Nghiên cứu định lượng đồng thời metformin và sitagliptin trong chế phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng phương pháp định lượng đồng thời metformin và sitagliptin (SG) trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đối tượng và phương pháp: tiến hành phân tích “Viên nén bao phim Janumet” do Công ty Merck Sharp and Dohme sản xuất trên hệ thống HPLC với cột: RP8 (250 x 4,6 mm, 5 µm), bước sóng 265 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, pha động là hỗn hợp methanol-nước chứa 0,3% triethylamin 0,1% (60:40).

Tạp chí y - dợc học quân số 8-2016 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN VÀ SITAGLIPTIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Ngọc Nhã Thảo*; Phạm Thị Mỹ Lệ* Phạm Thành Sl*; Nguyễn Thị Ngọc Vân* TĨM TẮT Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng đồng thời metformin sitagliptin (SG) chế phẩm sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Đối tượng phương pháp: tiến hành phân tích “Viên nén bao phim Janumet” Cơng ty Merck Sharp and Dohme sản xuất hệ thống HPLC với cột: RP8 (250 x 4,6 mm, µm), bước sóng 265 nm, tốc độ dòng ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, pha động hỗn hợp methanol-nước chứa 0,3% triethylamin 0,1% (60:40) Kết quả: phương pháp định lượng xây dựng đảm bảo tính đặc hiệu, tính tương thích, tính tuyến tính, độ độ lặp lại Áp dụng xác định hàm lượng metformin SG lô “Viên nén bao phim Janumet” Kết luận: xây dựng quy trình định lượng đồng thời metformin SG đảm bảo đơn giản, tiết kiệm thời gian, không sử dụng hệ đệm vô phosphat gây đóng muối hệ thống sắc ký giảm tuổi thọ thiết bị * Từ khóa: Metformin hydrochlorid; Sitagliptin; HPLC; Định lượng Study of Simultaneous Measurement of Metformine and Sitagliptin by HPLC Method Summary Objectives: To establish a reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) method for simultaneous measurement of metformine hydroclorid (MH) and sitagliptin (SG) in film coated tablet Subjects and methods: Film coated Janumet tablet was analyzed on a Phenomenex Luna RP - C8 column (250 x 4.6 mm, µm) with mobile phase in isocratic mode consisting of methanol - water 60:40 v/v containing 0.3% v/v triethylamine and was adjusted to the pH of 9.5 with formic acid with DAD detector highly selective to HPLC system The flow rate was mL min-1 and the photodiod - array detection wave length was 265 nm Result: This method ensures the specificity, system suitability, linearity, accuracy and repeatability The proposed method was successfully applied for the analysis of MH and SG in film coated Janumet tablet Conclusion: A simple, rapid, and non-inorganic buffer HPLC method for simultaneous determination of MH and SG phosphate, in tablet dosage form has been developed and validated * Key words: Metformine hydrochloride; Sitagliptin; HPLC; Measurement * Trường Đại học Y Dược Cần Thơ Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Ngọc Vân (ntnvan@ctump.edu.vn) Ngày nhận bài: 24/06/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 01/09/2016 Ngày báo đăng: 16/09/2016 21 T¹p chÝ y - dợc học quân số 8-2016 T VN Metformin hydroclorid (MH) thuốc điều trị đái tháo đường, dùng đường uống, ưu tiên lựa chọn điều trị khởi đầu đái tháo đường týp MH giúp hạ đường huyết thông qua chế giảm tổng hợp glucose gan Sitagliptin phosphat monohydrat thuốc điều trị đái tháo đường týp thuộc nhóm ức chế DPP-4 (dipeptidyl peptidase-4), có tác dụng giảm phân hủy GLP-1 tăng tiết insulin, giảm tiết glucagon từ tuyến tụy, dẫn đến giảm đường huyết Việc kết hợp thành phần chế phẩm có thị trường dạng viên bao phim phóng thích tức thời, dạng phóng thích kéo dài chưa có Việt Nam Trên giới, sử dụng phương pháp để định lượng đồng thời hai hoạt chất quang phổ tử ngoại khả kiến, sắc ký lỏng hiệu cao; sắc ký lớp mỏng hiệu cao điện di mao quản… [1, 2, 4, 8] Tuy nhiên, phương pháp sử dụng hệ pha động phức tạp, thời gian phân tích dài [5, 6, 7, 9] Tại Việt Nam, chưa có đề tài nghiên cứu định lượng đồng thời MH SG phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Do đó, nghiên cứu thực với mục tiêu: Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời MH SG chế phẩm phương pháp HPLC-DAD với hệ pha động đơn giản, thời gian phân tích ngắn NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết bị * Nguyên liệu: - Mẫu thử Chế phẩm thử: viên nén bao phim Janumet® (Cơng ty Merck Sharp 22 Dohme) chứa MH 500 mg SG 50 mg Số đăng ký: VN1-694-12 Số lô: J001206 - Hóa chất - dung mơi + Chất chuẩn đối chiếu: MH có hàm lượng 99,54% (tính chế phẩm ngun trạng), số kiểm soát: QT 168 050413 Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP.HCM cung cấp SG phosphat monohydrat có hàm lượng 99,15% (tính chế phẩm nguyên trạng, số kiểm sốt): WS/STP 13012, Cơng ty Glenmark Generics Ltd., Ấn Độ cung cấp + Dung môi: methanol (MeOH) đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC (Baker, Mỹ) axít formic, triethylamin dùng phân tích kiểm nghiệm (Merck, Đức) - Thiết bị Hệ thống HPLC Hitachi L-2000 với đầu dò dãy diod quang Hitachi L-2455, bể siêu âm Elmasoonic S70H, cân phân tích ABT 220-5DM, máy đo pH HANNA pH 211 Phương pháp nghiên cứu * Chuẩn bị dung dịch: - Dung dịch chuẩn gốc: + Dung dịch MET chuẩn gốc mg/ml (dung dịch C1): cân xác 50 mg MET chuẩn cho vào bình định mức 25 ml, hòa tan với vài ml methanol, bổ sung vừa đủ với methanol, lắc + Dung dịch SIT chuẩn gốc 200 µg/ml (dung dịch C2): cân xác 12,85 mg SIT chuẩn (tương ứng 10 mg SIT dạng base) cho vào bình định mức 50 ml, hòa tan với vài ml methanol, bổ sung vừa đủ với methanol, lắc Tạp chí y - dợc học quân số 8-2016 - Dung dịch chuẩn định lượng: hút xác ml dung dịch C1 ml dung dịch C2 vào bình định mức 100 ml, bổ sung vừa đủ với pha động, lọc qua màng lọc 0,45 µm, dung dịch chuẩn làm việc chứa MH 100 µg/ml SG 10 µg/ml - Dung dịch thử: cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên, cho vào cối nghiền thành bột mịn Cân xác lượng bột tương ứng 100 mg MET 10 mg SIT cho vào bình định mức dung tích 50 ml Cho vào bình khoảng 30 ml methanol, siêu âm 15 phút Bổ sung vừa đủ với methanol, lắc Hỗn hợp chứa bình đem quay ly tâm với tốc độ 4.000 vòng/phút phút Lấy dung dịch lớp Hút xác ml dung dịch cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung vừa đủ pha động Lọc qua màng lọc 0,45 µm * Điều kiện sắc ký: - Hệ thống máy HPLC Hitachi L-2000, DAD L-2455 - Pha tĩnh: cột Phenomenex Luna RPC8 (250 mm x 4,6 mm, µm, 110 Å) Pha động: hỗn hợp MeOH:đệm (60:40, tt/tt), dung dịch đệm TEA 0,3%, pH 9,5 điều chỉnh axít formic - Tốc độ dòng: ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 10 µl - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng - Bước sóng phát hiện: 265 nm * Thẩm định quy trình định lượng: Tiến hành khảo sát tính phù hợp hệ thống thẩm định quy trình định lượng theo tiêu chuẩn ICH [3] Đánh giá tiêu quy trình định lượng bao gồm: tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính miền giá trị, độ xác, độ Ứng dụng quy trình định lượng để định lượng đồng thời MH SG lô chế phẩm nghiên cứu KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết khảo sát tính tương thích hệ thống sắc ký Thực sắc ký hỗn hợp chất với hệ pha động gồm thành phần với tỷ lệ thay đổi MeOH từ 90 - 40% (∆C = 5%), tốc độ dòng ml/phút Dựa vào cấu trúc hóa học hai chất phân tích, MH SG chất phân cực, đồng thời tham khảo số cơng trình cơng bố [1, 2, 4, 5], kỹ thuật sắc ký pha đảo với hệ dung môi phân cực áp dụng Trong trình thực nghiệm, khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu tách tính chọn lọc phương pháp pH tỷ lệ dung môi pha động Cho thêm TEA vào pha động nhằm làm giảm hệ số bất đối, giảm tượng kéo đuôi píc MH Ghi phổ hấp thụ UV khoảng 200 - 400 nm Tại thời gian lưu píc MH SG sắc ký đồ thu được, kết cho thấy: cực đại hấp thụ MH 235 nm, SG 265 nm Nhằm ưu tiên định lượng hoạt chất có hàm lượng thấp chế phẩm, nên bước sóng chọn để phân tích đồng thời MET SIT 265 nm Từ kết khảo sát thực nghiệm, lựa chọn điều kiện sắc ký để định lượng đồng thời MH SG trình bày phần phương pháp nghiên cứu 23 T¹p chÝ y - dợc học quân số 8-2016 8 6 4 mAU mAU Metformin HCl Sitagliptin 0 10 Minutes Hình 1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn chứa MH 100 µg/ml SG 10 µg/ml Chương trình sắc ký tách píc MH SG khỏi píc dung mơi píc tạp phân hủy tác nhân nhiệt, ẩm, axít base, oxy hóa Píc thu có hình dáng cân đối, gọn; thời gian phân tích < 10 phút Vì vậy, điều kiện sắc ký đạt yêu cầu phân tích Thẩm định phương pháp định lượng - Tính phù hợp hệ thống: Tính phù hợp hệ thống xác định cách tiêm lần liên tiếp dung dịch chuẩn Bảng 1: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống phương pháp mẫu chuẩn (n = 6) Hoạt chất MH SG Giá trị thống kê tR (phút) S (mV x giây) AS RS N Trung bình 2,85 145754,60 1,40 1,49 58044,60 RSD 0,00 0,97 1,27 0,53 0,58 Trung bình 6,34 100028,40 1,13 17,49 10372,00 RSD 0,17 0,79 1,05 0,17 0,69 (tR: thời gian lưu, S: diện tích đỉnh, As: hệ số đối xứng, Rs: độ phân giải, N: số đĩa lý thuyết) RSD thông số sắc ký chất phân tích mẫu chuẩn < 2%, độ phân giải píc MH SG > 1,5, hệ số đối xứng píc nằm khoảng 0,8 1,5 Như vậy, quy trình định lượng đồng thời MH SG đạt tính phù hợp hệ thống - Tính đặc hiệu: Kết khảo sát cho thấy píc mẫu thử có thời gian lưu trùng với thời gian lưu píc mẫu chuẩn Khi thêm chuẩn vào mẫu thử chiều cao diện tích píc tăng lên píc có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu píc mẫu chuẩn Điều chứng tỏ quy trình phân tích hoạt chất MH SG 24 T¹p chí y - dợc học quân số 8-2016 Metformin HCl Sitagliptin Metformin HCl Sitagliptin Metformin HCl Sitagliptin Hình 2: Sắc ký đồ mẫu pha động (1), mẫu trắng B1 (2), mẫu chuẩn (3), mẫu thử (4), mẫu thử thêm chuẩn (5) Metformin HCl Metformin HCl Metformin HCl Sitagliptin Sitagliptin Sitagliptin Hình 3: Sắc ký đồ mẫu thử (1), mẫu trắng B2 (2), mẫu thử phân hủy NaOH 0,1N sau 36 (3), mẫu trắng B3 (4), mẫu thử phân hủy HCl 0,1N sau 36 (5) 25 Tạp chí y - dợc học quân số 8-2016 Hình 4: Phổ UV-Vis thời gian lưu MH SG mẫu chuẩn thử [A]: phổ UV-Vis thời gian lưu MH mẫu chuẩn (b) thử (a); [B]: phổ UV-Vis thời gian lưu SG mẫu chuẩn (c) thử (d) Ở píc mẫu pha động, dung mơi pha mẫu khơng trùng với píc hoạt chất Bên cạnh đó, qua việc khảo sát số tác nhân axít, kiềm, kết cho thấy píc hoạt chất tách khỏi píc tạp phân hủy Trong mẫu phân hủy này, MH SG tách hoàn toàn Phổ UV-Vis thời gian lưu píc MH SG mẫu giống (hình 4) Sử dụng chức kiểm tra độ tinh khiết cho thấy píc MH SG mẫu 26 > 99% (theo phổ UV-Vis) Như vậy, quy trình có tính chọn lọc - Khoảng tuyến tính, độ xác độ đúng: Khoảng tuyến tính hai chất xây dựng vùng nồng độ 20 - 400 µg/ml cho MH, khoảng - 40 µg/ml cho SG Xây dựng điểm nồng độ, ứng với nồng độ, chuẩn bị dung dịch chuẩn độc lập tính giỏ tr trung bỡnh Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 8-2016 Đánh giá độ xác phương pháp dựa vào khảo sát độ lặp lại ngày (tiến hành mẫu thử khác nhau) độ xác trung gian (tiến hành trong ngày liên tiếp) Xác định độ phương pháp thêm chuẩn, xác định giá trị phần trăm tìm lại Thực ba mức nồng độ khác nhau, mức nồng độ tiến hành mẫu thử riêng biệt Bảng 2: Kết khảo sát khoảng tuyến tính, độ xác độ Phương trình hồi quy Khoảng tuyến tính (µg/ml) R Độ xác (RSD%) - Độ lặp lại (n = 6) - Độ xác trung gian (n = 3) Độ (n = 9) - Tỷ lệ hồi phục (%) - RSD MH SG y = 1650 x y = 9494 x 20 - 400 - 40 0,9998 0,9997 0,59 0,68 0,86 0,78 99,7 - 100,7 0,9 99,7 - 101 1,3 Kết thống kê cho thấy quy trình phân tích có khoảng tuyến tính rộng với giá trị hệ số tương quan cao, đạt yêu cầu độ xác, độ có tính chọn lọc Do vậy, quy trình định lượng đạt yêu cầu thẩm định theo hướng dẫn ICH [3] Ứng dụng quy trình định lượng để định lượng đồng thời MH SG lô chế phẩm nghiên cứu Bảng 3: Kết định lượng MH SG viên nén bao phim Janumet® 500 mg/50 mg Cơng ty Merck Sharp Dohme (Số đăng ký: VN1-694-12) (n = 6) Lô Hàm lượng (mg/viên) Hàm lượng so với nhãn (%) RSD (%) MH: 515,04 SG: 48,25 103 96,5 0,68 0,68 MH: 513 SG: 49,63 102,6 99,3 0,78 0,80 MH: 510 SG: 48 102 96 0,60 0,50 Hàm lượng MH SG lô viên nén bao phim Janumet 500 mg/50 mg khảo sát nằm khoảng 90,0 110,0% so với hàm lượng ghi nhãn BẢN LUẬN Hiện DĐVN IV Dược điển Mỹ, Anh có chuyên luận riêng lẻ MH SG Đã công bố số nghiên cứu định lượng đồng thời MH SG So với nghiên cứu Ramalingam Peraman CS (2013), điểm giống sử dụng pha tĩnh C8 phân tích bước sóng tương tự, khác thành phần tỷ lệ pha động Nghiên cứu sử dụng pha động hỗn hợp MeOH dung dịch chứa triethylamin 0,2%, axít n-heptansulfonic 0,2% điều chỉnh axít orthophosphoric đến pH 3, tỷ lệ (45:55) Bước sóng phân tích 267 nm thời gian phân tích khoảng 22 phút [5] Vì vậy, kết cho thấy, điều kiện khảo sát có ưu điểm thời gian phân tích ngắn (khoảng phút), tiết kiệm dung mơi, hóa chất So với nghiên cứu khác, điều kiện tối ưu khảo sát không dùng hệ đệm đệm phosphat, đệm amoni acetat [6, 7, 9] Các hệ đệm vô sử dụng thường xuyên không rửa hệ thống sắc ký quy cách 27 T¹p chÝ y - dợc học quân số 8-2016 cú th gõy ng muối hệ thống, làm hư hỏng thiết bị, gây sai lệch kết phân tích KẾT LUẬN Bằng phương pháp HPLC với đầu dò dãy diod quang, chúng tơi xây dựng quy trình định lượng đồng thời MH SG phosphat monohydrat viên nén Quy trình có tính chọn lọc, đơn giản, thời gian phân tích ngắn (< 10 phút), không sử dụng hệ đệm vô phosphat gây đóng muối hệ thống sắc ký, gây giảm tuổi thọ thiết bị TÀI LIỆU THAM KHẢO Darshana K Modi, Punit B Parejiya, Bhavesh H Patel A simple and sensitive HPTLC method for simultaneous determination of metformin hydrochloride and sitagliptin phosphate in tablet dosage form Hindawi Publishing Corporation Journal of Chemistry 2013, pp.1-4 Govindasamy Jeyabalan, Narendra Nyola Simultaneuos estimation of SG phosphate monohydrate and MH in bulk and pharmaceutical formulation by RP-HPLC Journal of Pharmacy and Education Research 2012, (2), pp.25-28 ICH Validation of analytical procedures: Text and Methodology Q2R1 2005 MaMdouhR Rezk, Safa’aM Riad, GhadaY MahMoud, and abdelaziz el baYouMi abdel 28 aleeM Simultaneous determination of SG and metformine in their pharmaceutical formulation Journal of AOAC International 2013, 96 (2), pp.301-306 Ramalingam Peraman, Chandra Sekhar Gowra, Y Padmanabha Reddy, Krishna Karthik Peruru Stability-Indicating RP-HPLC method for simultaneous determination of MH and SG phosphate in dosage forms Chromatographia 2013, 76, pp.1153-1162 Ramzia I El-Bagary, Ehab F Elkady, Bassam M Ayou Liquid chromatographic determination of SG either alone or in ternary mixture with metformin and SG degradation product Talanta 2011, 85, pp.673-680 Sudheer Kumar Sapavat, V Mohan Goud, JVC Sharma Method development and validation for simultaneous estimation of MH and SG by RP-HPLC in tablet dosage form International Journal of Pharmacy and Analytial Reasearch 2014, (1), pp.126-134 SL Bonde, RP Bhadane, Avinash Gaikwad, Deepak Katale, Sumit Gavali AS Narendiran: A simple and sensitive method for determination of metformin and SG in human plasma using liquid chromatography and tandem mass spectrometry International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 2013, (3), pp.463-470 T Raja, A Lakshmana Rao Validated RP-HPLC method for simultaneous estimation of MH and SG phosphate in bulk and pharmaceutical formulation International Journal of Pharmaceutical, Chemical and Biological Sciences 2012, (4), pp.696-702  ... tài nghiên cứu định lượng đồng thời MH SG phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Do đó, nghiên cứu thực với mục tiêu: Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời MH SG chế phẩm phương pháp. .. đặc hiệu, tính tuyến tính miền giá trị, độ xác, độ Ứng dụng quy trình định lượng để định lượng đồng thời MH SG lô chế phẩm nghiên cứu KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết khảo sát tính tương thích hệ thống sắc. .. tiên định lượng hoạt chất có hàm lượng thấp chế phẩm, nên bước sóng chọn để phân tích đồng thời MET SIT 265 nm Từ kết khảo sát thực nghiệm, lựa chọn điều kiện sắc ký để định lượng đồng thời MH