Người ta đã chỉ ra rằng rối loạn trầm cảm là hậu quả của giảm nồng độ serotonin ở khe synap, do đó kiểm soát nổng độ serotonin trong dịch sinh học là rất cẩn thiết [1].. Serotonin trong
Trang 1Nghiên cứu định lương serotonin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ huỳnh quang
ChửThị Thanh Huyền*, Đặng Thị Ngọc Lan*, Nguyễn Thị Kiểu Anh*,
Tạ Mạnh Hùng**, Kiều Công Thủy***, Vương Văn Tịnh***, Hoàng Thái Hòa****
*Trường Đại học Dược Hà Nội
**Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
***Bệnh viện Tâm thân Trung ương I
**** Bệnh viện Đa khoa Đức Giang - Hờ Nội
SUMMARY
A rapid, sensitive and accurate analytical method using HPLC-FLD has been validated for serotonin determination in human plasma The following conditions were used: Luna Gemini c 18e column (250 x 4.6 mm; 5 ụm); mobile phase: methanol: 10 mM acetate buffer solution pH 4.0 (6:94, v/v); flow rate: 1.5 ml/min; injection volumes: 100 ịÁÌ and 20 fjL; excitation and emission wavelengths were set a t285 an d345 nm, respectively The linear ranges were 1.02-10.2 ng/ml and 10.2-510 ng/ml with good correlation (r>0.999) The average recovery was 88 -100.4% The precision o f the analytical method was satisfied with R5D less than Ỉ 5% at three levels ofLQC, MQC and HOC The method can be applied to measure serotonin concentration in plasma o f depressed patients in order to improve therapeutic drug monitoring.
Từkhoá; serotonin, huyết tương, HPLC-FLD, nồng độ, bệnh nhân trâm cảm.
Đặt vấn đề
Serotonin là một trong những chất hóa học
trung gian nội sinh quan trọng của hệ thẩn kinh
trung ương, có vai trò quan trọng trong sinh bệnh
lý Người ta đã chỉ ra rằng rối loạn trầm cảm là hậu
quả của giảm nồng độ serotonin ở khe synap, do
đó kiểm soát nổng độ serotonin trong dịch sinh học
là rất cẩn thiết [1] Serotonin trong dịch sinh học
được định lượng bằng HPLC với các loại detectơ
huỳnh quang [2], điện hóa [3], khối phổ [5], trong đó
detectơ huỳnh quang hay được sử dụng do độ nhạy
cao, đơn giản và kinh tế
Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng serotonin trong huyết tương (HT) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ huỳnh quang (HPLC - FLD) và bước đẩu ứng dụng xác định nồng độ serotonin trong HT bệnh nhân trầm cảm, tiến tới phục vụ công tác điểu trị
Nguyên vật liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu
Hóa chất - thuốc thử
- Natri acetat; acid percloric; Đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích
Trang 2- Acid acetic; methanol (MeOH): Dùng cho HPLC
(Merck - Đức)
- Chất đối chiếu serotonin hydrochloric! hàm
lượng 98,0% (Sigma - Aldrich, Mỹ)
- HT trắng (lựa chọn mẫu HT trắng có nổng
độ serotonin thấp): Viện Huyết học - Truyền máu
Trung ương
- Mẫu thử: HT của người tình nguyện (NTN) khỏe
mạnh và bệnh nhân (BN) mắc bệnh trầm cảm điểu trị
ở Bệnh viện Tâm thẩn Trung ương Itừtháng 11 năm
2009 đến tháng 1 năm 2010
Thiết bị nghiên cứu
- Hệ thống HPLC Shimadzu với detectơ huỳnh
quang, phẩn mềm LC Solution 1.22 (Nhật)
- Máy ly tâm lạnh Sartorius Sigma 2 -16K (Đức)
- Tủ lạnh sâu MDF -192 (Đức)
- Máy lắc xoáy Labinco L46 (Hà Lan)
Phương pháp nghiên cứu
- Pha dung dịch chuẩn gốc serotonin: Cân chính
xác chất đối chiếu serotonin hydrochloric! hòa tan
trong hỗn hợp dung môi MeOH: nước (1:1) để được
dung dịch chuẩn gốc có nồng độ serotonin 255 |ig/
ml Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng bằng MeOH
thành các dung dịch chuẩn thứ cấp có nổng độ từ
1,02 đến 510 ng/ml
- Chuẩn bị mẫu để xây dựng phương pháp: Lấy 1
ml dung dịch serotonin chuẩn có nổng độ xác định,
cô dưới dòng khí N2, hòa tan cắn trong 1000 |jl HT
trắng Lắc xoáy 5 phút
- Xử lý mẫu: Lấy 1,00 ml HT (của NTN/ BN/ mẫu
để xây dựng phương pháp), thêm 300 ^1 dung dịch acid percloric 14% Lắc xoáy 3 phút, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút Lấy dịch nổi đem sắc ký
- Điều kiện sắc ký: Cột sắc kí Luna Gemini C18e (250 X 4,6 mm, 5 |am ); nhiệt độ cột: 40°C; pha động: MeOH - dung dịch đệm acetat 10 mM pH 4,0 (6 : 94); tốc độ dòng : 1,5 ml/phút; thể tích tiêm mẫu: 100 |jl hoặc 20 |jl; phát hiện bằng detectơ huỳnh quang với bước sóng kích thích
và phát xạ lẩn lượt là 285 nm và 345 nm
Kết quả và bàn luận
Thẩm định phương pháp phân tích
- Tính chọn lọc: Phân tích các mẫu sau:
Mẫu chuẩn; Dung dịch serotonin chuẩn nồng độ
51 ng/ml trong pha động
Mẫu HT trắng, mẫu HT trắng thêm serotonin chuẩn: Xử lý mẫu theo qui trình trên
Tiến hành sắc ký Kết quả được trình bày ở hình 1 Nhận xét: Kết quả ở hình 1 cho thấy, pic của serotonin có thời gian lưu khoảng 4,6 phút, pic gọn, cân đối, không bị xen phủ với các pic khác (A) Trên sắc đổ của mẫu HT trắng có một pic nhỏ tại vị trí tương ứng với thời gian lưu của serotonin
vì serotonin là chất nội sinh luôn có trong HT (trong khoảng 4 - 5 phút) (B) Khi thêm chuẩn serotonin vào mẫu HT trắng pic ứng với thời gian lưu của serotonin tăng lên (C) Do vậy, phương pháp phân tích có tính chon loc đối với serotonin
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 s.o í 2! s 5.0 7.5 10.0 min
mV(x100)
jDetectorA:Bc285tím,Bn:345nm
m a 0.0
Hình V Sẵc kí đỗ (A) mẫu serotonin chuẩn nóng độ 51 ng/iĩìL: (B) mâu huyễt tương trổng: (Q mõu huỵét tương trổng thêm chuổn; (D) máu H ĩ bệnh nhân 6 SŨU điểu trị
Trang 3- Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong mẫu
HT trắng có một lượng serotonin ban đẩu nên
chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp
định lượng serotonin trong HT theo kỹ thuật
thêm đường chuẩn
Do nổng độ serotonin trong các mẫu thực (HT NTN
khỏe mạnh ở nhóm đối chứng và HT BN mắc bệnh
trẩm cảm trước và sau điều trị) có sự khác biệt rất lớn
Để đáp ứng yêu cẩu thẩm ( í nh phương pháp phân tích
thuốc trong dịch sinh học (r > 0,99), chúng tôi tiến hành
xây dựng 2 đường chuẩn để đảm bảo phân tích được
nồng độ serotonin trong tất cả các mẫu thực
Bảng 1: Kă quò kháo sát Iđioỏng nông độ tuyến tính của serotonin trong huỵét tương
Đường chuẩn 1 Đường chuẩn 2
Nồng độ Diên tích pic Nồng độ Diện tích pỉc
(ng/mlj (mv.giây) (ng/mlj (mV.glây)
Hệ số tương quan: r = 0,9996 Hệ sổ tương quan: r = 0,9999
Phương trình hổi quy: Phương trình hổi qui:
y = 57842 x + 499589 y= 17936 x + 242377
Chuẩn bị hai dãy chuẩn trong HT trắng với nổng độ thêm serotonin lẩn lượt là 1,02 -10,2 ng/
ml (đường chuẩn 1 - thể tích tiêm mẫu 100 |jl) và 10.2 - 510 ng/ml (đường chuẩn 2 -thể tích tiêm mẫu
20 |jl) Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký Kết quả được trình bày ở bảng 1
Nhận xét: Kết quả ở bảng 1 cho thấy có sự phụ
thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng
độ serotonin trong khoảng nổng độ khảo sát (1,02 -10.2 ng/ml và 10,2 - 510 ng/ml) với hệ số tương quan
r đểu lớn hơn 0,99 đáp ứng yêu cẩu qui định phân tích thuốc trong dịch sinh học [4], Khoảng nồng độ lựa chọn khảo sát ứng với khoảng nồng độ serotonin trong HT NTN khỏe mạnh và bệnh nhân mắc bệnh trầm cảm
- Độ đúng, độ chính xác: Tiến hành xác định
ở 3 mức nồng độ (LQC, MQC, HQC) đối với mỗi khoảng nồng độ tuyến tính Xác định độ chính xác và độ đúng bằng cách thêm chính xác serotonin vào HT trắng ở các mức nổng độ 2,04; 4,59 và 8,16 ng/ml (đối với đường chuẩn 1) và 25,5; 255; 357 ng/ml (đối với đường chuẩn 2) Mỗi nổng độ làm song song 6 mẫu Kết quả được trình bày ở bảng 2
Bảng 2: Két quà kháo sát độ đúng, độ chính xác
Mẫu Nồng độ
(ng/mlj Độ đúng (%)
Trung bình (%) RSD(%) Mẫu
Nồng đô (ng/
mlj Độ đúng (%)
Trung bình (%) RSD(%)
LQC
(2,04ng/ml)
2,02 99,0
100,4 3,89 LQC2
(25,5 ng/ml)
23,0 90,2
91,1 3,41
MQC
(4,59ng/ml)
3,97 86,5
(255ng/ml)
234,0 91,8
94,1 3,62
HQC
(8,16ng/ml)
7,19 88,1
(357ng/ml)
361,6 101,3
100,1 1,06
Trang 4Nhận xét: Độ chính xác với giá trị độ lệch chuẩn
tương đối từ 1,06 đến 5,24% (<15%), độ đúng trung
bình nằm trong khoảng 88,0 -100,4% cho thấy phép
thử đạt yêu cẩu vể độ đúng, độ chính xác theo qui
định vể phân tích thuốc trong dịch sinh học [4]
chuẩn có nổng độ thấp nhất trong khoảng nồng độ
tuyến tính (1,02 ng/ml - đường chuẩn 1 và 10,2 ng/
ml - đường chuẩn 2) Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký
Tính kết quả dựa vào đường chuẩn xây dựng trong
cùng ngày phân tích Xác định độ đúng và độ chính
xác tại các nổng độ Kết quả được trình bày ở bảng 3
Bỏng3:KétquàkhỏosàLLOQ(n=6)
Kết quả
thống kê
1,02 ng/ml (thểtích tiêm 100 |iỉ)
10,2 ng/ml (thể tích tiêm 20 |jl) Nồng độ
serotonin
(ng/ml)
Đô đúng (%)
Nồng độ serotonin (ng/ml)
ĐÔ đúng (%) Trung bình 0,895 87,82 11,12 109,0
Kết quả ở bảng 3 cho thấy, tại 2 nồng độ 1,02 ng/
mi và 10,2 ng/ml, độ đúng so với nồng độ thực có
trong mẫu chuẩn nồm trong khoảng 80 -120%, độ
lặp lại sau 6 lẩn phân tích có RSD < 20% Như vậy,
LLOQ của phương pháp là 1,02 ng/ml (đường chuẩn 1) và 10,2 ng/ml (đường chuẩn 2)
Nhận xét chung: Từ những kết quả thẩm định về tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ
chính xác, giới hạn <Jnh lượng dưới của phương pháp HPLC định lượng serotonin trong HT thu được ở trên, chúng tôi cho rằng phương pháp này có thể dùng để đnh lượng serotonin trong HT nhằm ứng dụng để đánh giá nổng độ serotonin trong HTcủa các mẫu thực
ứng dụng phân tích serotonin trong mẫu thực
Lấy khoảng 3 tnl máu của NTN khỏe mạnh hoặc
BN vào ống nghiệm có chứa chất chống đông EDTA, lắc nhẹ, ly tâm lấy HT và bảo quản ở - 80°c tới khi phân tích Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký Hình 1 (D)
là sắc ký đổ mẫu HT bệnh nhân trẩm cảm sau khi điểu trị, pic serotonin được tách rõ ràng Dựa vào đáp ứng phân tích của mẫu thử, lựa chọn một trong hai đường chuẩn đã xây dựng sao cho đáp ứng phân tích của mẫu thử nằm trong khoảng tuyến tính khảo sát của đường chuẩn Từ đó, tính kết quả nổng độ serotonin trong mẫu thử dựa vào đường chuẩn xây dựng trong từng ngày phân tích với hệ số tương quan không nhỏ hơn 0,99 Kết quả được trình bày ở hình 2 và bảng 4
Bòng 4: Kồ quả định lượng serotonin trong h ẹ â tương cácmău thực
NTN khỏe mạnh Bệnh nhân
STT Nồng độ
(ng/ml)
Trước điểu trị Sau điều trị STT Nồng độ
(ng/ml) STT
Nồng độ (ng/mlj
(ngTml) 409,3 (ngTml) 9,46 (ngTml) 50,5
(ng7ml) 72,62 (n§fml) 2,44 (ng?ml) 12,1
Trung vị
(ng/mlj 184,7
Trung vi (ng/mlj 5,73
Trung vị (ng/mlj 23,9
Đồ thị blều (liễn nồng độ serotonin trong huyết tw<mg
các mẫu thục
♦NTN ■BN tiirớc điài tiị ABNsau điềiitiị
450 400 350 300 250
I 200
) 100
.ầ ấ M m M ■
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920
_M ấ i tìtực
Hình 2: Đổ thị biểu diễn nông độ serotonin ĩrong huyết tương NTN vò bệnh nhân
\
Số 2/2013 1 NghỉêncứuduợữThốngtlnthuõc Ị 67
Trang 5Tiến hành đánh giá nổng độ serotonin của
bệnh nhân trước và sau điểu trị dựa trên phân tích
so sánh cặp test t (paired t test) Kết quả cho thấy
có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa nồng độ
serotonin của bệnh nhân trước và sau điểu trị với
p = 0,0013 (The two-tailed p value) Như vậy, bệnh
nhân có đáp ứng khả quan với phác đổ điểu trị Tuy
nhiên, nồng độ serotonin vẫn còn ở mức thấp hơn
so với của người bình thường cần duy trì tiếp quá
trình điểu trị
Kết luận
Phương pháp định lượng serotonin trong HT bằng HPLC đả xây dựng có độ chính xác cao, độ đúng đảm bảo, khoảng tuyến tính khá rộng và tính chọn lọc đảm bảo Quy trình xử lý mẫu đơn giản, chỉ cần dùng dung dịch acid percloric để kết tủa protein
Do đó, khả năng ứng dụng vào thực tế là rất khả thi Phương pháp phân tích này có thể ứng dụng
để xác định nồng độ serotonin trong HT bệnh nhân mắc bệnh trầm cảm trước và sau điểu trị, tiến tới phục vụ công tác điều trị bệnh
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bùi Quang Huy (2008), Trầm cảm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
2 George M Anderson, Frederick C Feibel, and Donald J Cohen (1987), "Determination of serotonin in whole blood, platelet - rich plasma, platelet - poor plasma and plasma ultrafiltrate", Joưmđ/ofL/feSc/ences, 40, pp 1063 -1070.
3 Bianca Marasini, Maria Luisa Biondi, Piergiorgio Pietta, Angelo Agostoni (1985), "High - performance liquid chromatography assay of
serotonin in human plasma", La Ricerca Clin Lab 15,63, pp 63*- 69.
4 u.s Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evalution and Research (2001),
Guidance for Industry - Bioanalytical Method Validation.
5 Wilhelmina H A de Jong, Marianne H L I Wilkens, Elisabeth G E de Vries, Ido p Kema (2010), "Automated mass spectrometric
analysis of urinary and plasma serotonin", Analytical and Bioanalytical Chemistry, 396(7), pp 2609-2616.