Xây dựng và đánh giá quy trình phân tích benzoat và sorbat trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (tt)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - VÕ THỊ MINH THƢƠNG XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH BENZOAT VÀ SORBAT TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO C C R UT.L D Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Mã số : 60.54.01.01 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Đà Nẵng, Năm 2020 Cơng trình đƣợc hồn thành TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Mạc Thị Hà Thanh Phản biện 1: TS Nguyễn Thị Đơng Phương Phản biện 2: TS Đỗ Chí Thịnh C C R UT.L D Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ thực phẩm, họp Đại học Bách khoa vào ngày 26 tháng 12 năm 2020 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Học liệu Truyền thông trường Đại học Bách khoa Đại học Đà Nẵng - Thư viện Khoa Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách khoa - Đại học Đà Nẵng ĐẶT VẤN ĐỀ Lý chọn đề tài Trên thị trường nay, thực phẩm có sử dụng phụ gia làm chất bảo quản chiếm tỷ lệ lớn, việc sử dụng chất bảo quản ngồi danh mục cho phép hay sử dụng hàm lượng quy định Tác hại sử dụng chất bảo quản sai quy định ảnh hưởng sức khỏe người Những tác động thường không xảy cấp tính, rầm rộ nguy kịch mà diễn biến lâu dài tích lũy thể Có nhiều loại hợp chất bảo quản sử dụng axit benzoic; natri benzoat loại benzoat thay (kali benzoatvà canxi benzoat); kali sorbat; natri metabisulfite; natri sulfite C C R UT.L Trong số nhóm benzoat sorbat chất bảo quản phép sử dụng rộng rãi nhiều loại thực phẩm với giới hạn D định Tuy nhiên, việc lạm dụng mức cho phép hai nhóm chất bảo quản ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), liều lượng natri benzoat tối đa mà thể xử lý mg/kg thể trọng ngày.Liều lượng gây độc người mg/kg thể trọng Cơ quan An toàn Thực phẩm châu Âu (EFSA) khuyến cáo lượng tiêu thụ kali sorbat an toàn với người 25 mg/kg trọng lượng ngày [1] Hiện nay, việc kiểm tra chất bảo quản thực phẩm nội dung công tác kiểm tra, giám sát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm Việt Nam nói chung Quảng Ngãi nói riêng Cho đến giới có nhiều phương pháp phân tích triển khai chuẩn hóa phịng thí nghiệm, bao gồm phương pháp xác định riêng chất bảo quản phương pháp xác định đồng thời chất bảo quản: phương pháp chuẩn độ [2], phương pháp sắc ký lớp mỏng [3], phương pháp quang phổ [4], sắc ký lỏng hiệu cao [5, 6] Do vậy, việc phịng thí nghiệm cần nghiên cứu xây dụng quy trình phân tích góp phần vào việc giám sát chất lượng thực phẩm cần thiết Việc kiểm tra chất bảo quản nhóm benzoat sorbat thực phẩm thường tiến hành phương pháp khác Tuy nhiên, phương pháp xác định đồng thời hai nhóm chất bảo quản phương pháp nội số phịng thí nghiệm Cho đến nay, hệ thống TCVN xây dựng ban hành phương pháp xác định đồng thời hai chất bảo quản mẫu C C R UT.L riêng lẻ Bản thân phương pháp đáp ứng phần nhỏ yêu cầu mặt kỹ thuật, muốn triển khai áp dụng D đơn vị cần phải đánh giá thực nghiệm phù hợp phương pháp áp dụng toàn mẫu thực phẩm điều kiện thực tế đơn vị Vì vậy, lựa chọn quy trình phân tích phù hợp với điều kiện Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Quảng Ngãi để xác định đồng thời chất bảo quản nhóm benzoat sorbat thực phẩm lưu thông thị trường yêu cầu xuất phát từ thực tiễn Qua kết nghiên cứu nhiều tác giả, để định lượng đồng thời benzoat sorbat thực phẩm, phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao có nhiều ưu điểm vượt trội Phương pháp có độ nhạy, độ xác cao, thao tác đơn giản Trong đề tài lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao để nghiên cứu Hơn công tác quản lý, giám sát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm địa bàn tỉnh năm 2018 sau: - Công tác giám sát mối nguy hậu kiểm: Số mẫu lấy kiểm tra 186, 18 mẫu chả thịt, 08 mẫu chả cá, 02 mẫu bánh tráng mỏng, 04 mẫu hủ tiếu sợi… Kết 11 mẫu chả thịt có sử dụng chất bảo quản không công bố chất lượng sản phẩm, 01 mẫu chả tự công bố chất bảo quản Natri bezoat vượt quy định, 04 mẫu hủ tiếu sợi sử sụng chất bảo quản chưa công bố sản phẩm [7] - Năm 2018, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Quảng Ngãi,áp dụng quy trình định lượng riêng chất bảo quản natri benzoat 50 mẫu thực phẩm địa bàn tỉnh Quảng Ngãi C C R UT.L (gồm sản phẩm chả loại, cá bống chế biến, thịt bị khơ, sợi hủ tiếu), kết có 46/50 mẫu phát có sử dụng chất bảo quản natri D benzoat (chiếm 92% ), 10/50 mẫu (chiếm 20%) có hàm lượng vượt giới hạn cho phép Vấn đề đặt cần có cơng cụ kỹ thuật thuận lợi góp phần vào việc đánh giá tình trạng sử dụng benzoat sorbat làm chất bảo quản thực phẩm nhằm cung cấp số liệu cho quan chức để thực tốt công tác giám sát chất lượng thực phẩm địa bàn tỉnh nhà Vì lý trên, tơi thực đề tài “Xây dựng đánh giá quy trình phân tích benzoat sorbat thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình phân tích hàm lượng benzoat sorbat thực phẩm có độ xác cao - Đánh giá quy trình phân tích xây dựng (theo tiêu chuẩn AOAC thầm định phương pháp phân tích); từ đó, ứng dụng vào việc xác định hàm lượng benzoat sorbat số sản phẩm thực phẩm Đối tƣợng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu  Đối tượng nghiên cứu Các thông số đặc trưng phương pháp HPLC: Hệ số đối xứng, hệ số phân giải, cột phân tích, bước sóng, tốc độ dòng, thành phần tỷ lệ pha động - Các dung dịch chuẩn natri benzoat kali sorbat bảo quản theo thời gian C C R UT.L - Mẫu thực phẩm phục vụ cho nghiên cứu, bao gồm: D + mẫu tự tạo dùng để xây dựng thẩm định quy trình phân tích benzoat sorbat thực phẩm (được đặt mua theo yêu cầu kiểm chứng phịng thí nghiệm khơng có chất benzoat sorbat) bổ sung xác lượng chất chuẩn natri benzoat kali sorbat: Thực phẩm nhóm lỏng (N1): Nước yến Thực phẩm nhóm giàu đường (N2): Bánh Thực phẩm nhóm giàu chất xơ (N3): Quả sấy khơ Thực phẩm nhóm giàu protein, (N4): Chả thịt heo Thực phẩm nhóm giàu béo, (N5): Phơ mai + Các sản phẩm thực phẩm mua sở buôn bán địa bàn thành phố Quảng Ngãi (thông tin chi tiết mẫu thực phẩm xem phụ lục 6)  Phạm vi nghiên cứu - Xây dựng quy trình phân tích thực phịng thí nghiệm Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm tỉnh Quảng Ngãi - Phân tích số thực phẩm lấy thành phố Quảng Ngãi từ tháng 1/2020 đến tháng 5/2020 Phƣơng pháp nghiên cứu C C R UT.L - Xác định benzoat sorbat thực phẩm phương pháp HPLC D - Đánh giá lực quy trình phân tích benzoat sorbat thực phẩm theo tiêu chuẩn ARL 05 tiêu chuẩn AOAC - Xử lý số liệu thống kê phần mềm xử lý số liệu modde 5.0, minitab 17 (hãng Minitab Inc) bảng tính excel 2010 (của Microsoft) ngh  ho học thực ti n c đề tài nghiên cứu nghĩa khoa học - Đóng góp vào kho tài liệu thơng tin khoa học cơng cụ phân tích benzoat sorbat thực phẩm - Xây dựng hướng dẫn nội quy trình phân tích chất bảo quản nhóm benzoat sorbat thực phẩm áp dụng Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm tỉnh Quảng Ngãi  nghĩa thực tiễn đề tài - Đối với quan quản lý nhà nước, sản phẩm đề tài sở tham khảo để phục vụ công tác quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm địa bàn tỉnh - Đưa hạn dùng dung dịch chuẩn; từ mang lại lợi ích kinh tế cho đơn vị sử dụng quy trình phân tích xây dựng Bố cục c a luận văn Luận văn gồm chương mục sau: Đặt vấn đề C C R UT.L Chương 1: Tổng quan Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu D Chương 3: Kết thảo luận Kết luận Kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN 1.1 MỘT SỐ QUY ĐỊNH LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT BẢO QUẢN THỰC PHẨM Năm 2010, Bộ Y tế ban hành quy chuẩn quốc gia (QCVN 412:2010/BYT) phụ gia thực phẩm – chất bảo quản, quy định yêu cầu kỹ thuật quản lý chất lượng, vệ sinh an toàn chất bảo quản sử dụng với mục đích làm phụ gia thực phẩm [8] Thông tư 05/2018/TT-BYT ngày 05 tháng 04 năm 2018 Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành danh mục thực phẩm, phụ gia thực phẩm, chất hỗ trợ chế biến thực phẩm dụng cụ, vật liệu bao gói, chứa C C R UT.L đựng thực phẩm xác định mã số hàng hóa theo danh mục hàng hóa xuất khẩu, nhập Việt Nam [10] D Thông tư 24/2019/TT-BYT ngày 30/8/2019 Bộ trưởng Bộ Y tế quy định quản lý sử dụng phụ gia thực phẩm ban hành [11] 1.2 KHÁI QUÁT VỀ NHÓM CHẤT BẢO QUẢN BENZOAT VÀ SORBAT 1.2.1 Nhóm Benzoat 1.2.2 Nhóm Sorbat 1.3 MỘT SỐ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH CHẤT BẢO QUẢN NHÓM BENZOAT VÀ SORBAT TRONG THỰC PHẨM 1.3.1 Một số quy trình xác định benzoat sorbat nước kỹ thuật HPLC 1.3.2 Một số quy trình xác định benzoat sorbat kỹ thuật HPLC thường áp dụng Việt Nam 1.4 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC 1.4.1 Hệ thống bơm 1.4.2 Bộ phận tiêm mẫu 1.4.3 Cột phân tích (HPLC colum) chứa pha tĩnh 1.4.4 Pha động 1.4.5 Detector 1.4.6 Các thông số sắc ký lỏng hiệu cao C C R UT.L 1.5 TỔNG QUAN VỀ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH D 1.5.1 Tính tương thích hệ thống 1.5.2 Tính đặc hiệu (Specifility)/Tính chọn lọc 1.5.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 1.5.4 Độ (Trueness) hay gọi độ thu hồi 1.5.5 Độ xác (Precision) 1.5.6 Giới hạn phát (Limit of Detection – LOD) 1.5.7 Giới hạn định lượng (Limit of Quatitation – LOQ) 1.5.8 Độ không đảm bảo 10 + Ứng dụng quy trình xây dựng để xác định hàm lượng benzoat sorbat thực phẩm 2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1 Xây dựng quy trình phân tích định lượng benzoat sorbat thực phẩm 2.4.1.1 Đánh giá khả tương thích quy trình xác định benzoat sorbat thực phẩm công bố 2.4.1.2 Phương pháp xử lý mẫu 2.4.1.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Xác định bƣớc sóng đo benzo t sorb t C C R UT.L Bảng 2.1 Ma trận bố trí thí nghiệm D Các yếu tố Pha động Điều kiện thí nghiệm - Thành phần pha động MeOH : Muối acetat - Tỷ lệ pha động 10 : 90 Bước sóng λ = 227 nm; λ = 250 nm Tốc độ dòng ml/phút Nhiệt độ cột 300C Thể tích tiêm 20 µl Đánh giá kết quả: Dựa vào kết sắc ký đồ phổ UV-VIS, chọn bước sóng cho tín rõ nhất, chiều cao tương đối lớn có độ tinh khiết píc phù hợp 11 Thí nghiệm 2: Lựa chọn cột sắc ký Bảng 2.2 Ma trận bố trí thí nghiệm Điều kiện thí nghiệm Các yếu tố Loại cột Khảo sát cột, chất cột chứa Octadecyl Silane Octyl Silane, chiều dài cột hãng sản xuất cột khác Pha động - Thành phần MeOH : Muối acetat - Tỷ lệ (v/v) 10 : 90 Tốc độ dịng ml/phút Nhiệt độ cột 300C Thể tích tiêm C C R UT.L D Bước sóng 20 µl Chọn từ kết thí nghiệm Đánh giá kết quả: Đánh giá hệ số đối xứng hệ số phân giải píc benzoat sorbat, thời gian lưu hai pic chính, lựa chọn cột phân tích phù hợp Thí nghiệm 3: Xác định thành phần, nồng độ muối amoni acetat ph động tỷ lệ ph động Bảng 2.3 Ma trận bố trí thí nghiệm Các yếu tố Thành phần pha động gồm (MeOH – Dung dịch amoni Điều kiện thí nghiệm 12 acetat xM) - Nồng độ dung dịch amoni 0,005M; 0,01M; 0,02M; 0,03M acetat xM - Tỷ lệ pha động (v/v) (20 : 80); (10 : 90); (7 : 93); (5 : 95) Tốc độ dòng ml/phút Nhiệt độ cột 300C Thể tích tiêm 20 µl Bước sóng Từ kết thí nghiệm Cột sắc ký Từ kết thí nghiệm C C R UT.L Kết quả: Dựa vào kết sắc ký đồ để đánh giá hệ số đối xứng, hệ số phân giải, thời gian lưu hai pic benzoat sorbat, lựa D chọn nồng độ muối dung dịch tỷ lệ thích hợp Thí nghiệm 4: Xác định tốc độ dịng Thí nghiệm 5: Xác định điều kiện xử lý mẫu thử thực phẩm 2.4.2 Đánh giá lực quy trình phân tích xây dựng 2.4.2.1 Xác nhận giá trị sử dụng quy trình phân tích xây dựng 2.4.2.2 Xác định hạn dùng dung dịch chuẩn benzoat sorbat 13 Điều kiện thí nghiệm Các yếu tố Nhóm số liệu 1: Nồng độ benzoat: 9,4µg/ml; Hàm lượng benzoat tính 18,96µg/ml; 28,45µg/ml; 37,93µg/ml; theo chuẩn cũ 94,82µg/ml Hàm lượng Sorbat tính Nồng độ sorbat: 10,29 µg/ml; 20,58 µg/ml; 30,87 µg/ml; 41,16 µg/ml; theo chuẩn cũ 102,9 µg/ml Nhóm số liệu 2: Hàm lượng benzoat tính theo chuẩn Nồng độ natri benzoat 50 µg/ml Kali sorbat 97 µg/ml C C R UT.L Hàm lượng Sorbat tính theo chuẩn D Thời gian khảo sát Quy trình xử lý mẫu Tháng 4/2020 – 6/2020 Theo kết quy trình xử lý mẫu xây dựng Điều kiện sắc ký Theo kết điều kiện sắc ký xây dựng Đánh giá kết quả: - Dựa vào diện tích píc dung dịch chuẩn dung dịch thử xác định hàm lượng natri benzoat kali sorbat - Đánh giá khác biệt hai phương pháp có ý nghĩa hay khơng, mức ý nghĩa α = 5% thông qua hai dãy số liệu về hàm lượng natri benzoat kali sorbat 14 2.4.2.3 Ứng dụng quy trình phân tích xây dựng để phân tích mẫu thực phẩm mua ngồi thị trường 2.5 PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Số liệu thực nghiệm xử lý phần mềm Microsolt Excell - Số liệu thực nghiệm nội dung xác định quy trình xử lý mẫu phân tích phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm phần mềm Modde 5.0 - Số liệu thực nghiệm kết xác định hạn dùng dung dịch chuẩn benzoat sorbat xử lý phần mềm thống kê Minitab 17 C C R UT.L - Mức ý nghĩa α = 0,05 D 15 CHƢƠNG 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢNG BENZOAT VÀ SORBAT TRONG THỰC PHẨM 3.1.1 Đánh giá khả tương thích quy trình xác định benzoat sorbat thực phẩm công bố Ba quy trình phân tích có điều kiện phân tích tương đối phù hợp với phịng thí nghiệm đơn vị để khảo sát Kết cho thấy: - Thời gian xuất pic nhanh, cịn dính nhiều pic phụ phân tích mẫu thực phẩm C C R UT.L - Tín hiệu pic khơng cân đối, chân píc bị kéo - Bên cạnh đánh giá kết hệ số đối xứng Nhận xét D Theo yêu cầu tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam [25] tiêu chuẩn AOAC [26], phép thử đạt yêu cầu kết số đĩa lý thuyết ≥ 2000 hệ số đối xứng (As) phải khoảng 0,8 ≤ As ≤ 1,2 Do vậy, ba quy trình phân tích chưa tương thích điều kiện đơn vị phân tích đồng thời benzoat sorbat mẫu thực phẩm 3.1.2 Xây dựng điều kiện sắc ký cho quy trình phân tích benzoat sorbat thực phẩm 3.1.2.1 Xác định bước sóng phát cho chất phân tích với detector PDA 16 3.1.2.2 Ảnh hưởng cột sắc ký lỏng đến tín hiệu píc benzoat sorbat Trong q trình nghiên cứu thực nghiệm lâu dài, kết luận: Cột Purospher Star RP-8e (5μm; 250 x 4.6mm) thích hợp khả đáp ứng pic, khả tách cột tốt sử dụng nghiên cứu quy trình định lượng benzoat sorbat thực phẩm 3.1.2.3 Ảnh hưởng nồng độ muối, tỷ lệ pha động đến hệ số đối xứng khả tách píc benzoat sorbat  Kết ảnh hưởng nồng độ muối NH4COOCH3 pha C C R UT.L động đến cân đối khả tách píc benzoat sorbat Kết D - Thành phần pha động gồm muối CH3COONH4 0,02M – MeOH - Điều phù hợp với tính chất phân cực benzoat sorbat - Muối CH3COONH4 0,02M có pH khoảng nên ổn định chạy máy sắc ký lỏng Kết luận: Pha động gồm dung dịch muối NH4COOCH3 0,02M MeOH phù hợp để tiến hành phân tích định tính, định lượng benzoat sorbat thực phẩm  Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi pha động đến cân đối khả tách píc benzoat sorbat 17 Kết luận: Thành phần pha động gồm NH4COOCH3 0,02M MeOH (93 : 7), (v/v) phù hợp để định tính, định lượng đồng thời benzoat sorbat thực phẩm phương pháp HPLC  Ảnh hưởng tốc độ pha động đến cân đối khả tách píc benzoat sorbat Kết lựa chọn tốc độ dòng 1,0 ml/phút cho trình nghiên cứu Ở tốc độ 1,0 ml/phút píc benzoat sorbat có hệ số đối xứng 1,00 0,96 tốt đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam [25] tiêu chuẩn AOAC [26] Thời gian lưu chất phân tích khơng q dài, áp suất bơm phù hợp cho trình chạy sắc ký C C R UT.L Kết luận chung: Kết khảo sát lựa chọn điều kiện cho trình chạy sắc ký D HPLC để định lượng đồng thời nhóm benzoat sorbat với đầu dò PDA sau: - Cột tách: Purospher RP-8e (5μm; 250 x 4,6mm) - Hệ pha động: MeOH : NH4COOCH3 0,02M (7:93), (v/v) - Bước sóng: 230nm benzoat 250nm sorbat - Thể tích tiêm: 20µl - Tốc độ dịng: 1,0ml/phút - Nhiệt độ cột: Lựa chọn 30oC 3.1.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu thực phẩm dùng phân tích benzoat sorbat 18 3.1.3.1 Tối ưu hóa điều kiện chiết mẫu benzoat sorbat mẫu tự tạo Kết điều kiện tỷ lệ dung môi chiết xuất, thời gian nhiệt độ thủy phân nhằm chiết xuất hàm lượng natri benzoat thu cao - Tại giá trị X1 = 24,48 (Dung mơi MeOH %) có nghĩa dung môi chiết mẫu gồm MeOH - Nước tỷ lệ (24 : 76), v/v; - Giá trị X2 = 53,74 (Nhiệt độ chiết) xác định nhiệt độ thủy phân đạt 540C; - Giá trị X3 = 45,22 (thời gian chiết) hiểu thời gian siêu âm: 45 phút C C R UT.L - Với điều kiện hàm lượng natri benzoat chiết xuất có tỷ lệ thu hồi 100,3% Hàm lượng axit sorbic chiết xuất có tỷ lệ thu hồi 100,0% D Như vậy: Điều kiện phù hợp để chiết xuất hàm lượng natri benzoat axit sorbic cao MeOH - Nước tỷ lệ (24 : 76), v/v; Nhiệt độ siêu âm: 540C; Thời gian siêu âm: 45 phút 3.1.3.2 Đánh giá quy trình xử lý mẫu thiết lập Tỷ lệ thu hồi hàm lượng chuẩn natri benzoat mẫu tự tạo từ 98,9% đến 100,2% tỷ lệ thu hồi axit sorbic từ 99,5 % đến 100,9%; điều cho thấy hiệu suất chiết natri benzoat axit sorbic mẫu thực phẩm cao, thu hồi gần hoàn toàn hàm lượng natri benzoat axit sorbic chuẩn thêm vào nễn mẫu thực phẩm 3.2 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢNG NHĨM BENZOAT VÀ SORBAT 19 3.2.1 Xác nhận giá trị sử dụng quy trình phân tích 3.2.1.1 Tính tương thích hệ thống 3.2.1.2 Đánh giá Độ đặc hiệu (Tính đặc hiệu) 3.2.1.3 Đánh giá khoảng nồng độ tuyến tính 3.2.1.4 Đánh giá Độ chụm (Độ lặp lại, độ tái lặp nội hay cịn gọi độ xác trung gian) 3.2.1.5 Độ (độ thu hồi) Nồng độ phân tích Thơng số thẩm định Mức thêm vào Mức thêm vào Mức thêm vào 50% 100% 200% C C R T.L DU Độ thu hồi: 96,7 -106,1% 96,4 – 103,6% 96,3-103,7% - Benzoat: 95,0 – 103,6% 96,2 – 105,4% 96,4 – 105,1 - Sorbat: Yêu cầu Từ 90%-107% Từ 95%-105% - Tỷ lệ thu hồi mẫu mức nồng độ tương đối tốt Như quy trình phân tích xây dựng để định tính, định lượng đồng thời benzoat sorbat thể độ lặp lại, độ tốt 3.2.1.6 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 3.2.1.7 Đánh giá độ không đảm bảo đo (KĐBĐ) 3.2.2 Xác định hạn dùng dung dịch chuẩn (độ ổn định dung dịch chuẩn) 20 Các yếu tố Hàm lƣợng % Hàm lƣợng % (Benzoat) (Sorbat) (a) Hàm lượng tính theo 83,087 ± 0,299 (a) 99,369 ± 0,24 chuẩn cũ (a) Hàm lượng tính theo (a) 83,323 ± 0,216 99,459 ± 0,242 P-Value = 0,093 P-Value = 0,468 chuẩn Kết luận: Dung dịch chuẩn chứa natri benzoat kali sorbat ổn định khơng có tượng thay đổi nồng độ thời gian nghiên C C R UT.L cứu từ 31/3/2020 đến 2/6/2020 D Đây nội dung nghiên cứu có tính so với nghiên cứu cơng bố trước quy trình định tính, định lượng benzoat sorbat thực phẩm 3.2.3 Áp dụng quy trình phân tích benzoat sorbat xây dựng để kiểm tra mẫu thị trường Kết phân tích 20 lượt mẫu thực phẩm lấy chợ tỉnh Quảng Ngãi - Phát có mẫu khảo sát khơng đạt hàm lượng benzoat - Có 7/20 mẫu thực phẩm có sử dụng hai nhóm chất bảo quản benzoat sorbat - Có 5/20 mẫu thực phẩm có sử dụng chất bảo quản nhóm benzoat 21 KẾT LUẬN Kết nghiên cứu đạt sau: Xây dựng quy trình phân tích - Điều kiện phân tích sắc ký + Cột: Purospher RP - 8e (5μm; 250 x 4,6mm) + Hệ pha động: MeOH - NH4COOCH3 0,02M (7:93), (v/v) + Bước sóng: 230nm benzoat 250nm sorbat + Thể tích tiêm: 20µl + Tốc độ dòng: 1,0ml/phút C C R UT.L + Nhiệt độ cột: 30oC D - Đề xuất quy trình xử lý mẫu thực phẩm để định lượng benzoat sorbat gồm thông số ký thuật sau: + Dung môi chiết mẫu gồm MeOH - H2O (24:76), (v/v) + Thời gian chiết mẫu (thời gian chiết siêu âm): 45 phút + Nhiệt độ chiết mẫu: 540C Đánh giá quy trình phân tích - Xác nhận giá trị sử dụng quy trình phân tích 22 Thơng số đánh giá Benzoat Sorbat - Thời gian lưu (%RSD) 0,30 0,34 - Diện tích pic (%RSD) 0,34 0,23 - Hệ số đối xứng 1,01 0,97 Tính tương thích hệ thống (n=6): - Độ phân giải Tính đặc hiệu 8,77 - Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng không xuất pic khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu C C R UT.L chất chuẩn D - Sắc ký đồ dung dịch chuẩn xuất pic rõ ràng, thời gian lưu 6,873 phút benzoat 9,190 phút sorbat - Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn xuất pic rõ ràng có thời gian lưu benzoat sorbat 6,871 phút 9,088 phút Khoảng tuyến tính 0,83 - 166,25 0,52 - 207,00 (µg/ml) (µg/ml) R2 = R2 = 0,9995 23 Thông số đánh giá Benzoat Sorbat Độ lặp lại %RSDMax: 1,08% Độ tái lập %PRSDMax: 2,0% %PRSDMax: 1,2% Độ (độ thu hồi) 96% - 106% 95% - 105% Giới hạn phát LOD: 0,88 µg/ml LOD: 0,40 µg/ml LOQ: 1,10 µg/ml LOQ: 0,60µg/ml %RSDMax: 0,41% (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Độ không đảm bảo đo mở U% (k=2; P=95%): U% (k=2; P=95%): rộng C C R L 1,2 – 2,0 1,5 – 3,1 DUT Xác định hạn dùng c a dung dịch chuẩn Kết nghiên cứu có sở ban đầu khẳng định thời gian ổn định không thay đổi nồng độ dung dịch chuẩn thời gian tháng Điều mang lại nhiều lợi ích mặt kinh tế thời gian cho người sử dụng Có thể nói nội dung nghiên cứu thể điểm so với nghiên cứu cơng bố trước Ứng dụng quy trình để xác định hàm lƣợng benzoat sorbat thực phẩm đƣợc mua chợ tỉnh Quảng Ngãi Áp dụng quy trình phân tích để xác định hàm lượng nhóm benzoat nhóm sorbat sản phẩm thực phẩm lấy thị trường, phát 01 mẫu không đạt giới hạn benzoat (tính theo hàm lượng acid benzoic quy định thông tư 24/2019/TT-BYT ngày 16/10/2019) 24 KIẾN NGHỊ Thông qua kết nghiên cứu đề tài, xin đề xuất số giải pháp sau: - Sau nghiên cứu hoàn thành đề nghị Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm tỉnh Quảng Ngãi cần xây dựng hướng dẫn phương pháp nội quy trình định lượng benzoat sorbat thực phẩm, phổ biến cho nhân viên nơi làm việc - Cần khảo sát hạn dùng dung dịch chuẩn thời gian dài để có hạn dùng lâu - Cần triển khai rộng việc xác định hàm lượng nhóm benzoat nhóm sorbat sản phẩm thực phẩm thị C C R UT.L trường để có kết luận xác việc lạm dụng chất bảo quản thực phẩm có biện pháp quản lý chất lượng thực phẩm phù hợp D ... sorbat thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao? ?? Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình phân tích hàm lượng benzoat sorbat thực phẩm có độ xác cao - Đánh giá quy trình phân tích xây dựng (theo... QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢNG BENZOAT VÀ SORBAT TRONG THỰC PHẨM 3.1.1 Đánh giá khả tương thích quy trình xác định benzoat sorbat thực phẩm cơng bố Ba quy trình phân. .. vậy, ba quy trình phân tích chưa tương thích điều kiện đơn vị phân tích đồng thời benzoat sorbat mẫu thực phẩm 3.1.2 Xây dựng điều kiện sắc ký cho quy trình phân tích benzoat sorbat thực phẩm 3.1.2.1