luận văn thạc sĩ cải biến phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP HPLC) xác định lutein, ứng dụng khảo sát quá trình xà phòng hóa luteinester

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Mỹ Kim Vương CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO (RP – HPLC) XÁC ĐỊNH LUTEIN, ỨNG DỤNG KHẢO SÁT Q TRÌNH XÀ PHỊNG HỐ LUTEIN ESTER LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC Nha Trang - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Mỹ Kim Vương CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO (RP – HPLC) XÁC ĐỊNH LUTEIN, ỨNG DỤNG KHẢO SÁT Q TRÌNH XÀ PHỊNG HỐ LUTEIN ESTER Chun ngành : Hố phân tích Mã số : 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Người hướng dẫn TS Hoàng Thị Huệ An Người hướng dẫn TS Trần Thị Phương Anh Nha Trang - 2019 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Cải biến phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (RP – HPLC) xác định lutein, ứng dụng khảo sát q trình xà phòng hố lutein ester” cơng trình nghiên cứu cá nhân chưa cơng bố cơng trình khoa học khác thời điểm Nha Trang, ngày tháng 10 năm 2019 Tác giả luận văn Lê Mỹ Kim Vương Lời cảm ơn Trong trình nghiên cứu hồn thành luận văn này, tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy cô giáo, nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực bạn bè lớp Đầu tiên xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Hồng Thị Huệ An TS Trần Thị Phương Anh tận tình hướng dẫn tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Cơng nghệ, Khoa Hố học Phòng Đào tạo tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ thực luận văn hoàn thành thủ tục cần thiết Tôi chân thành cảm ơn thầy cô Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang tận tình truyền đạt kiến thức cho tơi suốt khóa học, đồng thời giúp tơi hồn thành thủ tục cần thiết Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo thầy cô Trung tâm Thí nghiệm Thực hành Trường Đại học Nha Trang hỗ trợ trang thiết bị thuận lợi giúp thực luận văn Đề tài thực khn khổ dự án “Hồn thiện quy trình cơng nghệ chiết xuất, tinh chế hoạt chất lutein, zeaxanthin từ cúc vạn thọ”, mã số CNHD.DASXTN.026/17-18 thuộc Chương trình nghiên cứu KHCN trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm 2020 Xin trân trọng cảm ơn Bộ Cơng Thương Phòng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ lọc, hóa dầu cấp kinh phí thực dự án Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè quan tâm, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận văn Trân trọng! Nha Trang, ngày tháng 10 năm 2019 Tác giả luận văn Lê Mỹ Kim Vương Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ANOVA analysis of variance Phân tích phương sai AOAC Assosiation of Official Analytical Chemists Hiệp hội nhà hóa phân tích thức ASTM American Society for Testing of Materials Hiệp hội phép thử Mỹ DAD Diod array detector Detector mảng diod DMF Dimethyle formamide DNA Acid Deoxyribonucleic ADN EU Europe Union Liên minh châu Âu FDA Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm dược phẩm GC-MS Gas chromatography mass spectrometry Sắc ký khí Khối phổ HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu chromatography cao ICH International Conference on Harmonization Hội đồng hòa hợp quốc tế JECFA The Joint FAO/WHO Expert Committee on Food) Hội đồng chuyên gia FAO/WHO phụ gia thực phẩm LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng MTBE Methyle tert-butyle ether R2 Correlation coefficient Hệ số tương quan RT Retention Time Thời gian lưu SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn S/N Signal to noise ratio Tỷ lệ tín hiệu nhiễu THF Tetrahydrofurane UV – Vis Ultraviolet – Visible Tử ngoại khả kiến v/v Volume/volume Thể tích/thể tích v/w Volume/weight Thể tích/khối lượng w/w Weight/weight Khối lượng/khối lượng lmax Wavelength of maximum absorption Bước sóng hấp thụ cực đại Danh mục bảng Bảng 1.1.Dữ kiện hấp thụ UV-Vis lutein zeaxanthin……………… 12 Bảng 2.1.Các thành phần pha động thử nghiệm chế độ rửa giải isocratic 52 Bảng 3.1.Ảnh hưởng thành phần pha động đến thừa số lưu giữ lutein lutein ester………………………………………………………………… 62 Bảng 3.2.Giá trị k’ lutein lutein ester thử nghiệm rửa giải theo chương trình gradient dung mơi đề nghị…………………………………….66 Bảng 3.3.Ảnh hưởng tốc độ pha động đến độ rộng chân peak số đĩa lý thuyết cột tách cấu tử phân tích…………………………… 67 Bảng 3.4.Ảnh hưởng thể tích bơm mẫu đến độ rộng chân peak, số đĩa lý thuyết chiều cao đĩa cấu tử phân tích……………………70 Bảng 3.5.Kết xác định hàm lượng carotenoid tổng số lutein có lutein đối chứng…………………………………………………………… 74 Bảng 3.6.Kết dựng đường chuẩn lutein (lặp lại lần song song)…… 75 Bảng 3.7.Khảo sát độ lặp lại tiêm mẫu chuẩn ngày……… 78 Bảng 3.8.Khảo sát độ thu hồi thêm mẫu chuẩn nồng độ 12; 15; 18ppm……………………………………………………………………… 81 Bảng 3.9 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ oleoresin đến hiệu suất xà phòng hố………………………………………………………………………… 84 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nồng độ KOH đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester…………………………………………………………………… ……86 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa…… 88 Bảng 3.12.Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester………………………………………………………………………….92 Bảng 3.13 Kết thử nghiệm quy trình xà phòng hố mẫu lớn.… 96 Bảng 3.14.Kết thử nghiệm quy trình xà phòng hố mẫu thêm chuẩn ……………………………………………………………………… 97 Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình 1.1 Cấu tạo phân tử lutein (dạng đồng phân all-trans) [15] 10 Hình 1.2 Một số dạng đồng phân cis thường gặp lutein [15] 11 Hình 1.3 Cấu tạo phân tử Zeaxanthin (b, b’-carotene - 3,3’-diol) [15] 11 Hình 1.4 Quá trình rửa giải tách peak chất A chất B [16] 17 Hình 1.5 Sơ đồ thiết bị HPLC [16] 18 Hình 1.6 Sắc ký đồ hỗn hợp cấu tử A B [16] 22 Hình 1.7 Ảnh hưởng độ chọn lọc đến hiệu tách hai chất 23 Hình 3.1 Ảnh hưởng thành phần pha động đến thời gian lưu rửa giải lutein lutein ester 63 Hình 3.2 Sơ đồ thay đổi thành phần pha động trình rửa giải 65 Hình 3.3 Sắc ký đồ chế độ rửa giải gradient dung mơi 65 Hình 3.4 Ảnh hưởng tốc độ dòng đến số đại lượng sắc ký 68 Hình 3.5 Sắc ký đồ hỗn hợp lutein lutein ester thay đổi tốc độ dòng từ 0,8 đến 1,2 ml/phút 69 Hình 3.6 Ảnh hưởng thể tích bơm mẫu đến trình sắc ký 71 Hình 3.7 Sắc ký đồ hỗn hợp lutein lutein ester thay đổi thể tích bơm mẫu 72 Hình 3.8 Đường chuẩn lutein khoảng nồng độ – 40 ppm 75 Hình 3.9 Kết HPLC mẫu trắng, mẫu chứng thực, mẫu thực mẫu thêm 76 Hình 3.10 Đường chuẩn lutein khoảng nồng độ – 30 ppm 79 Hình 3.11 Sắc ký đồ HPLC mẫu oleoresin khơng xà phòng hóa (lutein ester) ứng với nồng độ oleoresin 0,2 g/ml 82 Hình 3.12 Sắc ký đồ HPLC mẫu oleoresin sau xà phòng hóa (lutein tự do) ứng với nồng độ oleoresin 0,2 g/ml 82 Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu lutein đối chứng cho thấy trans-lutein có RT ~ 0,89 phút 83 Hình 3.14 Phổ hấp thụ UV-Vis ứng với: a) peak trans-lutein (RT ~ 8,9 min); b) peak cis-lutein (RT ~ 10,3 min) 83 Hình 3.15 Đồ thị ảnh hưởng nồng độ oleoresin 85 Hình 3.16 Sự phụ thuộc hiệu suất xà phòng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin thay đổi nồng độ oleoresin từ 0,1 – 0,9 g/ml 87 Hình 3.17 Sự phụ thuộc hiệu suất xà phòng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin cố định nồng độ oleoresin 0,3 g/ml 87 Hình 3.18 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester 88 Hình 3.19 Sắc ký đồ HPLC mẫu oleoresin 0,3 g/ml sau xà phòng hóa KOH 5% w/v EtOH h nhiệt độ khác 91 Hình 3.20 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester 92 Hình 3.21 Sắc ký đồ HPLC mẫu xà phòng hố khoảng thời gian khác 95 94 a) Mẫu chưa xà phòng hóa b) Mẫu xà phòng hóa 20 phút c) Mẫu xà phòng hố 40 phút 95 d) Mẫu xà phòng hố 60 phút e) Mẫu xà phòng hố 80 phút f) Mẫu xà phòng hố 100 phút g) Mẫu xà phòng hố 120 phút h) Mẫu xà phòng hố 180 phút Hình 3.21 Sắc ký đồ HPLC mẫu xà phòng hố khoảng thời gian khác 96 3.5.5 Kết luận khảo sát điều kiện xà phòng hố Qua kết khảo sát điều kiện xà phòng hố để đạt để hiệu suất xà phòng hố cao, rút số kết luận sau: - Nồng độ oleoresin 0,8g/ml ứng với nồng độ KOH tối ưu 14,4% w/v tức tỷ lệ KOH/oleoresin 0,18 w/w - Nhiệt độ xà phòng hố để đạt hiệu suất cao 700C - Thời gian xà phòng hố 80 phút 3.6 THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH XÀ PHỊNG HỐ 3.6.1 Thử nghiệm mẫu lớn Kết thử nghiệm quy trình xà phòng hố cao chiết lutein ester mẫu lớn thể bảng 3.13 Bảng 3.13 Kết thử nghiệm quy trình xà phòng hoá mẫu lớn Mẫu đo Strans- Scis- Stổng Mẫu Lần 4695346 2202866 6898212 Lần 4604332 2005289 6609621 Lần 5351572 2196035 7547607 TB %RSD Mẫu Lần 3915929 1608596 5524525 Lần 4131982 1515102 5647084 Lần 4387990 1269674 5657664 Trung bình %RSD CLutein tìm CLutein tổng mLutein (g) (ppm) thấy(ppm) 48,64 59,75 0,60 46,65 57,30 0,57 53,13 65,25 0,65 49,47 60,77 0,61 6,70 6,70 6,70 39,16 48,10 0,48 40,01 49,14 0,49 40,08 49,23 0,49 39,75 48,82 0,49 1,29 1,29 Trung bình %RSD 1,29 0,55 15,41 Từ kết cho thấy, %RSD mẫu lớn cao 15,41% vượt so với yêu cầu 7,3% Từ cho thấy khả ứng dụng điều kiện xà phòng hố nghiên cứu 97 3.6.2 Thử nghiệm mẫu thêm chuẩn Kết đo thể bảng 3.14 Bảng 3.14 Kết thử nghiệm quy trình xà phòng hố mẫu thêm chuẩn Mẫu Lần Strans- Scis- CLutein tìm thấy CLutein tổng mLutein (ppm) (ppm (g) 12385746 86,53 106,27 1,06 10286373 72,03 88,47 0,88 12144364 84,86 104,23 1,04 TB 81,14 99,66 1,00 %RSD 9,77 9,77 9,77 12410900 86,70 106,49 1,06 11100028 77,65 95,37 0,95 14765233 102,95 126,45 1,26 TB 89,10 109,43 1,09 %RSD 14,39 14,39 14,39 TB(1+2) TB(1+2) 1,05 %RSD 6,61 Stổng 1 9344453 3041293 7852670 2433703 8604178 3540186 9153751 3257149 8230904 2869124 10981777 3783456 Từ kết bảng 3.17 3.18, ta tính hiệu suất thu hồi q trình xà phòng hố sau: %Rxà phòng hố = (mlutein (mẫu thêm chuẩn) – mlutein (mẫu lớn)) *100/mlutein (đã thêm vào) = (1,05 – 0,55)*100/0,6 = 83,3% Vậy hiệu suất thu hồi q trình xà phòng hố nghiên cứu 83,3% Kết đạt yêu cầu so với quy định (80% – 110%) Từ kết tính hiệu suất thu hồi q trình xà phòng hố, ta tính hiệu suất thu hồi tồn q trình phân tích, bao gồm q trình xà phòng hố q trình phân tích HPLC, cụ thể sau: %Rquá trình = (%Rxà 83,3/100)*100/1 = 67,9% phòng hố * %RHPLC) * 100/1 = (81,52/100 * Với kết hiệu suất thu hồi toàn q trình phân tích trên, ta hồn tồn ứng dụng phương pháp nghiên cứu vào việc phân tích lutein carotenoid khác 98 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Từ kết thu qua nghiên cứu đến kết luận sau: Đã xây dựng phương pháp HPLC định lượng lutein hỗn hợp chứa lutein ester chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L sử dụng cột pha ngược C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) sau: - Pha động: gồm hệ dung môi A = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:40:10:5 (v/v/v/v) B = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:14:40:1 (v/v/v/v) Rửa giải gradient theo chương trình sau: - 10 phút: 0% B (100% A) 10 – 25 phút: 0% B đến 100% B (100% A 0% A) (gradient tuyến tính) 25 - 60 phút: 100% B 60 – 70 phút: 100% B 0% B 70 – 75 phút: 0% B (Cân cột) - Tốc độ dòng: ml/phút - Thể tích bơm mẫu: 20 µl - Nhiệt độ cột 250C - Detector DAD quét phổ từ 190-840 nm ghi nhận tín hiệu 450 nm Phương pháp HPLC xây dựng có -Tính đặc hiệu cao, phân biệt rõ peak lutein lutein ester - Độ lặp lại phương pháp tốt với %RSD 7.01% - Độ tuyến tính đường chuẩn nằm khoảng nồng độ – 30 ppm với độ lệch chuẩn R2 0,9791 99 - Giới hạn phát LOD = 0,84ppm giới hạn định lượng LOQ = 2,55ppm - Hiệu suất hồi đạt yêu cầu với %R trung bình 81,52% Dựa việc ứng dụng phương pháp HPLC nói trên, xác định điều kiện thích hợp để xà phòng hố lutein ester từ hoa cúc vạn thọ sau: - Nồng độ oleoresin 0,8g/ml ứng với nồng độ KOH tối ưu 14,4% w/v tức tỷ lệ KOH/oleoresin 0,18 w/w - Nhiệt độ xà phòng hố để đạt hiệu suất cao 700C - Thời gian xà phòng hố 80 phút Với hiệu suất thu hồi lutein trình xà phòng hố 83,3% hiệu suất thu hồi tồn q trình phân tích đạt 67,9%, ta hồn tồn ứng dụng phương pháp nghiên cứu vào nghiên cứu lutein carotenoid khác 4.2 KIẾN NGHỊ Để có sở chắn phương pháp HPLC xây dựng, cần có nghiên cứu thêm ứng dụng phương pháp lên mẫu thực hoa tươi, sản phẩm lutein chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ 100 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Miroslav ŠIVEL, Stanislav KRÁČMAR, Miroslav FIŠERA, Bořivoj KLEJDUS, Vlastimil KUBÁŇ, 2014, Lutein Content in Marigold Flower (Tagetes erecta L.) Concentrates used for Production of Food Supplements, Czech J Food Sci., 32(6): 521–525 [2] Johnson, E J (2002) The role of carotenoids in human health Nutrition in clinical care, 5(2), 56-65 [3] Koushan, K., Rusovici, R., Li, W., Ferguson, L R., & Chalam, K V (2013) The role of lutein in eye-related disease Nutrients, 5(5), 18231839 [4] Bộ Y Tế, 2012, Thông tư Hướng dẫn việc quản lý phụ gia thực phẩm, Số: 27/2012/TT-BYT (20/11/2012) [5] Gregory, G K., CHEN, T S., & PHILIP, T., 1986, Quantitative analysis of lutein esters in marigold flowers (Tagetes erecta) by high performance liquid chromatography Journal of Food Science, 51(4), 1093-1094 [6] Ausich, R.L., Sanders, D J., 1997), Process for the formation, isolation and purification of comestible xanthophyll crystals from plants, US Patent: 5,648,564 [7] Kumar, S T K., Abdnlkadir; S P., Sebastian, S., 2004, Process for the preparation of xanthophyll crystals, US Patent, 6,743,953 B2 [8] Swaminathan, S., Madavalapil, K.P., 2009, Isolation and purification of carotenoids from Marigold flowers, US Patent, 7,622,599 B2 101 [9] Sarkar, C.R., Bhagawati, B., Das, L., Goswami, B.C., 2012, An efficient condition of Saponification of Lutein ester from marigold flower, J Annals of Biological Research, (3):1461-1466 [10] Aman, R., Biehl, J., Carle, R., Conrad, J., Beifuss, U., Schieber, A., 2005, Application of HPLC coupled with DAD, APCI-MS and NMR to the analysis of lutein and zeaxanthin stereoisomers in thermally processed vegetables, J Food Chem., 92: 753-763 [11] Cantrill, R., 2004, Lutein from Tagetes erecta: Chemical and Technical Assessment, 63rd, JECFA [12] JECFA 2004, Lutein from Tagetes erecta, Vol 4: 1–4 [13] Hoàng Thị Huệ An, 2009, Nghiên cứu định lượng astaxanthin carotenoid kèm đối tượng thủy sản phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), Luận án Tiến sĩ chuyên ngành Hóa Phân tích, Viện Hóa học, Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam [14] Trương Ngọc Bảo Hiếu, Ngô Văn Tứ, 2017, Phân tích hàm lượng bcaroten số loại ngũ cốc có màu Thừa Thiên Huế phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, Hue University J Science: Natural Science, 126 (1D) [15] Ranjita Shegokar, Khalil Mitri, 2012, Carotenoid Lutein: A Promising Candidate for Pharmaceutical and Nutraceutical Applications, Journal of Dietary Supplements, 9(3):183–210 [16] Updike, A A., & Schwartz, S J., 2003, Thermal processing of vegetables increases cis isomers of lutein and zeaxanthin Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(21), 6184-6190 102 [17] Philip, T., 1977, Purification of lutein-fatty acid esters from plant materials, US Patent, 4,048,203 [18] S Madavalapil, K P., 2009, Isolation and purification of carotenoids from Marigold flowers, US Patent, 7,622,599 B2 [19] Britton, G., 1995, Structure and properties of carotenoids in relation to function, The FASEB Journal, 9, 1551-1558 [20] Craft, N E., Soares, J H., 1992, Relative Solubility, Stability, and Absorptivity of Lutein and b-Carotene in Organic Solvents, J Agric Food Chem., 40(431-434) [21] Aman, R., Biehl, J., Carle, R., Conrad, J., Beifuss, U., Schieber, A., 2005, Application of HPLC coupled with DAD, APCI-MS and NMR to the analysis of lutein and zeaxanthin stereoisomers in thermally processed vegetables, J Food Chem., 92, 753-763 [22] Karawya, M.S., Hammouda, F.M., S.I Ismail, A.K Zaki, N.M Nazif, 1996, HPLC and MS analyses of lutein – ester from Tagetes Patuia L., Quatar Univ Sci J., 16(2), 251 – 255 [23] Khachik, F., 1995, Process for isolation, purification and recrystallization of lutein from saponified marigold oleoresin and uses thereof, US Patent, 5,382,714 [24] Ribaya, J D., Jeffrey, B B., 2004, Lutein and Zeaxanthin and Their Potential Roles in Disease Prevention, J Amer College of Nutri., 23 (6), 567- 587 [25] Shao, A., 2001, The role of Lutein in Human Health, American Nutraceutical Association (JANA), 4(2), 8-19 [26] Thorne Research, Inc., 2005, Lutein and Zeaxanthin, Alt Med Review, 10(2), 128-135 [27] Wang, M., Tsao, R., Zhang, S., Dong, Z., Yang R., Gong, J., Pei, Y., 2006, Antioxidant activity, mutagenicity/anti-mutagenicity, and 103 clastogenicity /anti-clastogenicity of lutein from marigold flowers, Food & Chem Toxic., 44: 1522–1529 [28] Deutsch, M.J., 1984, Vitamins and other nutrients Williams, S (Ed.) Official methods of analysis of the AOAC, 14th ed Virginia, Association of Official Analytical Chemists, 1984, 834-835 [29] EFSA, 2010, Scientific Opinion on the re-evaluation of lutein (E 161b) as a food additive, EFSA Journal, 8(7):1678 [30] John, T.L., Richard, A.B., 2001, Lutein, Zeaxanthin, and the Macular Pigment, Archives of Biochem & Biophys., 385(1), 28 - 40 [31] Tso, M O M, Lam, T T., Method of retarding and ameliorating central nervous system and eye damage, US Patent, 5527533 [32] http://vietnamnet.vn/vn/doi-song/suc-khoe/99497/phat-hien-moi-vekha-nang-ho-tro-tri-nao-cua-lutein.html [33] Johnson, E.J., 2012, A possible role for lutein and zeaxanthin in cognitive function in the elderly, Am J Clin Nutr., doi: 10.3945/ajcn.112.034611, USA, 1S-5S [34] WHO, 2006, Safety evaluation of certain food additives, WHO Food Additives, Series: 54, WHO Press, Geneva [35] Kale, S, Gaikwad, M, Bhandare, S., 2011, Determination and comparison of in vitro SPF of topical formulation containing Lutein ester from Tagetes erecta L flowers, Moringa oleifera Lam seed oil containing Lutein ester, International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, Vol (3):1220–1223 [36] Roberts, R L., Green, J., & Lewis, B (2009) Lutein and zeaxanthin in eye and skin health Clinics in Dermatology, 27(2), 195-201 [37] Sunita, T., D’mello, P.M., 2010, Enzyme assisted extraction of lutein from marigold flowers and its evaluation by HPLC, Inter J Adv in Pharm Sci., 2, 381-386 104 [38] Nguyễn Thành Lộc, 2013, Xác định đồng thời Paracetamol Ibuprofen dược phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao – HPLC, Khoá luận tốt nghiệp Hoá học, Trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh [39] Dr Phạm Luận, 1999, Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu suất cao, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội [40] Veronika R Meyer, Practical High – Performance Liquid Chromatography, New York, USA [41] DS Trần Cao Sơn, PGS.TS Phạm Xuân Đà, TS Lê Thị Hồng Hảo, CN Nguyễn Thành Trung, Thẩm định phương pháp phân tích hố học vi sinh vật, Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh Thực phẩm quốc gia [42] Tee E Siong, Lim Chin Lam, 1992, Analysis of Carotenoids in Vegetables by HPLC, J ASEAN Food, (2) [43] Ausich, R L., Sanders, D J., 1997, Process for the formation, isolation and purification of comestible xanthophyll crystals from plants, US Patent, 5,648,564 [44] Domenico Montesano & Oriella Gennari & Serenella Seccia & Stefania Albrizio, 2012, A Simple and Selective Analytical Procedure for the Extraction and Quantification of Lutein from Tomato By-Products by HPLC–DAD, Food Anal Methods, 5:710–715 [45] Prateek Gupta, Yellamaraju Sreelakshmi, Rameshwar Sharma, 2015 A rapid and sensitive method for determination of carotenoids in plant tissues by high performance liquid chromatography, Plant Methods, 11:5 [46] Md Habib Ullah Bhuyian, A.F.M Ariful Islam, Md Isha Tareque, 2015, Development and validation of method for determination of lutein by HPLC, World J Pharm Res., 4(04): 145-156 105 [47] Rodriguez-Amaya, D B., 2001, A Guide to Carotenoid Analysis in Foods, ILSI Press, USA [48] Barzana, E., Rubio, D., Santamaria, R.I, Garcia-Correa, O., Garcia, F., Ridaura Sanz, V.E, Loa pez-Munguiaa, A., 2002, Enzyme-mediated solvent extraction of carotenoids from marigold flower (Tagetes erecta), Agric.& Food Chem., 50, 4491–4495 [49] Khachik, F., 2001, Process for extraction and purification of lutein, zeaxanthin and rare carotenoids from Marigold flowers and plants, US Patent, 6,262,284 B1 [50] Madhavi, D L., 2002, Process for isolation of mixed carotenoid from plants, US Patent, 6380442 B1 [51] Joseph, S., Nadu, T., Anandane, A., Nagar, R R., 2013, Process for isolation and purification of carotenoids, US Patent 2013/00661 [52] Jing Tan, Jason Gek Leong Neo, Tania Setiawati, Chunyan Zhang, 2017, Determination of Carotenoids in Human Serum and Breast Milk Using High Performance Liquid Chromatography Coupled with a Diode Array, Separations, 4: 19 Phụ lục Phụ lục Phương pháp định lượng carotenoit tổng số % lutein, % zeaxanthin sản phẩm lutein tinh chế Cân xác khoảng 20 - 30 mg mẫu sản phẩm lutein cho vào bình định mức 100 ml, thêm vài giọt diclorometan cho tan pha loãng định mức đến vạch etanol (có chứa 0,1% BHT), lắc 10 phút, thu dung dịch A a) Định lượng % catotenoid tổng số Lấy ml dung dịch A cho vào bình định mức 100 ml pha loãng etanol (chứa 0,1% BHT), đảo trộn 20 giây Đo độ hấp thụ dung dịch 446 nm, cuvet cm (dùng etanol 0,1% BHT làm dung dịch nền) Tính kết quả: %Toal carotenoids (%) = A446 nm x 1000 G x 2550 : - 1000: hệ số pha lỗng; - 2550: độ hấp thụ dung dịch carotenoit 1% đo etanol với cuvet cm b) Định lượng %lutein %zeaxanthin Hút ml dung dịch A cho vào bình định mức 100 ml pha loãng hexan: axetat 70:30 v/v, đảo trộn 20 sec, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 µum bơm vào máy HPLC với detector PDA Điều kiện chạy HPLC: - Cột bảo vệ: C18; - Cột phân tích: C18 (3 µm, 4,6 mm x 250 mm) - Nhiệt độ cột: 300C - Pha động: hexan/axetat etyl 70:30 (v/v) - Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: µl - Bước sóng phát hiện: 445 nm - Thời gian phân tích: 40 phút Phát peak lutein zeaxanthin dựa vào phổ hấp thụ đặc trưng chúng cho detector DAD % Lutein = % Carotenoit tổng số x %Diện tích peak lutein % Zeaxanthin = % Carotenoit tổng số x %Diện tích peak zeaxanthin Phụ lục 2.Phổ UV-Vis lutein tinh chế Hình PL2 Phổ hấp thụ UV-Vis lutein tinh chế hexan Phụ lục Một số hình ảnh thí nghiệm Hình PL3.1 Xà phòng hố lutein Hình PL3.2 Mẫu lutein ester sau ester xà phòng hố Hình PL3.3 Chiết lutein tự sau Hình PL 3.4 Mẫu lutein tự xà phòng hố acetone (HPLC) ... Vương CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO (RP – HPLC) XÁC ĐỊNH LUTEIN, ỨNG DỤNG KHẢO SÁT Q TRÌNH XÀ PHỊNG HỐ LUTEIN ESTER Chun ngành : Hố phân tích Mã số : 8440118 LUẬN VĂN THẠC... biến phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (RP – HPLC) xác định lutein, ứng dụng khảo sát trình xà phòng hố lutein ester” cơng trình nghiên cứu cá nhân chưa công bố cơng trình khoa học khác... KOH đến hiệu suất xà phòng hóa 85 3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa 88 3.5.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa 92 3.5.5 Kết luận khảo sát điều