuan HQC 22 0.526 Comment: DC chuan HQC 23 0.663 Comment: HQC 24 0.520 Comment: DC HQC 25 0.665 Comment: HQC 26 0.524 Comment: DC HQC 27 0.660 Comment: HQC 28 0.511 Comment: DC HQC 29 0.658 Comment: HQC 30 0.525 Comment: DC HQC PL-7 Độ xác Report Date: '18:59:28, 04/15/2022 Sample: 'Do lap lai File Name: Do lap lai Run Date: '18:35:42, 04/15/2022 Operator: Trang Comment: ' Instrument Model: U-5100 Spectrophotometer Serial Number: '1999-001 ROM Version: 3J25300 16 Option: 6-Cell Positioner (On) Instrument Parameters Measurement Type: Photometry, Wavelength Data Mode: Abs Number of Wavelengths: Wavelength 1: 275.0 nm Delay: s Slit Width: 5.00 nm Path Correct: On Path Length: 10.0 mm Samp No / Name 0.642 Comment: Chuan Abs (275.0) 0.521 Comment: DC chuan 0.643 Comment: Thu 0.521 Comment: DC thu 0.658 Comment: Thu 0.529 Comment: DC thu 0.647 Comment: Thu 0.524 Comment: DC thu 0.640 Comment: Thu 10 0.523 Comment: DC thu 11 0.657 Comment: Thu 12 0.525 Comment: DC thu 13 0.646 Comment: Thu 14 0.528 Comment: DC thu Report Date: '15:07:45, 04/18/2022 Sample: 'Do chinh xac khac File Name: Do chinh xac khac Run Date: '14:24:20, 04/18/2022 Operator: Trang Comment: Instrument Model: U-5100 Spectrophotometer Serial Number: '1999-001 ROM Version: 3J25300 16 Option: 6-Cell Positioner (On) Instrument Parameters Measurement Type: Photometry, Wavelength Data Mode: Abs Number of Wavelengths: Wavelength 1: 275.0 nm Delay: s Slit Width: 5.00 nm Path Correct: On Path Length: 10.0 mm Samp No / Name 0.619 Comment: Chuan 0.495 Comment: DC chuan 0.623 Abs (275.0) Comment: Thu 0.507 Comment: DC thu 0.629 Comment: Thu 0.506 Comment: DC thu 0.622 Comment: Thu 0.501 Comment: DC thu 0.627 Comment: Thu 10 0.503 Comment: DC thu 11 0.626 Comment: Thu 12 0.502 Comment: DC thu 13 0.505 Comment: DC thu 14 0.619 Comment: Thu Report Date: '17:46:39, 04/19/2022 Sample: 'Do chinh xac khac nguoi File Name: Do chinh xac khac nguoi Run Date: '17:04:20, 04/19/2022 Operator: Trang Comment: ' Instrument Model: U-5100 Spectrophotometer Serial Number: '1999-001 ROM Version: 3J25300 16 Option: 6-Cell Positioner (On) Instrument Parameters Measurement Type: Photometry, Wavelength Data Mode: Abs Number of Wavelengths: Wavelength 1: 275.0 nm Delay: s Slit Width: 5.00 nm Path Correct: On Path Length: 10.0 mm Samp No / Name Abs (275.0) 0.637 Comment: Chuan S 0.512 Comment: DC chuan S 0.629 Comment: S1 0.512 Comment: DC S1 0.650 Comment: S2 0.523 Comment: DC S2 0.648 Comment: S3 0.519 Comment: DC S3 0.655 Comment: S4 10 0.527 Comment: DC S4 11 0.621 Comment: S5 12 0.513 Comment: DC S5 13 0.642 Comment: S6 14 0.521 Comment: DC S6 15 0.645 Comment: Chuan T 16 0.524 Comment: DC chuan T 17 0.656 Comment: T1 18 0.530 Comment: DC T1 19 0.651 Comment: T2 20 0.525 Comment: DC T2 21 0.663 Comment: T3 22 0.536 Comment: DC T3 23 0.659 Comment: T4 24 0.541 Comment: DC T4 25 0.646 Comment: T5 26 0.519 Comment: DC T5 27 0.654 Comment: T6 28 0.534 Comment: DC T6 ... ? ?Xây dựng phương pháp định lượng bromelain viên nén? ?? với mục tiêu sau: - Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng bromelain viên nén - Ứng dụng định lượng hàm lượng bromelain viên nén CHƯƠNG... chọn phương pháp phân tích Theo tài liệu trình bày phần 1.3, có hai phương pháp để định lượng bromelain định lượng bromelain trực tiếp phương pháp HPLC định lượng bromelain phương pháp xác định. .. lượng bromelain định lượng trực tiếp nồng độ bromelain HPLC định lượng bromelain phương pháp xác định hoạt tính enzym • Định lượng bromelain HPLC Đa số phương pháp định lượng bromelain HPLC sử dụng