BO GIAO DUC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
THÁI ĐẠI QUÂN
NGHIÊN CUU XAC DINH VITAMIN C TRONG THUOC, THUC PHAM CHỨC NĂNG, HOA QUÁ VÀ NƯỚC GIẢI KHÁT
BANG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
LUđN VũN THIC Sũ HÚA HIC
Trang 2
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
THÁI ĐẠI QUẦN
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH VITAMIN C TRONG THUĨC, THỰC PHẢM CHỨC NĂNG, HOA QUÁ VÀ NƯỚC GIẢI KHÁT BẰNG
PHƯƠNG PHAP SAC KY LONG HIEU NANG CAO CHUYEN NGANH: HOA PHAN TICH
MA SO: 60.44.29
LUđN VON THOC SO HUA HOC
Người hướng dẫn khoa học:
TS ĐINH THỊ TRƯỜNG GIANG
Trang 3MUC LUC
DANH MUC CAC KY HIEU VA CHU VIET TAT DANH MUC CAC BANG
DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỎ LOI CAM ON
CHUONG 1 TONG QUAN TALI LIEU esessesssssessessseseeseescesessessneneeseenes 3
1.1 Giới thiệu về vitamin ¿5 5s+++sxeexextsrxerersersrserreree 3
INN4.T n8hhG .4 3 112 Đặc điểm chưng và phán Ìoại - 5+ 2c S218 E12511 1351355111511 xc2 3
1.1.2.1 Dac diém chung
1.122 Phân loại 1.2 Vitamin C (Acid ascorbic)
WK WwW 1.21 Lược sử
1.23 Phân loại vitamin C Sứ
1.24 Cấu tạo của vifdimiH C 5+ tt SE SE E1 gxggngrgrrey 6
1.2.5, NQUON GOC.oeccccscescsessesessessessesessessessscsseesssesssessvasstsseetesssavansaeeseeeesees 7
1.2.5.1 Nguồn gốc /57/17.2:8PEPPPRA 6 a a 7
1.2.5.2 Nguơn gốc từ động vật . 5: 225 E121121211212121221211222xxe 9 1.2 6 Vai trị của vitamin C trong co’ thé SONg c0.c0ccceescesvesesesees ves esseseees 10 1.2.7, Nhu clita vé Vitainin Cocceccecsesssssessessssssssesesssasesssessssesssesessuesssseaseasens 10 1.2.7.1 Thiếu vitamin C - 5: 5+ 2t 2 55221221511221121121121121 1121221 xe 12 I2ZN.,.a 0n ốốỐằỐỐằ 13
1.3 Giới thiệu các đối tượng nghiên cứu . + «>sess=xsss2 14
Trang 41.3.3 Thuốc HAP.4ACOL KID%S - 2-5252 S5+‡StSxtSxeExesxtrtrsrrxerrvsrs 15 1.3.4 Thuốc AMPHA BC COIMLEX -22©55c55z+csesxerxrrrxrrxerres 17 1.3.5 Thực phẩm chức năng: RUTIIN-C 5©5+Scccccseceecsrcrrrrs 18 1.36 Thực phẩm chức năng: Nam dược giải rượi ccccccccsccsc+ 19 1.37 Nước giải khát (Faith) nước khống chanh muiỗi 5-2 21 1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - 21
1.41 Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 21 LALA, Co SOD) Mel co.cc cece cccccccceceescecesesceseseevevesescsvesesvssesestssesestevesesessesese 21
1.412 Nguyên tắc của quá trình sắc ky) trong COb .cccccccccceccccscesescecesesesvesees 22 1.4.1.3 Phân loại sắc ký và ứng địng, .- 5S E22 2e 23
1.4.1.4 Cac dai lượng đặc trưng của sắc ̇ý đồ 55222 1E222E2522222224 24
1.4.1.4 1 Thời gian lưu: Nelention tim (ÍR) - - 555 5:5 S252 3S Ssx‡szxxs2 24
14142 Hệ số dung lượng KÌ 25
1.4.L43 Độ chọn ÏỌC Œ TS 1121221 1111152111111 152 1111181 xe 25
1.4.144 Số đĩa lý thuyết N 1522 1112122121222 rerye 25
1.4.1.4 5 Độ phân giải R (Đe€SỌUHÏOR)) À5 22 512281151 E3251E155311551 11551 x+5 26
1.4146 Hệ số khơng đối xứng T .- 5 ST E2 E12 2 reo 26 I1 0/020 27
JIĐN/, 1T .4 4 n6 6 he cee ee teseetetsteseseeesaes 27
1.42 Hệ thống HPLC - +22 SE+E2E‡EE E323 E2 E221 1 1E rrrke 28
1.4.2.1 Bình đụng đủ! THƠÌ 5 St S1 E221 321 Ẻ SE HH khen 28
IV, (1.010 hx;-ằaÝỶŸ-ŸÝẢỶẢẢẢ 28
1.4.2.3 Bơm (THHHP) c5 213121 1132111551 11111151 1111111111 1111111111 kg 28 1.4.2.4 Bộ phận tiêm mẫu (iHj€€fiOR) 5 22 111111 SEE ket trxey 28
1.4.2.5 Cột sắc Đý S5 52 2122121212212 rye 29 1.4.2.6 Dầu dị (IDel€€ÍO) 1S SE t2 215111111111 1512111211111112121111111 x0 29
Trang 51.4.2.9 Chọn điều kiện sắc k - 5 S5 5 S212111121211112121222122 se 30
1.4291 Lựa chọn pha fĩHÌH . - 2c 2t E 323113513121 111511111 51111111151 111kg 31 1.4292 Lựa chọn pha đỘng S0 221321 1132 1S SH hen 32
1.43 Tiến hành đo sắc kỊ -.-© +52 2 SE S SE tre rrerrey 33
1.4.3.1 Chuẩn bị dụng cụ và máy HĨC 1S SE SE 128122121822 rrrre 33
1.4.3.2 Chuẩn bị dung mơi pha động
1.5.1.1 Lấy mẫu thử: - SE E11 221222212 nu rya 36 1.5.1.2 Tiến hành đo sắc Ìÿ 1S SE E1E1E12212122 E1 rereo 36
1.5.1.3 Đo tín hiệu defe€ÍOF 36
1.5.2 Cac phwong phap định: ÏƯỢH ST ee enneecuseeeneneeensees 37 1.5.2.1 Phương pháp chuẩn ngoại (Externais Standard) - 5s 55c: 37 1.5.2.2 Phương pháp chuẩn nội (Internais Siandiard) - s-5s+s sec: 39 1.5.2.3 Phương pháp thêm chuẩH 1 E11 121111122121 re 4I 1.5.2.4 Kỹ thuât đường chuẩn thêm chuẩN TT S222 rrre 42 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM . - 43 2.1 Trang thiết bị và hĩa chất .- + ++sers+xexeexerrerrersrsrrsrs 43 2.2 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu 2-5-2 s2 52s 44
2.3 Nguyên tắc xử lý mẫu 44
2.4 Các sơ đồ xứ lý mẫu xác định vitamin C - - 5 c5 s5se+se+ 46
2.5 Chuẩn bị dung dịch chuẩn cho phép đo HPL/C - 5° - 48 2.6 Cài đặt các thơng số đO . + 5£ 5e 2 SE ‡x‡EseESEkexeexerkerkersrsrrsrs 48
2.7 Quy trình đo trên máy HP C - «- < << + E< x + se sec 49 2.8 Phương pháp khảo sát đánh giá - « =< + sex sex se sec 49
2.81 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOO)
Trang 62.8.2 Khảo sát độ ÏẶT ÏẠI - ST SH ng ng kg 30
2.83 Xác định hiệu suất thu hỒÌi 5 SE SE SEE SE 50
CHƯƠNG 3 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN 5c ss©55se5s<2 51
3.1 Xac dinh khoang tuyến tính và đường chuẩn của Vitamin C 51
3.2 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp phân tÍCH - - -< << SH ch HH HH TH ch chư 54 3.2.1 Gidi han phat hién (LOÌ)) 5-5555 S5 svrseeerexk 34 3.2.2 Gidi han định lượng LOQ uc cect cece eee cece eneeecneeeeneeneees 54 3.3 Xác định hàm lượng vitamin C theo hai cách sau - ð5
331 Tính hàm lượng vitamin C từ dịch lọc mẫu cam sành, quýt theo
7u 87/7 RRRRRREESEREREREREREh 35 3.3.2 Tính hàm lượng vitamin C trong các mẫu thuốc, thực phẩm chức năng theo chuẩn thử song song 2-2 5s ©£S<£ se x£ xe +xcrxersrserses 56
3.4 Đánh giá phương phááp - - - << G4 1 Y9 v9 mg ve 59
3.4.1 Xác dinh d6 lap lai ctia phiwong phaip - 55s <<+<+ 59
3.4.2 Xác định hiệu suất thu hOi.c.c.ccccccccceccccesessesssesssssssssssssssssssevsessseees 62 3.5 Cac sắc đồ của phép đo HPL/C 5- <2 5 2ss£zs+seczczzscecz 64 $0 89.) , Ơ
Trang 7
HPLC MeOH RSD STT DAD KH PO, DMPM
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography) Methanol
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) Số thứ tự
Độ lệch chuẩn Tử ngoại
Diode array detector Kalidihidrophotphat Dung mơi phá mẫu Hàm lượng
Trang 8DANH MUC CAC BANG
Bảng 1.1 Phân loại Vitamin hịa tan trong chất béo và vitamin hịa tan trong nước
Bảng 1.2 Hàm lượng vitamin C cĩ trong một số thực vật
Bảng 1.3 Hàm lượng vitamin C cĩ trong một số động vật Bảng 1.4 Lượng vitamin C cần theo độ tuổi
Bảng 3.1 Diện tích peak của vitamin C tương ứng với từng nồng độ chuẩn Bảng 3.2 Giá trị LOD và LOQ
Bảng 3.3 Kết quả phân tích hàm lượng vitamin C trong các mẫu
Bảng 3.4 So sánh kết quả phân tích hàm lượng vitamin C bằng phương pháp HPLC và giá trị ghi trên bao bì
Bảng 3.5 So sánh kết quả phân tích hàm lượng vitamin C trong các mẫu Cam sành và Quýt phương pháp đường chuẩn và phương pháp chuẩn thử song song
Bảng 3.6 Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên của các mẫu
Cam sành và mẫu Quýt
Bảng 3.7 Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên Bảng 3.8 Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên
Trang 9DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Hình ảnh khơng gian của cấu trúc vitamin C Hình 1.2 Cam sành
Hình 1.3 Quýt
Hình 1.4 Thuốc hapacol kids
Hình 1.5 Thuốc ampha be comlex Hình 1.6 Thực phẩm chức năng rutin c
Hình 1.7 Thực phẩm chức năng nam dược giải rượu Hình 1.8 Nước giải khát chanh muối
Hình 1.9 Đồ thị phương pháp chuẩn ngoại
Hình 1.10 Phương pháp đường chuẩn sử dụng nội chuẩn
Hình 1.11 Đồ thị kỹ thuât thêm đường chuẩn
Hình 3.1 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C cĩ nồng độ 3.06
Hình 3.2 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C cĩ nồng độ 6.12
Hình 3.3 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C cĩ nồng độ 12.25
Hình 3.4 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C cĩ nồng độ 30.62
Hình 3.5 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C cĩ nồng độ 61.24
Hình 3.6 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C cĩ nồng độ 122.49 Hình 3.7 Đường chuẩn định lượng vitamin C
Hình 3.8 Sac dé mau Chuan 1
Hinh 3.9 Sic dé mau Chuan 2
Hình 3.10 Sắc đồ mẫu Trắng
Trang 10Hình 3.12 Hình 3.13 Hình 3.14 Hình 3.15 Hình 3.16 Hình 3.17 Hình 3.18 Hình 3.19 Hình 3.20 Hình 3.21 Hình 3.22 Hình 3.23 Hình 3.24 Hình 3.25 Hình 3.26 A B C Sắc đồ mẫu Quýt
Sắc đồ mẫu AMPHA BC COMLEX (TI Sắc đồ mẫu AMPHA BC COMLEX (T2)
Sắc đồ mẫu Hapacol kids (T1)
Sắc đồ mẫu Hapacol kids (T2)
Sắc đồ mẫu TPCN Rutin-C (T1) Sắc đồ mẫu TPCN Rutin-C (T2)
Sắc đồ mẫu TPCN Nam dược giải rượu (T1)
Sắc đồ mẫu TPCN Nam dược giải rượu (T2)
Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 1.1 Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 1.2
Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 2.1 Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 2.2
Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 3.1 Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 3.2
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỎ
Sơ đồ xử lý chất chuẩn
Sơ đồ xử lý mẫu Cam sành và Quýt
Trang 11LOI CAM ON
Đề hồn thành luân văn này, Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến: - Cơ giáo TS Đinh Thị Trường Giang người đã trực tiếp hướng dẫn và
tạo mọi điều kiện cho tơi nghiên cứu và hồn thành luận văn
- Chị ThS Bùi Thị Hịa và Th§ Dương Thị Hằng với các anh chị kỹ
thuật viên của viện thực phẩm chức năng trung tâm kiểm nghiệm và hợp chuẩn,
đã tận tình hưỡng dẫn và tạo mọi điều kiện cho tơi thực hiện tốt luận văn
- Thầy giáo PGS.TS: Nguyễn Khắc Nghĩa và Thấy giáo TS Nguyễn
Trung Dũng đã dành nhiều thời gian đọc và viết nhận xét cho luận văn
- Thầy cơ trong Hội đồng chấm luận văn cao học và Ban chủ nhiệm
Khoa Hĩa học trường Đại Học Vĩnh đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi
nhất cho tơi trong quá trình học tập và hồn thành luận văn
Và xin cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên giúp đỡ tơi hồn thành luận này
Vinh, thang 10 nam 2013 Người thực hiện
Trang 12MO DAU
Vitamin là một nhĩm chất hữu cơ cĩ phân tử lượng lớn và các tính chất
vật lý, hố học rất khác nhau Tác dụng của chúng trên các cơ thể sinh vật cũng rất khác nhau nhưng đều cần thiết cho sự sống của sinh vật, nhất là đối
với người và động vật So với nhu cầu về các chất dinh dưỡng cơ bản như protein, lipit, gluxit thì nhu cầu về vitamin rất thấp
Vitamin được cung cấp vào cơ thê con người để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng giúp cơ thể khỏe mạnh Trong nhiều thế kỉ, do thiếu một số vitamin gây nên các bệnh mù lịa (thiếu vitamin A), bệnh beri-beri (thiếu vitamin B]), bệnh scobut (thiếu vitamin C), thiếu axit folic trong thời kì thai nghén gây khuyết tật ống thần kinh ở thai nhi Theo thống kê, chỉ riêng ở Mỹ, cĩ tới 7/10 người phải “cầu cứu” tới vitamin, cịn 3 người thì sử dụng chúng một cách cĩ định hướng và thường xuyên Từ những năm 70, chính phú Mỹ đã cho phép sử dụng các phụ gia thực phâm cĩ chứa vitamin liều cao Kết quả là, hàng năm ở Mỹ, người ta tiêu tốn khoảng 4 tỉ đơ la cho các loại vitamin Nhiều người cịn cho rằng vitamin là thần được chữa ung thư và kéo đài tuổi thọ
Hiện nay, khoa học đang tiến hành những nghiên cứu thực nghiệm trên quy mơ rộng lớn về vitamin Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm của Mỹ cũng đưa ra một lời khuyên là, đa dạng hĩa ăn uống là biện pháp tốt nhất đề đáp ứng nhu cần vitamin của cơ thể Sử dụng bồ sung các loại vitamin và các chất khống cần phải cĩ mức độ Liều lượng sử dụng nhiều hay ít là vấn để cĩ
tính riêng biệt, tùy thuộc vào lối sống, khẩu phần ăn uống, tình trạng sức khỏe
của từng người và vơ số những nhân tố khác
Vitamin € cĩ vai trị rất quan trọng Thiếu vitamin C cơ thể sẽ bị bệnh hoại huyết, ảnh hưởng tiêu cực đến sự tự vệ của cơ thể với các bệnh nhiễm
trùng khác Cơ thê chúng ta hồn tồn khơng tự tơng hợp được vitamin C mà phải lấy từ những nguồn thức ăn ngồi vào Vì vậy việc phân tích vitamin C trong thực phẩm là điều rất cần thiết
Trang 13nhau, gây cản trở cho quá trình định lượng Do đĩ để cần phải lựa chọn phương pháp phân tích hữu hiệu nhất
Cĩ thê phân tích vitamin C bằng các phương pháp: sắc ký giấy, cực
phố, trắc quang, hĩa học, sắc kí
Xuất phát từ tình hình thực tế trên, chúng tơi đã lựa chon đề tài: “Nghiên cứu xác định vitamin C trong thuốc, thực phẩm chức năng, hoa quả và nước giải khát bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”
Trong luận văn này, chúng tơi triển khai các nhiệm vụ sau:
- Tổng quan về vitamin C và phương pháp xác định vitamin C - Xây dựng đường chuân của vitamin C
- Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp phân tích
Khảo sát độ lặp
Xác định hiệu suất thu hồi
Định lượng vitamin C bằng phương pháp HPLC
Phân tích, xử lý số liệu
Kết quả thực nghiệm Đối tượng nghiên cứu
Mẫu các loại quả, thuốc và sản phẩm chức năng được thu thập từ các cửa hàng bán hoa quả, nước giải khát và các đại lý bán thuốc trong thành phố Vinh
tỉnh Nghệ An Mỗi mẫu được lấy Ikg đựng vào túi nilơng sạch Bao gồm:
Quả: Cam sành, Quýt
Thuốc: Hapacol kids, Ampha BC complex
Thực phẩm chức năng: Rutuin C, Nam dược giải rượu
Nước giải khát: Nước khống chanh muối Phương pháp nghiên cứu
Trang 14CHƯƠNG 1
TONG QUAN TAI LIEU
1.1 Giới thiệu về vitamin
1.11 Khái niệm
Vitamin là hợp chất hữu cơ, phần lớn cĩ phân tử tương đối lớn Bản chất hĩa học, lý học của các vitamin rất khác nhau Nhĩm chất hữu cơ này cĩ một đặc điểm chung là đặc biệt cần thiết cho mọi hoạt động sinh sống bình
thường của các cơ thể sinh vật dị dưỡng
Vitamin là những chất mà cơ thể con người khơng thể tự tổng hợp được, Phần lớn phải đưa từ ngồi vào bằng con đường ăn uống Mặc dù lượng
vitamin cĩ thể sử dụng ít nhưng khi thiếu một loại vitamin nào đĩ sẽ dẫn đến
những rối loạn về hoạt động sinh lý bình thường của cơ thé Vitamin cịn cần
thiết cho cơ thể tự dưỡng như thực vật (là những đối tượng cĩ khả năng tự
tổng hợp nên hầu hết các vitamin) Cịn một số bộ phận cây xanh khơng cĩ khả năng tống hợp vitamin, vì thế cần cung cấp thêm cho chúng dé dam cho sự sinh trưởng và phát triển
1.1.2 Đặc điển chung và phân loại 1.1.2.1 Đặc điểm chưng
- Mặc dù cĩ cấu trúc, vai trị và cách thức hoạt động khác nhau nhưng tất cả các vitamin đều cĩ những đặc tính cơ bản:
- Vitamin khơng trực tiếp sinh năng lượng như protein, lipit hay gluxit
Mà chỉ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sản xuất và sử dụng năng lượng
- Khơng thể thay thế lẫn nhau: thiếu một loại vitamin này khơng thể thay
thế được bằng một loại khác
Trang 15- Khi trong thức ăn thiếu vitamin hoặc cơ thể hấp thụ kém, sẽ dẫn đến các rối loạn trao đổi chất đặc trưng và rối loạn chức năng, cơ thể sẽ xuất hiện các rối loạn bệnh lý (bệnh thiếu vitamin và bệnh thừa vitamin)
- Thuc vat va vi sinh vat co kha nang tong hop hầu hết các loại vitamin
và tiền vitamin (provitamin)
- Người và động vật khơng cĩ khả năng tổng hợp mà chỉ sử dụng được
vifamin lấy từ thức ăn Một số loại vitamin (Bạ, By, acid pantotenic, acid folid ) dugc hé vi khuẩn ở ruột tổng hợp hoặc tạo ra trong cơ thể (ví dụ acid
nicotinc được tổng hợp từ tryptophan), tuy vậy các phản ứng này khơng đủ cung cấp cho nhu cầu của cơ thé
1.122 Phân loại
Dựa vào cơ sở sinh lý và hố học, vitamin được phân chia thành 2
nhĩm lớn:
Bảng 1.1: Phân loại Vitamin hịa tan trong chất béo và vitamin hịa tan
trong nước
Vitamin hịa tan trong chất béo (dau): | Vitamin hịa tan trong nước
- Vitamin A va caroten - Vitamin B, (Titamin)
- Vitamin D (Canxiferol) - Vitamin B, (Riboflavin) - Vitamin E (Tocoferol) - Vitamin Bg (Piridoxin) - Vitamin K (Koagulation) - Vitamin B; (Acid pantoneic)
- Vitamin Q - Vitamin Bj (Xiancobalamin)
- Vitamin B;;3 ( Acid orotic)
- Vitamin P P (Acid nicotinic) - Vitamin P ( Bioflavonoit)
- Vitamin C (Acid ascorbic)
Trang 16
1.2.1 Lwoc sw
Bệnh Scurvy đã ảnh hưởng đến rất nhiều bệnh nhân Ai Cập, La Mã và Thành Rome cổ đại Bệnh này gắn liền với lịch sử thế giới vì tỷ lệ cung cấp vitamin C khơng đầy đủ trong những chiến dịch quân sự và trong các cuộc hành trình trên biên dài ngày Đã cĩ những giai đoạn lịch sử mà bệnh scurvy
lan tràn rộng khắp như một bệnh dịch Từ năm 1556 đến 1857 đã cĩ 114 dịch
scurvy được báo cáo suốt trong các tháng mùa đơng, lúc mà khơng thể cung cấp đầy đủ nguồn rau xanh Các chiến binh trên các cuộc hải trình đài ngày cịn bị ảnh hưởng nặng né hơn
Một số nhà thám hiểm, như J' acques Cartier năm 1856, đã nhận thấy rằng ăn một số loại thức ăn nào đĩ cĩ thể làm giảm được tình trạng bệnh Ơng đã
cùng thủy thủ đồn ăn loại cây lá kim vân sam một số thủy thủ đồn khác ăn
cam, chanh, chanh lá cam Năm 1742, lame Lind, một bác sĩ người Anh, đã
viết một bài thảo luận chính thức đầu tiên về khả năng gây bệnh scurvy do
thiếu hụt đinh dưỡng Theo kinh nghiệm của Lind, ơng cho biết các bệnh nhân scurvy cĩ thể phục hồi sau khi cho dùng nước cam Mặc dù cĩ một sé
nhà thám hiểm đã ủng hộ những khám phá của Lind — như thủy thủ đồn của thuyền trưởng lame Cook đã hồn tồn tránh được scurvy trong 3 cuộc hành
trình dài ngày trên biên từ 1768 đến 1779 Thủy quân Anh quốc vẫn chưa chấp
nhận việc sử dụng nước cam chanh cho các thủy thủ mãi đến năm 1804 tức
62 năm sau những khám phá của Lind Xu hướng ngày nay người ta chấp
nhận chế độ dinh dưỡng tồn diện nhờ nhiều khám phá mới về vai trị quan
trọng của vitamin và khống chất, trong đĩ cĩ vitamin C
Trang 17- Tén theo IUPAC: 2-oxo-L-threo-hexono-1,4- lactone-2,3-enediol hay
(R)-3,4-dihydroxy-5-((S)- 1,2-dihydroxyethyl)furan-2(5H)-one - Tên thơng thường: acid ascorbic, vitamin C
- Tên gọi khác : L-ascorbate - Cơng thức phân tu: CsHgO¢
- Khối lượng phân tử:176.13 g/mol
- Yếu tố nhận dạng:
+ CAS number: 50-81-7 + ATC code: AIIG + PubChem: 644104
1.2.3 Phén loai vitamin C
- Acid ascorbic (dang khử)
- Acid dehydroascorbic (dang oxy hoa) - Dang lién két ascorbigen
+ Nĩ chỉ tồn tại ở đạng L trong các sản phẩm thiên nhiên
+ 14 đồng phân và đồng đẳng của vitamin C cĩ khả năng chống bệnh
hoại huyết
+ 15 chất đồng phân khơng cĩ hoạt tính
1.24 Cấu tạo của vitamin C Cơng thức cấu tạo
Trang 18Cấu trúc khơng gian của Vitamin C
Hình 1.1 Hình ảnh khơng gian của cấu trúc vitamin C 1.25 Ngun gốc
1.2.5.1 Nguơn gốc từ thực vật
Vitamin C hay cịn được gọi là acid Ascorbic cĩ rất nhiều trong các loại thực vật (tìm thấy nhiều nhất trong trái cây), là l vitamin hồ tan được trong
nước Vitamin C là một chất chống oxy hố tốt, nĩ tham gia vào nhiều hoạt
động sống quan trọng của cơ thé Vitamin C được tơng hợp dé dàng ở thực vật Tuy thực vật là nguồn vitamin C dồi đào thơng thường lượng vitamin
C trong thức ăn cĩ nguồn gốc thực vật phụ thuộc vào loại cây, điều kiện cuả
đất, khí hậu nơi mà thực vật đĩ phát triển thời gian dài hay ngắn từ lúc thực
vật đĩ được hái lên khỏi mặt đất, điều kiện dự trữ, và phương pháp chế biến
Trang 19Bảng 1.2 Hàm lương vitamin C cĩ trong một số thực vật
Nguồn Hàm lượng Nguồn Hàm lượng
thực vật (mg / 100g) thực vat (mg / 100g)
Mận kakadu 3150 Chanh lá cam 20
Hồng quân 2800 Xồi 20
Quả lựu 2000 Khoai tây 20
Acerola 1600 Dưa gang 20
Amla 720 Ca chua 10
Tao ta 500 Qua viét quat 10
Trai Baobab 400 Dứa 10
Blackcurrant 200 Pawpaw 10
Ot 190 Nho 10
Mui tay 130 Mo 10
Seabuckthorn 120 Man 10
Oi 100 Dua hau 10
Trai kiwi 90 Chuối 9
Cai broccoli 90 Carot 9
Dau tam 80 Bo 8
Qua ly chua 80 Tao dai 8
Cai brussels 80 Sorry 7
Vai 70 Dao 7
Dau rung 60 Tao 6
Hồng vàng 60 Blackberry 6
Du du 60 Cu cai duong 5
Dau tay 60 Lê 4
Cam 50 Rau diép 4
Chanh 40 Dua leo 3
Dua hau 40 Ca tim 2
Bap cai hoa 40 Qua sung 2
Bưởi chùm 30 Bilberry 1
Quả mâm xơi 30 Horned melon 0.5
Quýt 30 Quả sơn trà 0.3
Mandarin orange 30 Rau pina 30
Chanh day 30 Cai bap 30
Trang 201.2.5.2 Nguén gĩc từ động vật
Đa số động vật, trừ chuột bạch, khỉ và người đều cĩ khả năng tơng hợp
được vitamin C Sở dĩ người khơng cĩ khả năng đĩ cĩ lẽ vì thiếu các enzim đặc hiệu xúc tác cho sự chuyên hĩa glucoza thành vitamin C Vì thế phải bố sung bằng con đường ăn uống
Lồi đê, giống như hầu hết các lồi động vật khác, tự tổng hợp vitamin C cho cơ thể của chúng Một con đê trưởng thành sẽ sản xuất được hơn
13,000 mg vitamin C mỗi ngày trong điều kiện sức khoẻ bình thường và mức độ này tăng lên cao hơn khi đối diện với tình trạng stress
Vitamin C hiện diện nhiều nhất trong gan, và ít nhất là ở cơ Vitamin C cĩ mặt trong sữa mẹ và hàm lượng ít hơn trong sữa bị tươi Với sữa tiệt trùng chỉ chứa I lượng rất ít vitamin C Tất cả vitamin C thừa sẽ được bài tiết qua nước tiểu
Bảng 1.3 Hàm lương vitamin C cĩ trong một số động vật
Nguồn Hàm lượng động vật (mg / 100g)
Gan bê (chưa chê biên) 36
Gan bị (chưa chế biến) 31
Sị (chưa chế biến) 30
Trứng cá tuyết (chiên) 26
Gan lợn (chưa chế biến) 23
Ĩc cừu (hấp) 17
Gan gà (chiên) 13
Gan cừu (chiên) 12
Tìm cừu (nướng) 11
Lưỡi cừu (hâm) 6
Sữa mẹ 4
Sữa dê 2
Sữa bị 2
Trang 211.2 6 Vai trị của vitamin C trong cơ thể sống - Chống oxy hĩa
Vitamin C là một trong nhiều chất tham gia hệ thống phịng thủ chống oxy hĩa của cơ thể Các chất chống oxy hĩa (vitamin E, beta-caroten, Vitamin C) cĩ thể chuyển các tác nhân gây oxy hĩa thành những chất vơ hại và thải ra nước tiểu Vitamin C kết hợp với nhiều dạng gốc tự do và “quét dọn” chúng ra khỏi cơ thé, giúp phục hồi Vitamin E trở lại đạng cĩ khả năng chống oxy hĩa
- Tao collagnen
Collagen là thành phần protein chính của mơ liên kết xương, răng, sụn, da và mơ sẹo Collagen chiếm đến protein trong cơ thể Vitamin C cần cho quá trình tạo collagen từ trocollagen Nếu thiếu Vitamin C sẽ giảm khả năng tổng hợp collagen Lúc đĩ, sẹo sẽ khĩ lành, vỡ mao mạch, khiếm khuyết trong quá trình hình thành xương và răng
- Phịng chống bệnh tim mạch
Vitamin C cịn giúp thành mạch máu vững chắc, đặc biệt quan trọng đối
với mạch máu nuơi tim Giúp chuyền cholesterol thành acid mật, bằng cách giảm tình trạng cholesterol trong máu Loại vitamin này cịn giúp hạn chế tăng huyết áp, chống tạo cục máu đơng đề giảm thuyên tắc mạch
- Tăng cường hệ miễn dịch
Hỗ trợ sản xuất interferon là loại protein do tế bào cơ thể tạo ra để chống lại tác nhân gây bệnh, là thành phần đạm quan trọng của hệ miễn dịch Cần thiết cho các tế bào miễn dịch đĩ là tế bào T và bạch cầu Từ đĩ làm mạnh
chức năng của hệ miễn dịch, làm tăng phản ứng dị ứng - Tổng hợp chất dẫn truyền thần kinh
1.27 Nhu cầu về Vitamin C
Trang 22Bảng sau liệt kê nhu cầu vitamin C khác nhau tuỳ theo độ tuổi:
Bảng 1.4 Lượng vitamin C cần theo độ tuổi
Luong vitamin C cần thiết theo độ tuổi
Đối tượng Độ tudi Nam (mg/ngay) | Nir (mg/ngay)
Tré so sinh 0-6 thang 40 (Al) 40 (AI)
Trẻ sơ sinh 7-12 tháng 50 (AI) 50 (AI)
Trẻ em 1-3 tuơi 15 15 Tré em 4-8 tudi 25 25 Tré em 9-13 tudi 45 45 Tré thanh nién 14-18 tudi 75 65 Ngưởi trưởng thành | 19 tudi tré lên 90 75 Người hút thuốc 19 tuổi trở lên 125 110 Thai phụ Dưới 18 tuơi - 80 Thai phu 19- tuổi trở lên - 85
Phụ nữ cho con bi | Dưới 18 tuổi - 115
Phụ nữ cho con bú | 19 tuổi trở lên - 120
Vitamin C cĩ vai trị rất quan trọng đối với con người, đặc biệt là đối với thai phụ và phụ nữ cho cho con bú, tuy nhiên việc lạm dụng hay thiếu hụt vitamin C đều gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe của con người
1.2.7.1 Thiéu vitamin C
Triệu chứng khiếm khuyết sinh tố C tiến hành tuần tự qua 3 giai đoạn, nhanh hay chậm tùy theo mức độ thiếu hụt, trước khi bị bệnh Scorbut do thiếu sinh tố C thực sự hội đủ điều kiện thành hình:
Giai đoạn 1: mệt mỏi, căng thắng thần kinh, buồn ngủ, đau nhức cơ khớp
Giai đoạn 2: chảy máu nướu răng, dưới da, da niêm
Trang 23Phụ nữ mang thai hoặc cho con bú cĩ thể bị thiếu vitamin C nếu khơng
được ăn uống đầy đủ vì nhu cầu vitamin C của họ tăng cao trong giai đoạn này Người nghiện thuốc lá cũng dễ bị thiếu vitamin C do chất nicotine cĩ trong thuốc lá phá hủy lượng vitamin C cĩ trong cơ thê
Trẻ em trong giai đoạn phát triển nhanh từ 6 - 24 tháng tuổi cũng dễ bị
thiếu vitamin C với các biểu hiện thường thấy như trên kèm theo mệt mỏi,
biếng ăn, giảm sức đề kháng, thiếu máu tiến triển
Khi thiếu vitamin C, da sẽ bị khơ, dé bị xuất huyết đưới da (da dé bi bam
tím khi va chạm nhẹ), chảy máu cam, chảy máu lợi, vết thương chậm lành
(bệnh Scorbut )
Cách khắc phục tình trạng thiếu vitamin C: ăn các thực phẩm cĩ chứa vitamin C hoặc uống thuốc với sự chỉ dẫn của bác sĩ sẽ khiến tình trạng sức khỏe được cải thiện rõ rệt
1.2.7.2 Thừa vitamin C
Dùng quá 500 mg vitamin C mỗi ngày khơng tốt cho sức khỏe Nếu dùng
trên 1000 mg/ngày, bạn sẽ bị rối loạn tiêu hĩa, gây tiêu chảy, rát dạ dày, cĩ
hiện tượng thừa sắt, giảm độ bền hồng cầu, giảm khả năng diệt khuẩn của
bạch cầu, viêm bàng quang, viêm đường tiết niệu do axit ascorbic
Nếu dùng trên 2000 mg/ngày, vitamin C sẽ gây mất ngủ, tạo sỏi oxalat, ức chế bài tiết ¡nsulin, tăng huyết áp, tốn thương thận do tăng tổng hợp corticoid va catecholamin
Thừa vitamin C cịn gây hấp thu thừa sắt giảm hấp thu đồng, niken, làm cho xương chậm phát triển, dễ biến dạng Thai phụ dùng thừa cĩ thể gây dị
tật bẩm sinh ở trẻ
Trang 24Một số loại viên sủi C cịn chứa thêm thành phần muối khống canxi 500 mg, khơng được dùng cho người bị bệnh sĩi thận
Những thai phụ dùng liều cao vitamin C trong suốt thai kỳ sẽ làm tăng các men chuyên hĩa ở thai nhi do hiện tượng dội ngược và gây ra bệnh lý
thiếu vitamin C ở trẻ Đặc biệt việc uống hoặc tiêm vitamin C cĩ thé gay ra di ứng hoặc sốc thuốc ở một số người cĩ cơ địa mẫn cảm với vifamin C hoặc
gây ra các tai biến do tiêm thuốc như nhiễm trùng
Mặt khác, việc dùng thuốc vitamin C thường xuyên cĩ thể làm cơ thể
quen, khi khơng dùng sẽ cảm thấy mệt mỏi ngồi ra nếu dùng vitamin C với một lượng lớn dài ngày (quá Ig/ngày) sẽ dẫn đến viêm loét dạ dày, tiêu chảy,
sỏi thận
Gan đây một số nghiên cứu cho thấy việc dùng thừa vitamin C sé lam “mất đi sự cân bằng vốn cĩ của cơ thể” làm “tăng sự tích tụ” những phân tử
kép cĩ hại, sự tích tụ này cĩ một vai trị nhất định trong các căn bệnh như ung
thư, thấp khớp, xơ vữa động mạch Cịn cần phải thu thập thêm chứng cứ nhưng đây là điều cảnh báo đáng quan tâm
Do đĩ, khơng nên coi vitamin C là một thuốc bố dùng khơng giới hạn,
đặc biệt là với trẻ em và phụ nữ mang thai Những trường hợp cần thiết dùng liều cao phải do thầy thuốc chỉ định và chỉ dùng trong thời gian ngắn Vitamin
€ (axit ascorbic) cũng như các loại thuốc khác vừa cĩ tác dụng chữa bệnh vừa
Trang 251.3 Giới thiệu các đối tượng nghiên cứu
1.3.1 Cam sành
Hình 1.2 Cam sành
Là một giống cây ăn quả thuộc chỉ Cam chanh cĩ hình dạng như quả cam, cĩ nguồn gốc từ Việt Nam Quả cam sành rất dé nhận ra nhờ lớp vỏ
day, san sii giống bề mặt mảnh sành, và thường cĩ màu lục nhạt (khi chín cĩ sắc cam), các múi thịt cĩ màu cam
Cam sành được gắn nhiều tên khoa học khác nhau như Citrus nobilis, Citrus reticulata, hay Citrus sinensis, trên thực tế nĩ là giống lai tự nhiên
1.32 Quýt
Hình 1.3 Quýt
Trang 26Các thành phần dinh dưỡng trong quýt chống lại sự phá vỡ acid uric trong máu Các loại acid hữu cơ và vitamin trong quýt điều hịa chức năng
trao đổi chất trong cơ thể đặc biệt là người già mắc bệnh tim
Vỏ quýt chứa vitamin D cĩ thể duy trì tính dẻo của huyết quản mao mạch, phịng chống mạch máu vỡ và thấm máu Nĩ kết hợp với vitamin C cĩ thé tang
hiệu quả trị liệu ðối với ngÝời mắc bệnh máu xấu Cho nên ngýời xõ cứng mạch
máu và thiếu vitamin C nên thýờng xuyên uống nÝớc vỏ quýt ngâm
Quýt chứa thành phần chống oxy hĩa, cĩ thể tăng cao khả năng miễn dich, chống sự phát triển của u bướu Ngồi ra, quýt cịn cĩ tác dụng chống lại tia bức xạ của máy tính, trong quýt chứa nhiều vitamin A và beta carotin, cĩ thể bảo vệ da cho những người thường sử dụng máy tính
1.3.3 Thuốc HAPACOL KIDS
Hình 1.4 Thuốc hapacol kids
CƠNG THỨC:
Paracetamol 150 mg Vitamin C ð mg Tá dược vừa đủ 1l gĩi
(Manitol, acid citric khan, natri hydrocarbonat, đường trắng, đường
Trang 27DẠNG BÀO CHÉ: Thuốc bột sủi bọt
QUI CÁCH ĐĨNG GĨI: Hộp 24 gĩi x 1,5 g
TÍNH CHÁT: Paracetamol là thuốc giảm đau - hạ sốt hữu hiệu Thuốc
tác động lên trung tâm điều nhiệt ở vùng dưới đơi gây hạ nhiệt, tăng toả nhiệt do giãn mạch và tăng lưu lượng máu ngoại biên làm giảm thân nhiệt ở người
bị sốt, nhưng hiếm khi làm giảm thân nhiệt bình thường và giảm đau bằng
cách nâng ngưỡng chịu đau lên
Trong cơ thể, Vitamin C tham gia vào các quá trình tổng hợp, chuyên hố các chất cần thiết cho quá trình phát triển của cơ thể và giữ vai trị quan trọng trong tăng cường chức năng miễn dịch, tăng khả năng đề kháng với nhiễm khuẩn của cơ thể
Hapacol Kids chứa 150 mg Paracetamol và 75 mg Vitamin C, được bào
chế dưới dạng bột sủi bọt, hịa tan trong nước trước khi uống, thích hợp dùng
hạ sốt - giảm đau - tăng cường miễn dịch cho trẻ em trên I tuổi Thuốc được hấp thu nhanh chĩng và hầu như hồn tồn qua hệ tiêu hĩa
CHỈ ĐỊNH: Hạ sốt, giảm đau, tăng cường sức đề kháng cho trẻ trong các trường hợp: cảm, cúm, đau đầu, đau cơ - xương, bong gân, đau khớp,
nhiễm khuẩn, nhiễm siêu vi, sau khi tiêm chủng, sau phẫu thuật cắt amiđan, nhé răng, mọc răng, nhức răng,
LIEU DUNG VÀ CÁCH DUNG: Hoa tan thuốc vào lượng nước (thích
hợp cho bé) đến khi sui hết bọt Cách mỗi 6 giờ uống một lần, khơng quá 5 lần/ ngày Liều uống tương ứng với thành phần Paracetamol, trung bình từ 10 - 15 mg/ kg thé trọng/lần
Tổng liều tối đa của Paracetamol: khong qua 60 mg/ kg thé trong/ 24 giờ Hoặc chia liều như sau: Trẻ em từ 1 đến 3 tuổi: uống 1 gĩi/ lần
Hoặc theo chỉ dẫn của Thầy thuốc
Trang 281.3.4, Thuéc AMPHA BC COMLEX
3 E
3 AMPHA
.="e<-
COMPLEX
Hình 1.5 Thuốc ampha bc comlex
CƠNG THỨC:
Mỗi viên nang chứa
- Hoạt chất chính: Vitamin BI: 15mg, Vitamin B2: 15mg, Vitamin B6: 10mg, Vitamin C 100mg, Nicotinamid: 25mg, Calci pantothenat: 20mg
- Ta duoc: Microcrystallin cellulose 102 (Avicel 102), Silica colloidal khan (Aerosil), Magnesi stearat
HAN DUNG:
24 thang ké tt ngay san xuất
Khơng dùng thuốc đã qua hạn
BẢO QUẢN:
Trang 29TRÌNH BÀY: Vi 10 viên nang cứng Hộp 3 vỉ (30 viên nang cứng) Hộp 10 vi (100 viên nang cứng) 135 Thực phẩm chức năng: RUTIN-C
tả dược l viên bao đường
Quy cách đĩng gĩi:
Hộp 10 vỉ x 10 viên bao đường Tác Dụng:
- Vitamin C cĩ liên quan đến sư hình thành collagen và thay thế mơ - Rutin cĩ tác dụng làm tăng sự bền vững của hồng cầu, làm giãn cơ trơn, chống co thắt
Chỉ định:
Giúp tăng sức bền của thành mạch máu, phục hơi tính đàn hồi của mao mạch Hạ huyết áp, hạ cholesterol trong máu phịng ngừa bệnh xơ vữa động mạch Hỗ trợ trong điều trị huyết áp cao, chảy máu cam xuất huyết
Người đang bị xuất huyết hoặc cĩ nguy cơ xuất huyết, người huyết áp cao Người dễ bị chảy máu đo tính bền của thành mạch kém như Chảy máu
Trang 30Cách dùng, liều dùng: Ngày uống từ 2-3 lần
- Người lớn: 2-3 viên/lần
- Trẻ em: 2 viên/lần Thận Trọng:
- Thận trọng khi sử dụng cho phụ nữ cĩ thai và cho con bú vì dùng lượng lớn Vitamin C trong thời kì mang thai và cho con bú cĩ thể làm tăng nhu cầu
về Vitamin C và dẫn đến bệnh Scorbut ở trẻ sơ sinh Bao Quan: Nơi khơ, tránh ánh sáng, dưới 30°C
Liều dùng:
Uống 2 viên/ lần x 2 lần/ ngày
1.3.6 Thực phẩm chức năng: Nam dược giải rượu
Hình 1.7 Thực phẩm chức năng Nam dược giải rượu
Thành phần: Mỗi viên nang chứa:
Acid succinic 150 mg Acid fumaric 56,25 mg L-glutamine 150 mg Vitamin C 37,5 mg Vitamin B 175 mg
Glucose, magnesi stearat vira du 1 vién
Trang 31Tác dụng:
Say rượu là nguyên nhân gây ra các bệnh cơ thê và tâm thần trầm trọng và lâu đài khác (xơ gan, nhồi máu cơ tim, mất trí nhớ, .) Sau khi hấp thu vào cơ thê, rượu đi vào từng tế bào và chuyên hố thành Acetaldehyd
Acetaldehyd là một chất rất độc gây nên hầu hết các loại bệnh cĩ nguyên nhân từ rượu và cũng là một chất gây nghiện rượu
Nam dược giải rượu là một thực phẩm chức năng cĩ tác dụng:
- Tăng cường chuyển hố rượu bằng cách làm chậm quá trình chuyên hố thành Acetaldehyd
- Thúc đầy quá trình chuyển hố Acetaldehyd thành acid acetic, rồi tao
thành COz và H;O khơng độc hại đối với co thé
- Do đĩ, sản phẩm cĩ tác dụng ngăn chặn những tác hại do rượu gây ra đối với các cơ quan trong cơ thể con người, giảm bớt tỷ lệ nghiện do rượu Cơng dụng:
- Làm giảm triệu chứng “say”: Nhức đầu, khĩ chịu trong người, đầy
bụng, buồn nơn
- Ngăn chặn những tác hại do rượu gây nên cho cơ thê
Cách sử dụng: Uống 2-3 viên trước khi uống rượu 30 phút - 1 tiếng Bảo quản: Trong bao gĩi kín, ở nhiệt độ dưới 30°C
Hạn dùng: 36 tháng kê từ ngày sản xuất
Quy cách đĩng gĩi: Vỉ 6 viên x 0,5g Hộp nhỏ l vỉ (3g) Hộp lớn 5 hộp
Trang 321.37 Nước giải khát (Faith) nước khống chanh muối
Hình 1.8 Nước khống chanh muối
Thành phần hĩa học: (mg/) TDS < 5.000 K* < 50 F < 1,0 Na” < 1.650 Mẹ” < 160 HCO; < 270 Ca” < 175 T < 0,2 VitaminC < 2.4
1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiéu nang cao HPLC
1.4.1 Gidi thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 1.4.L1 Cơ sở lý thuyết
Trang 33Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiền từ phương pháp sắc ký cột cổ điện Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hĩa cao nhờ sự phát triển nhanh chĩng của ngành chế tạo máy phân tích Hiện nay nĩ áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiêm
nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc Và nĩ hiện là
cơng cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính
và định lượng
Ưu điểm của HPLC:
Điều kiện phân tích khá dễ dàng
Dễ dàng thu hỏi chất phân tích với độ tinh khiết cao
Độ lặp lại cao
Thường khơng phân hủy mẫu
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đĩ pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một
chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hĩa học với các nhĩm chức hữu cơ
Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ phân bĩ, trao đối ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử)
Trong luận văn này chúng tơi sử dụng M⁄4y sắc ký lĩng hiệu năng cao (HPLC) HITACHI L-5000 detector DAD
1.4.1.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta cĩ sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo Nếu pha tĩnh là chất trao đồi ion thì ta cĩ Sắc ký trao đồi
ion Nếu pha tĩnh là chất long thi ta cĩ sắc ký phân bố hay sắc ký chiết Nếu
Trang 34phân tích, kết quả các chất A, B, C sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua
cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tống hợp các tương tác F1, F2 và E3
Chất phân tích A + B + C
Fl F2
Pha tinh F3 Pha động
Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa rải ra khỏi
cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại
Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1, F2, F3 Trong đĩ FI
và F2 giữ vai trị quyết định, cịn F3 là yếu tố ảnh hưởng khơng lớn Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ đi chuyên trong cột với tốc độ khác
nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột
1.413 Phân loại sắc ký và ứng dụng
Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh, yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo
chất tan ra khỏi cột
Theo cơ chế chia tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học
của chất hấp phụ của sắc ký, người ta phân ra các loại sau đây:
-_ Sắc ký hấp phụ (NP-HPLC và RP-HPLC) - Sắc ký phân bố - Sắc ký chiết (LLC) - Sắc ký trao đơi ion (IE-HPLC)
Trang 35Nhưng thực tế hiên nay, chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào phân tích mẫu Sắc ký hấp phụ là quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ)
của pha động đề kéo chất tan ra khỏi cột Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào
tính chất động học của chất hấp phụ Trong loại này cĩ 02 kiêu hấp phụ:
Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực, pha động
khơng phân cực
Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): Pha tĩnh khơng phân cực, pha động phân cực
Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi, thành cơng để tách các hỗn
hợp các chất cĩ tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại khơng phân cực,
phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin, các thuốc hạ nhiệt giảm đau Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP)
1.4.1.4 Cac dai lượng đặc trưng của sắc ký đồ
Kết quả của quá trình tách các chất được Detector phát hiện ghi thành sắc ký đồ Từ các thơng số của các pic, nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết
được đưa ra để đánh giá một quá trình sắc ký Dưới đây là một số đại lượng
thường dùng trong thực tế và cách thay đối các đại lượng này cĩ lợi cho quá trình phân tích sắc ký
1.4.1.4 1 Thời gian luu: Retention time (tr)
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột
cho đến khi chất đĩ ra khỏi cột đạt gia tri cực đại
Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau cĩ thời
gian lưu khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn Vì vậy, thời gian
lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố: Bản chất sắc ký của pha tĩnh
Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động
Trang 36Trong một số trường hợp thời gian lưu cịn phụ thuộc vào pH của pha động.Trong một phép phân tích nếu Rt nhỏ quá thì sự tách kém, cịn nếu Rt quá lớn thì peak bị dán và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất
dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung mơi, hố chất, độ
chính xác của phép phân tích kém Đề thay đơi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên
14142 Hệ số dung lượng KÌ
- Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đĩ trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng
Thường được tính theo cơng thức sau:
- Hệ số dung lượng k phu thudc vao ban chất của chất phân tích, đặc
tính của pha tĩnh và pha động
f, t
t, ø ø
Nếu KỶ nhỏ thì ty cũng nhỏ và sự tách kém K' lớn thì pic bị lỗng, độ
nhạy kém Trong thực tế kÌ từ 1 đến 5 là tối ưu
14143 Độ chọn lọc œ
Độ chọn lọc z cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc kí Khi hai chat A, B cĩ K) và Kh khác nhau thì mới cĩ khả năng tách, mức độ tách biểu thị
ở độ chọn lọc ø
œ=Kx/Ks (KA>Kn)
với ơ càng khác | thi kha nang tach càng rõ ràng
1.4144 Số đĩa lý thuyết N
- Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc kí nhất định Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký giống như một lớp
pha tĩnh cĩ chiều cao là H Tất nhiên lớp này cĩ tính chất động, tức là một
Trang 37giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động Vì vậy với
một điều kiện sắc kí xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất
phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng xác định Số đĩa lý thuyết N được tính theo cơng thức:
N= (§] -ssj fe =16 2.)
ổ Wos W,
Trong đĩ: tạ là thời gian lưu của chất phân tích
'Was là độ rộng tại điểm 1⁄4 của peak
1.4145 Độ phân giải R (Resolution)
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau
trên một điều kiện sắc ký đã cho
Trong thực tế nếu các Peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu dé 2 Peak tách là R =1 Trong phép định lượng R=1,Š5 là phù hợp
Nếu R nhỏ thì các Peak chưa tách hẳn việc tính tốn diện tích Peak sẽ
khơng chính xác
Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ
nhạy sẽ kém Đề khắc phục ta cĩ thể thay đối hệ pha động hay dùng chương trình Gradient dung mơi Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký dùng chương trình dung mơi thì một số pha động cĩ tỷ lệ thay đối sẽ kéo theo sự thay đối đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích của các Peak ta phân tích
Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình Gradient dung mơi mà chủ yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp đáp ứng các yêu cầu trong quá trình phân tích
14146 Hệ số khơng đối xứng T
- Hệ số đối xứng T cho biết mức độ khơng đối xứng của pic trên sắc đồ
thu được T được tính bằng tỷ số độ rộng của hai nửa pic tại điểm 1/10 hoặc
Trang 38quan tâm ðến hệ số khơng ðối xứng T, khi T < 2,5 thì phép định lượng được chấp nhận, nếu T > 2.5 thì điểm cuối của pic rất khĩ xác định Vì vậy cần thay đổi các điều kiện sắc kí để làm cho pic cân đối xứng hơn theo cách sau:
+ Làm giảm thể tích chiết, tức là đoạn nối từ cột đến Detecter
+ Thay đơi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên + Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha lỗng mẫu phân tích
hoặc giảm thê tích 142 Hệ thống HPLC
Gồm các bộ phận cơ bản sau: Degasse, Pump, Tiêm mẫu, Column,
Detector
Trong đĩ: cĩ bình chứa dung mơi pha động, bộ phận khử khí, bơm cao áp bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay Autosample) cột sắc ký (Pha tĩnh) (để
ngồi mơi trường hay trong bộ điều nhiệt), detector (nhận tín hiệu) hệ thống
máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu, xử lý đữ liệu, điều khiển hệ thống
HPLC và in dữ liệu
1.4.2.1 Binh đựng dung mơi
Hiện tại máy HPLC thường cĩ 4 đường dung mơi vào đầu bơm cao áp, cho phép chúng ta sử dụng 04 bình chứa dung mơi cùng 1 lần để rửa giải theo
tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung mơi của 04 đường là 100%
Tuy nhiên, theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung mơi cùng một lúc mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 2 và 3 đường đề cho hệ
pha động luơn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn, để
quá trình rửa giải Ổn định hơn
Trang 39Lưu ý:
Tất cả các dung mơi dùng cho HPLC đều phải là dung mơi tỉnh khiết và
cĩ ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung mơi tinh khiết phân tích Tất cả các hĩa chất dùng đề pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dung là hĩa chất tinh khiết phân tích, nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các Peak tạp trong q trình phân tích
1.4.2.2 B6 khử khí (Degasse)
Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ cịn sĩt lại trong
dung mơi pha động Nếu như trong q trình phân tích, dung mơi pha động cịn sĩt các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra
Tỷ lệ pha động của các đường dung mơi lấy khơng đúng sẽ làm cho
thời gian lưu của Peak thay đơi
Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí khơng thể loại trừ hết được
thì cĩ thể Pump sẽ khơng hút được dung mơi, khi đĩ áp suất khơng lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động
Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai
1.4.2.3 Bom (Pump)
Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký
Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến -500 at (lat =0.98 Bar) và pump phải tạo dịng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phút (hiện nay đã cĩ nhiều loại Pump cĩ áp suất rất cao lên đến 1200 bar)
Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường cĩ áp suất tối đa 412
Bar Tốc độ dịng: 0.1-9.999 ml/phút
Tốc độ bơm là hằng định theo thơng số đã được cài đặt Hiện tại bơm
cĩ 2 pistone đề thay phiên nhau đây dung mơi liên tục
1.4.2.4 B6 phan tiém mdu (injection)
Trang 401.42 5 Cột sắc ky
Cĩ rất nhiều nhãn hiệu cột khác nhau hiện bán trên thị trường Chúng
được chia làm nhiều loại theo mục đích sử dụng, trong đĩ chủ yếu là: cột pha
dao RP C18 (ODS), cét pha thường C8, các loại cột chuyên dụng cho từng nhĩm chất Cột C18 và C8 được sử dụng cho phần lớn các hợp chất thơng thường
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu
năng cao
Cột pha tĩnh thơng thường làm bằng thép khơng rỉ, chiều dài cột khoảng 10 - 30cm, đường kinh trong 1-10mm
Thơng thường chất nhỏi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đã được Silan hĩa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngồi ra người ta cịn dùng các loại hạt khác như: nhơm Oxit, polyme xốp, chất trao đối ion
Đối với một số phương pháp phân tích địi hỏi phải cĩ nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phịng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven
column)
1.426 Đầu dị (Detector)
Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu
ghi trên sắc ký đồ để cĩ thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của
các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại Detector thích hợp và phải
thoả mãn điều kiện trong một vùng nơng độ nhất định của chất phân tích
A=kC
Trong đĩ: A: là tín hiệu đo được
C : Nồng độ chất phân tích
k:là hằng số thực nghiệm của Detector đã chọn