Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng phương pháp định lượng đồng thời metformin và sitagliptin (SG) trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đối tượng và phương pháp: tiến hành phân tích “Viên nén bao phim Janumet” do Công ty Merck Sharp and Dohme sản xuất trên hệ thống HPLC với cột: RP8 (250 x 4,6 mm, 5 µm), bước sóng 265 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, pha động là hỗn hợp methanol-nước chứa 0,3% triethylamin 0,1% (60:40).
Trang 1NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN VÀ SITAGLIPTIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Nguyễn Ngọc Nhã Thảo*; Phạm Thị Mỹ Lệ* Phạm Thành Suôl*; Nguyễn Thị Ngọc Vân*
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng đồng thời metformin và sitagliptin (SG) trong
chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Đối tượng và phương pháp: tiến hành phân
tích “Viên nén bao phim Janumet” do Công ty Merck Sharp and Dohme sản xuất trên hệ thống HPLC với cột: RP8 (250 x 4,6 mm, 5 µm), bước sóng 265 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích
tiêm 20 µl, pha động là hỗn hợp methanol-nước chứa 0,3% triethylamin 0,1% (60:40) Kết quả:
phương pháp định lượng đã xây dựng đảm bảo tính đặc hiệu, tính tương thích, tính tuyến tính,
độ đúng và độ lặp lại Áp dụng xác định hàm lượng metformin và SG trên 3 lô “Viên nén bao
phim Janumet” Kết luận: đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời metformin và SG
đảm bảo đơn giản, tiết kiệm thời gian, không sử dụng hệ đệm vô cơ như phosphat gây đóng muối hệ thống sắc ký và giảm tuổi thọ của thiết bị
* Từ khóa: Metformin hydrochlorid; Sitagliptin; HPLC; Định lượng
Study of Simultaneous Measurement of Metformine and Sitagliptin
by HPLC Method
Summary
Objectives: To establish a reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) method for simultaneous measurement of metformine hydroclorid (MH) and sitagliptin (SG) in film coated tablet Subjects and methods: Film coated Janumet tablet was analyzed on a Phenomenex Luna RP - C8 column (250 x 4.6 mm, 5 µm) with mobile phase in isocratic mode consisting of methanol - water 60:40 v/v containing 0.3% v/v triethylamine and was adjusted to the pH of 9.5 with formic acid with DAD detector highly selective to HPLC system The flow rate was 1 mL min -1 and the photodiod - array detection wave length was 265 nm Result: This method ensures the specificity, system suitability, linearity, accuracy and repeatability The proposed method was successfully applied for the analysis of MH and SG in film coated Janumet tablet Conclusion: A simple, rapid, and non-inorganic buffer HPLC method for simultaneous determination of MH and SG phosphate, in tablet dosage form has been developed and validated
* Key words: Metformine hydrochloride; Sitagliptin; HPLC; Measurement
* Trường Đại học Y Dược Cần Thơ
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Ngọc Vân (ntnvan@ctump.edu.vn)
Ngày nhận bài: 24/06/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 01/09/2016
Ngày bài báo được đăng: 16/09/2016
Trang 2ĐẶT VẤN ĐỀ
Metformin hydroclorid (MH) là thuốc
điều trị đái tháo đường, dùng đường uống,
ưu tiên được lựa chọn trong điều trị khởi
đầu đái tháo đường týp 2 MH giúp hạ
đường huyết thông qua cơ chế giảm tổng
hợp glucose ở gan Sitagliptin phosphat
monohydrat là thuốc điều trị đái tháo
đường týp 2 thuộc nhóm ức chế DPP-4
(dipeptidyl peptidase-4), có tác dụng giảm
phân hủy GLP-1 và tăng bài tiết insulin,
giảm tiết glucagon từ tuyến tụy, dẫn đến
giảm đường huyết Việc kết hợp 2 thành
phần này trong chế phẩm đã có trên thị
trường ở dạng viên bao phim phóng thích
tức thời, dạng phóng thích kéo dài này
vẫn chưa có ở Việt Nam Trên thế giới,
sử dụng các phương pháp để định lượng
đồng thời hai hoạt chất trên như quang
phổ tử ngoại khả kiến, sắc ký lỏng hiệu
năng cao; sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
và điện di mao quản… [1, 2, 4, 8] Tuy
nhiên, các phương pháp này sử dụng hệ
pha động phức tạp, thời gian phân tích
dài [5, 6, 7, 9] Tại Việt Nam, chưa có đề
tài nào nghiên cứu định lượng đồng thời
MH và SG bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) Do đó, nghiên
cứu này thực hiện với mục tiêu: Xây dựng
và thẩm định quy trình định lượng đồng
thời MH và SG trong chế phẩm bằng
phương pháp HPLC-DAD với hệ pha
động đơn giản, thời gian phân tích ngắn
NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Nguyên liệu và thiết bị
* Nguyên liệu:
- Mẫu thử
Chế phẩm thử: viên nén bao phim
Janumet® (Công ty Merck Sharp và
Dohme) chứa MH 500 mg và SG 50 mg
Số đăng ký: VN1-694-12 Số lô: J001206
- Hóa chất - dung môi
+ Chất chuẩn đối chiếu: MH có hàm lượng 99,54% (tính trên chế phẩm nguyên trạng), số kiểm soát: QT 168 050413 do Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP.HCM cung cấp SG phosphat monohydrat có hàm lượng 99,15% (tính trên chế phẩm nguyên trạng, số kiểm soát): WS/STP
13012, do Công ty Glenmark Generics
Ltd., Ấn Độ cung cấp
+ Dung môi: methanol (MeOH) đạt tiêu
chuẩn dùng cho HPLC (Baker, Mỹ) và axít formic, triethylamin dùng trong phân tích kiểm nghiệm (Merck, Đức)
- Thiết bị
Hệ thống HPLC Hitachi L-2000 với đầu
dò dãy diod quang Hitachi L-2455, bể siêu âm Elmasoonic S70H, cân phân tích ABT 220-5DM, máy đo pH HANNA
pH 211
2 Phương pháp nghiên cứu
* Chuẩn bị dung dịch:
- Dung dịch chuẩn gốc:
+ Dung dịch MET chuẩn gốc 2 mg/ml
(dung dịch C1): cân chính xác 50 mg MET chuẩn cho vào bình định mức 25 ml, hòa tan với vài ml methanol, bổ sung vừa
đủ với methanol, lắc đều
+ Dung dịch SIT chuẩn gốc 200 µg/ml (dung dịch C2): cân chính xác 12,85 mg SIT chuẩn (tương ứng 10 mg SIT dạng base) cho vào bình định mức 50 ml, hòa tan với vài ml methanol, bổ sung vừa đủ
với methanol, lắc đều
Trang 3- Dung dịch chuẩn định lượng: hút
chính xác 5 ml dung dịch C1 và 5 ml dung
dịch C2 vào bình định mức 100 ml, bổ
sung vừa đủ với pha động, lọc qua màng
lọc 0,45 µm, được dung dịch chuẩn làm
việc chứa MH 100 µg/ml và SG 10 µg/ml
- Dung dịch thử: cân 20 viên, xác định
khối lượng trung bình viên, cho vào cối
nghiền thành bột mịn Cân chính xác một
lượng bột tương ứng 100 mg MET và 10
mg SIT cho vào bình định mức dung tích
50 ml Cho vào bình khoảng 30 ml
methanol, siêu âm trong 15 phút Bổ sung
vừa đủ với methanol, lắc đều Hỗn hợp
chứa trong bình được đem quay ly tâm
với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 5 phút
Lấy dung dịch lớp trên Hút chính xác
5 ml dung dịch cho vào bình định mức
100 ml, bổ sung vừa đủ bằng pha động
Lọc qua màng lọc 0,45 µm
* Điều kiện sắc ký:
- Hệ thống máy HPLC Hitachi L-2000,
DAD L-2455
- Pha tĩnh: cột Phenomenex Luna
RP-C8 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm, 110 Å)
Pha động: hỗn hợp MeOH:đệm (60:40,
tt/tt), dung dịch đệm là TEA 0,3%, pH 9,5
điều chỉnh bằng axít formic
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
- Bước sóng phát hiện: 265 nm
* Thẩm định quy trình định lượng:
Tiến hành khảo sát tính phù hợp hệ
thống và thẩm định quy trình định lượng
theo tiêu chuẩn của ICH [3] Đánh giá 5
chỉ tiêu của một quy trình định lượng bao
gồm: tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính và miền giá trị, độ chính xác, độ đúng
Ứng dụng quy trình định lượng trên để định lượng đồng thời MH và SG trong 3 lô chế phẩm nghiên cứu
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1 Kết quả khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký
Thực hiện sắc ký hỗn hợp 2 chất với
hệ pha động gồm 2 thành phần với tỷ lệ thay đổi của MeOH từ 90 - 40% (∆C = 5%), tốc độ dòng 1 ml/phút Dựa vào cấu trúc hóa học của hai chất phân tích, MH và
SG đều là những chất phân cực, đồng thời tham khảo một số công trình đã công
bố [1, 2, 4, 5], kỹ thuật sắc ký pha đảo với
hệ dung môi phân cực đã áp dụng Trong quá trình thực nghiệm, đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách tính chọn lọc của phương pháp như pH và tỷ
lệ dung môi pha động Cho thêm TEA vào pha động nhằm làm giảm hệ số bất đối, giảm hiện tượng kéo đuôi của píc MH Ghi phổ hấp thụ UV trong khoảng 200
- 400 nm Tại thời gian lưu của píc MH và
SG trên sắc ký đồ thu được, kết quả cho thấy: cực đại hấp thụ của MH 235 nm, của SG 265 nm Nhằm ưu tiên định lượng hoạt chất có hàm lượng thấp trong chế phẩm, nên bước sóng chọn để phân tích đồng thời MET và SIT là 265 nm
Từ kết quả khảo sát bằng thực nghiệm, chúng tôi lựa chọn điều kiện sắc
ký để định lượng đồng thời MH và SG như trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu
Trang 40
2
4
6
8
0 2 4 6 8
Hình 1: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa MH 100 µg/ml và SG 10 µg/ml
Chương trình sắc ký trên tách được píc MH và SG khỏi píc dung môi và các píc tạp phân hủy do tác nhân nhiệt, ẩm, axít base, oxy hóa Píc thu được có hình dáng cân đối, gọn; thời gian phân tích < 10 phút Vì vậy, điều kiện sắc ký đạt yêu cầu phân tích
2 Thẩm định phương pháp định lượng
- Tính phù hợp hệ thống:
Tính phù hợp hệ thống được xác định bằng cách tiêm 6 lần liên tiếp dung dịch chuẩn
Bảng 1: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của phương pháp trên mẫu chuẩn
(n = 6)
thuyết)
RSD các thông số sắc ký của chất phân tích trong mẫu chuẩn đều < 2%, độ phân giải giữa píc MH và SG > 1,5, hệ số đối xứng của cả 2 píc đều nằm trong khoảng 0,8 - 1,5 Như vậy, quy trình định lượng đồng thời MH và SG đạt tính phù hợp của hệ thống
- Tính đặc hiệu:
Kết quả khảo sát cho thấy các píc trong mẫu thử có thời gian lưu trùng với thời gian lưu píc trong mẫu chuẩn Khi thêm chuẩn vào mẫu thử chiều cao và diện tích píc tăng lên ở các píc có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của píc trong mẫu chuẩn Điều đó chứng tỏ quy trình phân tích đúng hoạt chất là MH và SG
Metformin HCl
Sitagliptin
Trang 5Hình 2: Sắc ký đồ mẫu pha động (1), mẫu trắng B1 (2), mẫu chuẩn (3), mẫu thử (4),
mẫu thử thêm chuẩn (5)
Hình 3: Sắc ký đồ mẫu thử (1), mẫu trắng B2 (2), mẫu thử phân hủy trong NaOH 0,1N
sau 36 giờ (3), mẫu trắng B3 (4), mẫu thử phân hủy trong HCl 0,1N sau 36 giờ (5)
Metformin HCl
Metformin HCl
Metformin HCl
Sitagliptin
Sitagliptin
Sitagliptin
Sitagliptin
Sitagliptin
Sitagliptin
Metformin HCl
Metformin HCl
Metformin HCl
Trang 6Hình 4: Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của MH và SG trong mẫu chuẩn và thử [A]: phổ
UV-Vis tại thời gian lưu của MH trong mẫu chuẩn (b) và thử (a); [B]: phổ UV-Vis tại
thời gian lưu của SG trong mẫu chuẩn (c) và thử (d)
Ở các píc trong mẫu pha động, dung
môi pha mẫu không trùng với 2 píc hoạt
chất Bên cạnh đó, qua việc khảo sát một
số tác nhân như axít, kiềm, kết quả cho
thấy 2 píc hoạt chất vẫn tách khỏi các píc
tạp phân hủy Trong các mẫu phân hủy
này, MH và SG vẫn tách hoàn toàn Phổ
UV-Vis tại thời gian lưu của píc MH và SG
trong các mẫu đều giống nhau (hình 4)
Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết
cho thấy píc MH và SG trong các mẫu
đều > 99% (theo phổ UV-Vis) Như vậy, quy trình có tính chọn lọc
- Khoảng tuyến tính, độ chính xác và
độ đúng:
Khoảng tuyến tính của hai chất được xây dựng trong vùng nồng độ 20 - 400 µg/ml cho MH, khoảng 2 - 40 µg/ml cho
SG Xây dựng trên 6 điểm nồng độ, ứng với mỗi nồng độ, chuẩn bị 3 dung dịch chuẩn độc lập và tính giá trị trung bình
Trang 7Đánh giá độ chính xác của phương
pháp dựa vào khảo sát độ lặp lại trong
ngày (tiến hành trên 6 mẫu thử khác
nhau) và độ chính xác trung gian (tiến
hành trong trong 3 ngày liên tiếp)
Xác định độ đúng bằng phương pháp
thêm chuẩn, xác định giá trị phần trăm tìm
lại Thực hiện ở ba mức nồng độ khác
nhau, mỗi mức nồng độ tiến hành 3 mẫu
thử riêng biệt
Bảng 2: Kết quả khảo sát khoảng
tuyến tính, độ chính xác và độ đúng
Phương trình hồi quy y = 1650 x y = 9494 x
Khoảng tuyến tính
Độ chính xác
(RSD%)
- Độ lặp lại (n = 6)
- Độ chính xác trung
gian (n = 3)
0,59 0,68
0,86 0,78
Độ đúng (n = 9)
- Tỷ lệ hồi phục (%)
- RSD
99,7 - 100,7 0,9
99,7 - 101 1,3
Kết quả thống kê cho thấy quy trình
phân tích có khoảng tuyến tính rộng với
giá trị của hệ số tương quan cao, đạt yêu
cầu về độ chính xác, độ đúng và có tính
chọn lọc Do vậy, quy trình định lượng đạt
các yêu cầu thẩm định theo hướng dẫn
của ICH [3]
3 Ứng dụng quy trình định lượng
trên để định lượng đồng thời MH và
SG trong 3 lô chế phẩm nghiên cứu
Bảng 3: Kết quả định lượng MH và SG
trong viên nén bao phim Janumet® 500
mg/50 mg của Công ty Merck Sharp và
Dohme (Số đăng ký: VN1-694-12) (n = 6)
Lô Hàm lượng (mg/viên) Hàm lượng so với nhãn (%) RSD (%)
1 MH: 515,04 SG: 48,25
103 96,5
0,68 0,68
SG: 49,63
102,6 99,3
0,78 0,80
SG: 48
102
96
0,60 0,50
Hàm lượng MH và SG trong 3 lô viên nén bao phim Janumet 500 mg/50 mg khảo sát đều nằm trong khoảng 90,0 - 110,0% so với hàm lượng ghi trên nhãn
BẢN LUẬN
Hiện tại trong DĐVN IV cũng như Dược điển Mỹ, Anh chỉ có các chuyên luận riêng lẻ của MH và SG Đã công bố một số nghiên cứu định lượng đồng thời
MH và SG So với nghiên cứu của Ramalingam Peraman và CS (2013), điểm giống là cùng sử dụng pha tĩnh C8
và phân tích ở bước sóng tương tự, nhưng khác nhau về thành phần cũng như tỷ lệ pha động Nghiên cứu của chúng tôi đã sử dụng pha động là hỗn hợp MeOH và dung dịch chứa triethylamin 0,2%, axít n-heptansulfonic 0,2% được điều chỉnh bằng axít orthophosphoric đến pH 3, tỷ lệ (45:55) Bước sóng phân tích 267 nm và thời gian phân tích khoảng 22 phút [5] Vì vậy, kết quả cho thấy, điều kiện đã khảo sát có ưu điểm hơn do thời gian phân tích ngắn (khoảng 7 phút), tiết kiệm được dung môi, hóa chất So với các nghiên cứu khác, điều kiện tối ưu khảo sát được không dùng các hệ đệm như đệm phosphat, đệm amoni acetat [6, 7, 9] Các hệ đệm
vô cơ này nếu sử dụng thường xuyên và không rửa hệ thống sắc ký đúng quy cách
Trang 8có thể gây đọng muối trong hệ thống, làm
hư hỏng thiết bị, gây sai lệch kết quả
phân tích
KẾT LUẬN
Bằng phương pháp HPLC với đầu dò
dãy diod quang, chúng tôi đã xây dựng
được quy trình định lượng đồng thời MH
và SG phosphat monohydrat trong viên
nén Quy trình có tính chọn lọc, đơn giản,
thời gian phân tích ngắn (< 10 phút),
không sử dụng hệ đệm vô cơ như
phosphat gây đóng muối trong hệ thống
sắc ký, gây giảm tuổi thọ của thiết bị
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Darshana K Modi, Punit B Parejiya,
Bhavesh H Patel A simple and sensitive
HPTLC method for simultaneous determination
of metformin hydrochloride and sitagliptin
phosphate in tablet dosage form Hindawi
Publishing Corporation Journal of Chemistry
2013, pp.1-4
2 Govindasamy Jeyabalan, Narendra Nyola
Simultaneuos estimation of SG phosphate
monohydrate and MH in bulk and
pharmaceutical formulation by RP-HPLC
Journal of Pharmacy and Education Research
2012, 3 (2), pp.25-28
3 ICH Validation of analytical procedures:
Text and Methodology Q2R1 2005
4 MaMdouhR Rezk, Safa’aM Riad, GhadaY
MahMoud, and abdelaziz el baYouMi abdel
aleeM Simultaneous determination of SG and metformine in their pharmaceutical formulation Journal of AOAC International
2013, 96 (2), pp.301-306
5 Ramalingam Peraman, Chandra Sekhar Gowra, Y Padmanabha Reddy, Krishna Karthik Peruru Stability-Indicating RP-HPLC method
for simultaneous determination of MH and SG phosphate in dosage forms Chromatographia
2013, 76, pp.1153-1162
6 Ramzia I El-Bagary, Ehab F Elkady, Bassam M Ayou Liquid chromatographic
determination of SG either alone or in ternary mixture with metformin and SG degradation product Talanta 2011, 85, pp.673-680
7 Sudheer Kumar Sapavat, V Mohan Goud, JVC Sharma Method development and
validation for simultaneous estimation of MH and SG by RP-HPLC in tablet dosage form International Journal of Pharmacy and Analytial Reasearch 2014, 3 (1), pp.126-134
8 SL Bonde, RP Bhadane, Avinash Gaikwad, Deepak Katale, Sumit Gavali AS Narendiran:
A simple and sensitive method for determination
of metformin and SG in human plasma using liquid chromatography and tandem mass spectrometry International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 2013, 5 (3), pp.463-470
9 T Raja, A Lakshmana Rao Validated
RP-HPLC method for simultaneous estimation
of MH and SG phosphate in bulk and pharmaceutical formulation International Journal
of Pharmaceutical, Chemical and Biological Sciences 2012, 2 (4), pp.696-702