3 Quraishi S., David A., Depot haloperidol decanoate for schizophrenia, The Cochrane Database o f Systematic reviews, 1999, Issue I Jann M.W., Ereshefsky L., Saklad S.R., Clinical pharmacokinetics o f the depot antipsychotics, Clin Phamiacoklnetlcs, , 10, 315-353 British Pharmacopoeia, volume 1,2003,1431-1433 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CÀO ĐỊNH LƯỢNG CIPROFLOXACIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI Nguyên Tứ Sơn, Phạm Thanh Hà, Nguyễn Thị Liên Hương Hoàng Thanh Thủy, Lê Bá Hải Trườrìg Đại học Dược Hà Nội SUMMARY This study aimed to validate a simple high-performace liquid chromatographic (HPLC) method for the quantitative analysis o f ciprofloxacin in human plasma Protein in plasma was precipitated with 20% percloric acid solution Chromatographic separation o f ciprofloxacin in plasma was achieved with a Cl column with ultraviolet detection a t278 nm The mobile phase consisted o f phosphate buffer (mixture of0.025M K H fO ^ O.OSM TBA.H^SO^ pH = 3.0) and acetonitril (87/13 v/v) The method was specific and validated with a lim it o f quantification o f 0.2 m g/L.Thelntra-and inter-day coefficients o f variation were between 0.91 and 7.24% and accuracy between 1.14 and 3.62% Ciprofloxacin was stable in plasma for Ì days a t - 40°c and after three freezing-thawing cycles The method was suc cessfully applied to determine ciprofloxacin concentration In some patient plasma samples Keywords: Ciprofioxacin: HPLC; Validation Đ ặ t vấn đề Ciprofloxacin (CIP) m ột kháng sinh tổ ng hợp th uộ c nhóm Q uinolon hệ II, có hoạt phổ kháng khuẩn rộng, có hiệu tố t chủng vi khuẩn G(-) n hư trự c khuẩn mủ xanh (p.aeruginosa) Cùng với việc dùng CIP phổ biến tính kháng vi khuẩn ngày gia tăng nay, nhà chuyên môn đặt câu hỏi vé nóng độ CIP huyết tương bệnh nhân có đạt yêu cẩu hay không Điều đòi hỏi cẩn có phương pháp định lượng CIP huyết tương nhanh xác Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) dùng phổ biến để định lượng CIP loại dịch sinh học th ế giới chưa có công bố thức Việt Nam Nghiên cứu nhằm giới thiệu m ột phương pháp định lượng CIP đơn giản, nhanh chóng kết tủa protein, không dùng chất chuẩn nội Phương pháp thẩm định theo tiêu chí FDA đâ áp dụng định lượng nóng độ ciprofloxacin huyết tương bệnh nhân Phương pháp áp dụng xác định nhanh nóng độ ciprofloxacin bệnh nhân dùng ciprofloxacin để đưa định điéu chỉnh liều lượng thuốc lâm sàng N guyên liệ u p hư n g p há p n g h iê n cứu N g u y ê n liệ u , h ó a ch ất: - Ciprofloxacin.HCI chất chuẩn quóc gia (Hàm lượng 99.40%, độ ẩm %) (Viện Kiểm nghiệm Trung ương),huyết tương trắng: Viện Huyết học Trung ương - AcetonitrilJBA.HjSO^ (dùng cho HPLC, Merck, Đức), K H /0 ^ , NaOH, HjPO^, HCIO^ (đạt tiêu chuẩn tin h khiết) H ệ th ố n g v đ iề u k iệ n s c k ý Hệ thống sắc ký Agilent 1100 với bơm mẫu tự động kết nói với hệ thống máy tính, máy in phắn mém xử lý chuyên dụng Cột sắc ký C18 (4,6 x150 mm; ỊẦ m), có sử dụng tiền cột bảo vệ Detector u v đặt bước sóng 278 nm Hệ pha động góm acetonitril đệm phosphat pH 3,0 (0,025M KHjPO,; 0,05M TBA.H^SO^) với tỳ lẹ đệm : acetonitril = 87:13 Pha động pha ngày, lọc qua màng lọc 0,45 ỊẦ m sau siêu âm loại b ọt khí trưác sửdụng.Tốc độ dòng 1,0 m l/ phút, định lượng điểu kiện nhiệt độ phòng ị ỉ l ì D u n g d ịc h c h ấ t c h u ẩ n v đ n g ch u ẩ n Pha dung dịch chuẩn gốc CIP nồng độ 1,2 g/L nước, sau pha dung dịch chuẩn làm việc có nông độ tương ứng cao nóng đọ CIP huyết tương 20 lẩn (160, 120, 60, 20,10 mg/L) Dung dịch chuẩn gốc bảo quản ngăn m át tủ lạnh, tránh ánh sáng ổn định 30 ngày Dải nóng độ đường chuẩn chuẩn bị định lượng hàng ngày từ 0,2 m g/L tới 8,0 m g/L cách pha loãng 20 lẩn dung dịch chuẩn làm việc với huyết tương trắng (0,2-0,5-1,0-3,0-6,0-8,0 mg/L) Mâu kiểm chứng (QC) chuẩn bị theo quy trình giống với pha đường chuẩn dung dịch góc khác Có nóng độ QC lựa chọn 0,5 m g/L (LQC), 3,0 m g/L (MQC) 6,0 m g/L (HQC) Q u y trìn h x lý m â u Thêm 20 dung dịch acid phosphoric 85% 200 pl dung dịch acid percloric 20 % vào ống nghiêm chứa 1,0 ml huyết tương (có CIP) để kết tủa protein huyết tương Lác xoáy máy Vortexer 45 giây Hỗn hợp ống nghiệm ly tâm 6000 vò n g /p h ú t 15 phút Dùng xilanh ,0ml chuyển phẩn dịch lỏng phía sau ly tâm vào lọ (vial) hệ sắc ký.Thể tích tiêm mẫu làSOnl Tiêu c h u ẩ n th â m đ ịn h p h n g p h p Thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn FDA (2001) [ 8]với tiêu c h í: tính chọn lọc, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại (trong ngày khác ngày), độ ổn định, xác định giới hạn định lượng (LLOQ) Kết n g h iê n cứu T ính c h ọ n lọ c c ủ a p h n g p h p Xử lý mẫu phân tích mẫu theo qui trình chọn Tiến hành sắc ký vỏi mẫu (mẫu trắng, mẫu chuẩn) Ghi lại sắc đổ so sánh sắc đổ mẫu huyết tương trắng (không có CIP) vối sắc mẫu huyết tương trắng có CIP Kết thể ỏ hình sau: Hình Sác mòu huyít tuơng trâng itiiC!ìỉwnacHOFiraiiir i lí Hinh Sắc đồ huyết tương có CỈP (3mg/L) Từ hình cho thấy sắc đổ mẫu trắng vị trí tương ứng với khoảng th i gian lưu CIP (từ 5,2 đến phút) không xuất pic lạ Mâu chứa CIP xuất pic cân đối, sác nét, tách riêng biệt Vậy phương pháp phân tích đạt tính chọn lọc theo tiêu chuẩn Tính tu y ế n tín h Tiến hành phân tích mẫu đường chuẩn Từ đáp ứng pic CIP nóng độ tương ứng, xây dựng phương trình hổi quy tính hệ số tương quan r.Tính lại nóng độ theo phương trình hói quy đâ xây dựng được, xác định lại độ so với giá trị thực nóng độ (độ lệch %) Kết trình bày bảng : Kết bảng cho thấy khoảrií^ nồng Báng Sựphụ thuộc diện tích plc vá nồng độ CIPpha huyết tương c - NSng độ thực (mg/L) D lịn tích ímAU.i) 0.Ĩ1 0,52 1,05 lĩ* 6,2Ĩ 13,9 39,0 9Ỉ,0 277,6 54ỉ,s Phương trình h ìm Tính (%) c«,ií »16 S=8S,6S2C-4J7ĩ(!r = 0,99911 99,9 93,6 m,0 101,4 9S,6 100,6 độ từ 0,2 đến 8,0 m g/L có tương quan tuyến tính nóng độ CIP có mẫu diện tích pic CIP thu với hệ số tương quan r xấp xi (r = 0,9998) Do đó, từ đường hói quy tính toán nóng độ CIP huyết tương với độ tin cậy cao Đ ộ đ ú n g đ ộ c h ín h x c (độ lậ p lạ i) tro n g n g y k h c n g y Tiến hành sắc ký lô mẫu QC bao gồm: LQC, MQC, HQC, lô mẫu gổm mẫu độc lập có nóng độ Xác định kết định lượng mẫu QC theo đường chuẩn pha huyết tương trắng, tiến hành điéu kiện, ngày ngày khác (mỗi ngày mẫu với nồng độ) Kết thu bảng bảng Kết cho thấy phương pháp có độ tố t (96,9 - 103,6 % so với nóng độ lý thuyết), độ xác với giá trị RSD đéu 15% (0,91 7,24%), đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ xác p h ng pháp phân tích tro n g dịch sinh học Bảng Độ độ chỉnh xác ngày Nóng độ lý thuyết (mgÁ) Nóng độ thực tế Tính (mg/L-ĨB±SD) (%) ĩỉnh xác (RSD%) Bâng Kẽt quà khảo sát đậ ổn ếmh sơu chu kỳ đông rõ đông huyết tương NốnqđộcủaCIP(mgA) M ả uL Q C (n = ) Ban M ẫ uH Q C (n = ) đầu Sau chu kỳ Ban đẦu Sau chu kỳ ĨB±SD ỡ,5i±ỡ,0í Ồ,54±0,0Ỉ 6,03±0,04 6,04±0,21 RSD% 1,89 106 0,63 3,40 ỈOỠ 101.9 m m ,2 ĩỷlệso vái ban đâu (%} hai khoảng nóng độ thấp cao, nồng độ CIP mẫu trải qua chu kỳ đông - râ đông chênh lệch không 5% (95- 105%) so với mẫu ban đầu cho thấy mẫu huyết tương ổn định sau chu kỳ đông - rã đông Oộ ổn định dài ngày LQC(n=5) 0,52 0,53 ±0,03 Ỉ0Ĩ,9 4,99 MQC(n=5) 3,09 120 ±0,06 W3,6 195 HQC(n^S) 6.18 5,99±0,0S 0,9Ỉ Bâng Độ độ xác khác ngày (3 ngày) Nóngđộlýthuyễt (lĩĩg/l) chuẩn bị Kết so sánh nóng độ CIP mẫu ban đẩu mẫu để ổn định qua chu kỳ đông - rã đông trình bày bảng sau: Nóng độ thực tẻ(mgA-ĨB ±SD) ĩỉnh (%) Tính xác (RSD%) LQC(n=ĩS) 0,52 0,52 ±0,04 100,0 7,24 MQC(n^ĩ5} 3,09 3,ư±0,10 102,6 3,09 HQ((n=ĩ5) 6,18 6,04 ± ,u 97,7 2,20 Chuẩn bị mẫu LQC mẫu HQC mẫu nồng độ dùng để định lượng Các mẫu lại bảo quản mẫu điếu kiện - 40°c Xác định nồng độ CIP mẫu sau khoảng th ời gian: ban đấu, sau ngày, sau 18 ngày So sánh kết định lượng thời điểm khảo sát với kết định lượng ban đáu thu Kết phân tích độ ổn định dài ngày trình bày bảng Bàng Kẽt khảo sát độ ổn ĩịnh dời ngày M ẵ u lQ C ( n = ) Đ ộ ổ n đ ịn h c ủ a m ấ u h u y ế t tư n g tro n g q u trìn h x lý v b ả o q u ả n Xác định độ ổn định CIP sau chu kỳ đòng - rã, trình xử lý màu th ời gian bảo quản dài ngày mẫu LQC (0,5 mg/L), HQC (6 mg/L) Tại nồng độ tiến hành song song mẫu.Tất mẫu tiến hành xử lý chạy sắc ký theo qui trình xây dựng, đóng th ời tiên hành phân tích với m ột đường chuẩn Độ ổn định sau chu kỳ đông - rã đông Tiến hành: Chuẩn bị mẫu LQC (0,5 mg/L), mẫu HQC (6 mg/L) mẫu nóng độ dùng để định lượng mẫu lại bảo quản nhiệt độ -40°c 24 giờ, lấy để tan nhiệt độ phòng Sau tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại đông lạnh vòng - Lặp lại chu kỳ đòng - râ trê n lần nửa Sau tiến hành phân tích mẫu sau lẩn rả đông th ứ So sánh kết lượng CIP có mẫu sau chu kỳ đông - râ đông với lượng CIP có mẫu vừa SỐ emOki asĩiứoi ĨB±SO m M Ã u H Q C (n = ) SatĩngỀị/ SaiỉSng^ Bmđíu Sai7ngẻ^ Saiỉ8 ữS4iứ01 ũ S ĩiíiũ ĩ ¿Ỉ5 Z90 ậ63 5,9im0 168 m ỉơĩ,9 mo mo 935 m ậ m ỉỉ ỹíSOKÍ taìđki mo m Kết phân tích cho thay nồng độ CIP mẫu bảo quản 18 ngày điếu kiện - 40°c chênh lệch không 5% so với ban đẩu Độ ổn định trình xửlý Tiến hành phân tích so sánh lượng CIP có mẫu phân tích sau rã đông mẫu phân tích sau để râ đông nhiệt độ phòng - Kết phân tích mẫu huyết tương chứa CIP th ời điểm h sau rã đông nhiệt độ phòng với mẫu phân tích sau pha trình bày bảng sủng Kết quà khàosát ơộ ổn định trìiĩh xùlỷ M Ỉu L Q C TB±SD RSD% Tỷlệsovởi banđâij(%) 3/2012 i M ãu HQ C B an đầu S a u g iờ Ban đầu S a u g iò r 0,53±0,01 , i± a o i 6,0ĩ±0,04 5,90±0,S7 1,89 S.73 0,63 9,64 100,0 ỈOO,ũ 10ơ,0 97.8 Nghién cứu dược Thống tln thuồc 87 Kết cho thấy trình xử lý mẫu, nóng độ CIP chênh lệch không 5% so với ban đáu X c đ ịn h g iớ i h n đ ịn h lư ợ n g d i (LLO Q) c ủ a phương pháp Chuẩn bị mẫu huyết tương trắng mẫu chuẩn có nóng độ CIP khoảng 0,2 m g/L (tương ứng khoảng 1/30 - 1/10 c ) Nồng độ Cmax xác định dựa tài liệu còng bố [9],Tiến hành phân tích mẫu ghi lại đáp ứng pic mẫu trắng mẫu chuẩn Tính lại nóng độ mẫu khảo sát dựa vào đường chuẩn xây dựng điéu kiện, từ xác định độ đúng, độ xác nóng độ Kết thấy đáp ứng mẫu chuẩn khoảng thời gian lưu CIP (nồng độ 0,2 mg/L) có chiều cao 10 lẩn đáp ứng mẫu trắng Tính nồng độ CIP mẫu chuẩn dựa vào đường chuẩn làm ngày, thấy độ so với nồng độ thực từ 93,2 đến 100,5% độ xác sau lán phân tích với RSD 2,82% Như mẫu chuẩn chứa CIP nống độ 0,2 m g/L đáp ứng yêu cầu giới hạn định lượng phương pháp phân tích dịch sinh học Giá trị LLOQ phương pháp xác định 0,2mg/L B c đ u p d ụ n g trê n m ấ u h u y ế t tư n g b ệ n h n h â n d ù n g c ip ro flo x a c in M ột số mẫu huyêt tương bệnh nhân dùng ciprofloxacin đường tĩnh mạch với liều 400mg/lẩn, ngày lẩn định lượng theo phương pháp Kết sắc trình bày hình sau : Bàn luận Phương pháp định lượng xây dựng sở tham khảo tài liệu vế sắc ký lỏng hiệu cao định lượng CIP Trong đó, cột C18 pH đệm 3,0 mô tả điều kiện thích hợp cho định lượng CIP [2] Mặc dù m ột số nghiên cứu sử dụng detector huỳnh quang để phân tích [4],[7],Tuy nhiên, detector huỳnh quang thường không sẵn có nhiéu phòng th í nghiêm Detector uv sử dụng nghiên cứu phù hợp với điều kiện phòng th í nghiệm Việt Nam Nghiên cứu dùng kết tủa protein huyết tương cho việc xử lý mẫu đơn giản, tiế t kiệm an toàn so với dùng chiết lỏng -lỏ n g dùng cho nghiên cứu [1],[3],[5] Hơn việc kết tủa m ột lượng nhỏ HCIO4 không làm thay đổi thể tích lớn Thời gian phân tích nghiên cứu khoảng 7,5 p h ú t/ mẫu nên có ưu điểm phân tích nhiều mẫu th ời gian ngắn so với nghiên cứu [3] 17 p hú t [7] 15 phút Giới hạn định lượng phương pháp 0,2 m g/L mức lựa chọn nhiéu nghiên cứu dùng detector uv phân tích [1],[3],[5] Giới hạn định lượng phù hợp với nghiên cứu chế độ liều CIP lặp lại lâm sàng Nóng độ đỉnh (C ) CIP huyết tương khoảng 2,97 m g/L tớ i 4,6 m g/L với đường uống đường tĩnh mạch mức liều thông thường Do nghiên cứu chọn nống độ 8,0 m g/L giới hạn đư ờng chuẩn [9] K hoảng n ố n g độ tro n g đ ờng chuẩn lựa chọn rộng (từ 0,2 tới 8,0 mg/L) phù «1 mẫ « I Hình sđc đổ mỏu huyét rương bệnh nhân thời d?ếm0,5h (6,03 mgA) Kết cho thấy pic ciprofloxacin huyết tương bệnh nhân cân đối, sắc nét, tách riêng biệt khỏi pic khác sắc Thời gian lưu phù hợp với kết nghiên cứu Như kết bước đẩu cho thấy có độ chọn lọc tốt Hình Sốc đố mău huyéĩ tương bệnh nhân thời điểm 8,0h (ỉ,5mgA) hợp với khoảng dao động rộng nóng độ CIP cá thể, đặc biệt có chức thận suy giảm dẫn tớ i nóng độ thuốc cao , I I; : , ^ ^ Đã th ẩ m đinh đươc phương pháp HPLC đ in h " " 7 u ? i u f °, r í" U Ĩ T ĩ M í u ! " lại cao độ on định tot Ngoài raphương pháp dễ dàng xử lý m ẫu d ù n g detector uv phổ biến Phương pháp áp dung ' r ú U ú -đ ' (ì “ t- “ V '3 xác đ ịn h nhanh n ong độ cip ro flo xa cin bệnh nhân dùng ciprofloxacin để đu^ 7a đinh điéu chinh l i ^ lượng thuốc lâm sàng TÀI LIỆU THAM KHẢO Amini M, Khanavi M, Shafiee A(2004), «Simple High - Performance Liquid Chromatographic Method for Determination of Cipro floxacin in Human Plasma», Iranian Journal o f Pharmaceutical Research, (2), pp 99 - 101 De Witte B, Dewulf J, Demeestere K, De Ruyck M, Van Langenhove H(2007), «Critical points in the analysis of ciprofloxacin by high - performance liquid chromatography», Journal o f chromatograpy A, (114Ũ), pp 126 - 130 Geijiswijk I.M, Zanten A.R.H, Meer Y G(2006), «Reliable New High - Performance Liquid Chromatographic Method for the Determi nation of Ciprofloxacin in Human Serum», Therapeutic Drug Monitoring, 28(2), pp.278 - 281 Imre s, Dogaru MT, Vari CE, Muntean X Kelemen L(2003), «Validation of an HPLC method for the determination of Ciprofloxacin in human plasma», Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 33, pp 125 - 130 Kamberi M, Tsutsumi K(1998), «Determination of ciprofloxacin in plasma and urine by HPLC with ultraviolet detection», Clinical Chemistry, pp 1251 - 1255 Manuela T Maya et al, (2001), «Simple high-performance liquid chromatographic assay for the determination of ciprofloxacin in human plasma with ultraviolet detection», Journal of chromatograpy B, (775), pp 305 - 309 Vybiranová z (2005), «High - performance liquid chromatographic determination of ciprofloxacin in plasma samples», Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, (37), pp 851 - 858 u.s Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Centre for Drug Evalution and Research(2001), Guidance for Industry - Bioanalytlcal Method Validation for Human Studies System Pharmacists - American Society of Health (2Ũ10), AHFS Drug information ... ột số mẫu huyêt tương bệnh nhân dùng ciprofloxacin đường tĩnh mạch với liều 400mg/lẩn, ngày lẩn định lượng theo phương pháp Kết sắc trình bày hình sau : Bàn luận Phương pháp định lượng xây dựng... định lượng xây dựng sở tham khảo tài liệu vế sắc ký lỏng hiệu cao định lượng CIP Trong đó, cột C18 pH đệm 3,0 mô tả điều kiện thích hợp cho định lượng CIP [2] Mặc dù m ột số nghiên cứu sử dụng... lại sắc đổ so sánh sắc đổ mẫu huyết tương trắng (không có CIP) vối sắc mẫu huyết tương trắng có CIP Kết thể ỏ hình sau: Hình Sác mòu huyít tuơng trâng itiiC!ìỉwnacHOFiraiiir i lí Hinh Sắc đồ huyết