Xác định đồng thời một số kháng sinh quinolon trong tôm và nước nuôi tôm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐÀO THỊ VÂN KHÁNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG TÔM VÀ NƢỚC NUÔI TÔM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI, 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐÀO THỊ VÂN KHÁNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG TÔM VÀ NƢỚC NUÔI TÔM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH MÃ SỐ: 60440118 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS LÊ THỊ HỒNG HẢO HÀ NỘI, 2015 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian nghiên cứu học tập hoàn thành luận văn cao học với đề tài: “Xác định đồng thời số kháng sinh quinolone tôm nước nuôi tôm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)” hướng dẫn bảo PGS TS Lê Thị Hồng Hảo thầy cô, anh chị, bạn môn Hóa phân tích Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc xin chân thành cảm ơn PGS TS Lê Thị Hồng Hảo người giao đề tài tận tình dẫn trình hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Kazuo HARADA khoa Dược Trường ĐH OSAKA Nhật Bản Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô Bộ môn hóa phân tích, ban học viên lớp cao học K24 tạo điều kiện, giúp đỡ thời gian thực đề tài Đồng thời xin cảm ơn tới Ban Giám đốc Viện Pasteur Nha Trang, Giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm khu vực miền Trung bạn đồng nghiệp Xin cám ơn lãnh đạo nhân viên chi Cục Nuôi trồng Bảo vệ nguồn lợi thủy sản Khánh Hòa giúp thực việc thu thập mẫu thực đề tài Trong trình thực khóa luận, nỗ lực cố gắng không tránh khỏi thiếu sót kính mong ý kiến bảo, phê bình quí thầy cô Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2015 Học viên Đào Thị Vân Khánh i MỤC LỤC MỞ ĐẦU -1 Chƣơng I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU -3 1 Tổng quan kháng sinh nhóm quinolon 1.1.1 Cấu tạo kháng sinh nhóm quinolon -3 1.1.2 Cơ chế tác dụng độc tính 1.2 Tình hình sử dụng tồn dƣ kháng sinh nhóm quinolon 1.2.1 Tình hình sử dụng tồn dư kháng sinh nhóm quinolon nước -6 1.2.2 Tình hình sử dụng tồn dư kháng sinh nhóm quinolon giới 1.3 Các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng chất nhóm quinolon 10 1.3.1 Phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) - 10 1.3.2 Phương pháp vi sinh vật 11 1.3.3 Phương pháp hóa lý 13 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 21 2.2 Đối tƣợng nội dung nghiên cứu - 22 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Khảo sát quy trình tối ưu phân tích đồng thời quinolon - 21 2.3.2 Phương pháp lấy mẫu 23 2.3.3 Xử lý số liệu 23 2.4 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng nghiên cứu 23 2.4.1 Thiết bị dụng cụ - 23 2.4.2 Hóa chất, chất chuẩn - 24 ii CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Tối ƣu điều kiện thiết bị HPLC 25 3.1.1 Khảo sát bước sóng kích thích phát xạ chất - 27 3.1.2 Khảo sát pha động 29 3.1.3 Khảo sát khoảng tuyến tính chất chuẩn -36 3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu phân tích 36 3.2.1 Giai đoạn làm mẫu sử dụng cột chiết pha rắn (SPE) - 36 3.2.2 Khảo sát giai đoạn chiết mẫu - 42 3.3 Thẩm định phƣơng pháp - 45 3.3.1 Độ đặc hiệu 46 3.3.2 Giới hạn phát hiện(LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 48 3.3.3 Độ lặp lại, độ thu hồi 50 3.4 Kết phân tích đánh giá dƣ lƣợng kháng sinh 52 3.4.1 Thu thập mẫu tôm nuôi nước nuôi tôm 52 3.4.2 Kết phân tích mẫu - 53 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Công thức cấu tạo pKa chất .4 Bảng 1.2: Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon theo EEC No.2377/1990 .6 Bảng 1.3: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Thông tư 08/VBHNBNNPTNT Bảng 1.4: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT Bảng 1.5: Lượng kháng sinh tiêu thụ sản phẩm thịt phát có chứa kháng sinh quinolon Bảng 3.6: Bước sóng kích thích phát xạ 07 chất phân tích 29 Bảng 3.7: Chương trình gradient dung môi pha động tối ưu .36 Bảng 3.8: Phương trình hồi qui hệ số tương quan chất phân tích 37 Bảng 3.9 : So sánh diện tích píc dung dịch chuẩn bay không bay 39 Bảng 3.10: So sánh độ thu hồi cột SPE C18 cột HLB 40 Bảng 3.11: Độ thu hồi theo thể tích mẫu nước ban đầu .43 Bảng 3.12: Kết xác định giới hạn phát mẫu nước 51 Hình 3.13: Sơ đồ chiết mẫu dự kiến 52 Bảng 3.14 : Độ thu hồi, độ lặp lại mẫu nước thêm chuẩn 53 Bảng 3.15: Độ thu hồi, độ lặp lại mẫu tôm thêm chuẩn .54 Bảng 3.16: Danh sách mẫu nước phát chứa tồn dư kháng sinh 55 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung quinolon Hình 1.2: Cân acid - base nhóm acidic quinolon Hình 1.3: Cân acid base nhóm piperazinyl quinolon Hình 2.4: Sơ đồ quy trình xác định quinolon nước tôm 23 Hình 3.5: Phổ hấp thu phát xạ 07 chất phân tích 28 Hình 3.6: Kết khảo sát với hệ dung môi 30 Hình 3.7: Sắc ký đồ OA FMQ tốc độ dòng: 1,0; 1,5; 2,0mL/phút 32 Hình 3.8: Sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký theo pH dung dịch đệm pha động .33 Hình 3.9: Sắc ký đồ 07 chất phân tích nồng độ đệm .34 Hình 3.10: Sắc ký đồ tách 07 chất nhóm quinolon 35 Hình 3.11: So sánh diện tích pic chất dùng dung dịch rửa cột SPE 41 Hình 3.12: Độ thu hồi theo thể tích rửa giải 42 Hình 3.13: Sơ đồ chiết mẫu dự kiến 44 Hình 3.14: Sắc ký đồ mẫu trắng chiết loại dung môi 45 Hình 3.15: Biểu đồ so sánh dung dịch chiết 45 Hình 3.16: Khảo sát pH dung dịch chiết 46 Hình 3.17: Mẫu trắng nước nuôi tôm nước nuôi tôm thêm chuẩn 49 Hình 3.18: Nền mẫu tôm thêm chuẩn mẫu tôm 49 Hình 3.19: Sắc ký đồ mẫu nước xác định LOD 51 Hình 3.20: Sắc ký đồ mẫu tôm xác định LOD 52 Hình 3.21: Sắc ký đồ mẫu tôm có phát nhiễm ERFX 56 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AOAC Hiệp hội nhà phân tích hóa học (Association of Official Analytical Chemists) ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm BYT Bộ Y tế CPFX Ciprofloxacin DFLX Difloxacin DNFX Danofloxacin DAD Diot Array Detector DNA Deoxyribo Nucleic Acid EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ELISA Phương pháp miễn dịch enzym (enzyme-linked immunosorbent assay) ERFX Enrofloxacin HLB Hydrophilic Lipophilic Balanced (cột cân ưa nước ưa dầu) FMQ Flumequine FDA Hiệp hội thuốc thực phẩm (Food and Drug Administration) FLD Deetecor huỳnh quang (Fluorescence detector) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High-pressure liquid chromatography) LOD Giới hạn phát (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitaion) MPC Chiết cation hỗn hợp (Mixed-phase cation) NRFX Norfloxacin vi MRL Mức dư lượng tối đa (Maximum Residue Levels) MeOH Methanol MeCN Acetonitrile MS Khối phổ (Mass Spectrophotometer) MBFX Marbofloxacin OFLX Ofloxacin OA Oxolinic acid SRFX Sarafloxacin SDS Sodium Dodecyl Sulfate SPE Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction) QuEChERS Đơn giản, Dễ dàng, Rẻ, Hiệu quả, Ổn định, An toàn (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) RT Thời gian lưu (Retention Time) UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu (Ultra performance liquid chromatography) WHO Tổ chức Y tế giới (World Health Organisation) Ex Bước sóng kích thích (ExcitationWavelenght) Em Bước sóng phát xạ (EmissionWavelenght) vii MỞ ĐẦU Vệ sinh an toàn thực phẩm vấn đề quan tâm toàn xã hội, quốc gia toàn giới Thực phẩm không đảm bảo vệ sinh ảnh hưởng đến sức khỏe người mà liên quan chặt chẽ đến suất lao động, hiệu phát triển kinh tế, thương mại, du lịch an sinh xã hội Trong năm gần xuất dư lượng kháng sinh thủy hải sản thịt gia súc, gia cầm nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe người dân Tác hại thực phẩm có tồn dư kháng sinh sức khỏe người nhiều nghiên cứu như: tạo vi khuẩn kháng kháng sinh, gây dị ứng, gây quái thai, gây rối loạn nội tiết gây ung thư người Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam nằm danh sách nước có có tỷ lệ sử dụng kháng sinh cao giới nay, không sử dụng cho người, chất kháng sinh sử dụng rộng rãi ngành chăn nuôi Quinolon (hay gọi fluoroquinolone) họ kháng sinh có phổ tác dụng diệt khuẩn rộng, hiệu cao nên chúng sử dụng rộng rãi không để chữa bệnh cho người mà dùng để chữa bệnh cho gia cầm thủy sản công nghiệp Hậu giảm hiệu kháng sinh quinolon chủng vi khuẩn gây khó khăn tốn điều trị cho người bệnh Theo thông báo WHO năm 1999 có tới 11.000 người bị nhiễm khuẩn Campylobacter kháng quinolon ăn thịt gà có chứa quinolon (năm 1998 8.000 người) Có nhiều phương pháp để xác định tồn dư kháng sinh nhóm quinolon như: phương pháp miễn dịch enzym (ELISA); phương pháp vi sinh vật (test vi sinh vật), phương pháp lý hóa Phương pháp lý hóa sử dụng nhiều kỹ thuật khác sắc ký lỏng, điện hóa hòa tan, điện di mao quản, phương pháp có độ xác, độ chọn lọc cao, phát lượng nhỏ kháng sinh tồn dư thực phẩm Phương pháp sử dụng nhiều phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sử dụng loại detector detector UV, detector huỳnh quang (FLD) detector khối phổ (MS) Việc ứng dụng phương pháp HPLC phân tích nhóm quinlon mẫu 5/8 NH12 N5 NH12-T5 1/7 NH13-N3 NH13-T3 52 20/7 NH13-N4 NH13-T4 53 5/8 NH13-N5 NH13-T5 54 19/8 NH13-N6 NH13-T6 55 8/9 NH13-N7 NH13-T7 56 22/9 NH13-N8 NH13-T8 10/6 NH14-N2 NH14-T2 58 1/7 NH14-N3 NH14-T3 59 5/8 NH14 N5 NH14-T5 15/6 NH15-N2 NH15-T2 61 10/7 NH15-N3 NH15-T3 62 5/8 NH15 N5 NH15-T5 14/7 NH16-N2 NH16-T2 64 5/8 NH16-N3 NH16-T3 65 19/8 NH16-N4 NH16-T4 66 22/9 NH16-N6 NH16-T6 5/8 NH17 N5 NH17-T5 68 19/8 NH17-N6 NH17-T6 69 6/9 NH18-N2 NH18-T2 70 19/8 NH18-N3 NH18-T3 19/8 NH19-N2 NH19-T2 8/9 NH19-N3 NH19-T3 19/8 NH20-N2 NH20-T2 74 8/9 NH20-N3 NH20-T3 75 22/9 NH20-N4 NH20-T4 50 51 57 60 63 67 71 10/6 6/6 29/5 8/7 29/5 2/8 72 73 4/8 68 76 27/7 78 79 80 13/8 NH21-T2 NH21-N3 NH21-T3 8/9 NH22-N3 NH22-T3 22/9 13/8 NH21-N2 22/9 77 8/9 NH22-N4 NH22-T4 22/9 NH23-N1 NH23-T1 Phụ lục số 2: Khảo sát tốc độ dòng 69 Phụ lục số 3: Khảo sát khoảng tuyến tính DNFX Phụ lục sô 4: Khảo sát khoảng tuyến tính ERFX Phụ lục số 5: Khảo sát khoảng tuyến tính SRFX 70 Phụ lục số 6: Khảo sát khoảng tuyến tính CPFX Phụ lục số 7: Khảo sát khoảng tuyến tính DFLX Phụ lục số 8: Khảo sát khoảng tuyến tính OA 71 Phụ lục số 9: Khảo sát khoảng tuyến tính FMQ Phụ lục số 10: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 200ppb bay không bay 72 Phụ lục số 11: Sắc ký đồ so sánh cột C18 cột HLB (100µl dung dịch chuẩn 1ppm) Phụ lục số 12: Sắc ký đồ so sánh dung dịch rửa cột HLB 73 Phụ lục số 13: Sắc ký đồ rửa giải 5mL 10mL MeCN Phụ lục số 14: Độ thu hồi mẫu nước thể tích mẫu 200ml a) dung dịch chuẩn 200ppb; b) mẫu nước thêm chuẩn 74 Phụ lục số 15: Độ thu hồi mẫu nước thể tích mẫu 500ml a) dung dịch chuẩn 500ppb; b) mẫu nước thêm chuẩn Phụ lục số 16: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 100ppb 75 Phụ lục số 17: Sắc ký đồ mẫu tôm thêm chuẩn chiết dung môi 1(thêm 50µl dung dịch chuẩn 1ppm) Phụ lục số 18: Sắc ký đồ mẫu tôm thêm chuẩn chiết dung môi (thêm 50µl dung dịch chuẩn 1ppm) 76 Phụ lục số 19: Sắc ký đồ mẫu tôm thêm chuẩn chiết dung môi (thêm 50µl dung dịch chuẩn 1ppm) Phụ lục số 20: Sắc ký đồ 06 mẫu nước thêm chuẩn nồng độ 0,05ppb 77 Phụ lục số 21: Sắc ký đồ lặp 06 mẫu nước thêm chuẩn 0,5ppb Phụ lục số 22: Sắc ký đồ độ lặp lại mẫu tôm thêm chuẩn nồng độ 0,5MRL 78 Phụ lục số 23: Sắc ký đồ độ lặp lại mẫu tôm thêm chuẩn nồng độ 1,5MRL 79 Phụ lục số 24: Sắc ký đồ độ lặp lại mẫu tôm thêm chuẩn nồng độ 1MRL (n=6) 80 81 Phụ lục số 25: Sắc ký đồ mẫu nước phát nhiệm nhiễm kháng sinh quinolone 82