Xác định dư lượng penicillin G và V trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hơn thế nữa tồn dư Penicillin trong sản phẩm chăn nuôi có thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng như: ngộ độc, biến đổi hệ vi khuẩn của người tiêu dung hoặc làm cho người tiêu dung cũng bị

Bộ y tế viện dinh d−ỡng -Z”Y -

báo cáo tổng kết đề tài

MỞ ĐẦU

An toàn vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong công tác bảo vệ sức khoẻ con người Trong tiến trình gia nhập WTO, thị trường hàng hoá của Việt nam được

mở rộng, đặc biệt trong lĩnh vực xuất khẩu các mặt hàng nông sản, thuỷ sản Tuy nhiên,

do việc kiểm soát dư lượng hoá chất kháng sinh có hại đến sức khoẻ người tiêu dùng chưa được thực hiện nghiêm túc nên một số lô hàng bị thị trường nhập khẩu phát hiện kháng sinh có hại vẫn còn cao Tình trạng trên không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế cho các doanh nghiệp mà còn ảnh hưởng nghiệm trọng đến uy tín chất lượng hàng Việt nam trên thị trường thế giới

Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh (trong thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm) là rất phổ biến và được coi là một tiến bộ của công nghệ sinh học Thế nhưng, việc tuỳ tiện sử dụng thuốc kháng sinh dễ dẫn đến hậu quả: Lượng thuốc kháng sinh tồn dư trong sản phẩm vượt ngưỡng cho phép, người sử dụng loại thực phẩm này trong thời gian dài có thể gây nguy hại cho sức khoẻ

Penicillin là kháng sinh thế hệ đầu tiên có tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn Ban đầu, nó được hoan nghênh như một thứ thuốc thần kì và đã cứu sống vô số người trong chiến tranh thế giới thứ hai Mặc dù Penicillin đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc chống lại nhiều bệnh tật cho con người và các loài động vật, nhưng việc lạm dụng nó trong chăn nuôi có thể dẫn đến hiện tượng nhờn thuốc, giảm khả năng kinh tế của vật nuôi, gây thiệt hại cho người chăn nuôi Hơn thế nữa tồn dư Penicillin trong sản phẩm chăn nuôi có thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng như: ngộ độc, biến đổi hệ vi khuẩn của người tiêu dung hoặc làm cho người tiêu dung cũng bị kháng thuốc…

Việc phát triển các kĩ thuật xác định lượng tồn dư Penicillin trong thực phẩm phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm trong nước sẽ trở thành công cụ hữu hiệu giúp các cơ quan chức năng kiểm soát tốt hơn vấn đề đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu phương pháp xác định dư lượng Penicillin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Phương pháp có độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về kháng sinh nhóm Penicillin

1.1.1 Đại cương

Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện một nấm mốc thuộc giống Penicillium ức

chế sự phát triển của vi khuẩn Fleming gọi chất kháng khuẩn chưa được biết tới này là

Penicillin 10 năm sau, một nhóm các nhà khoa học thuộc trường Đại học Oxford bắt

đầu nghiên cứu chất này trên chuột thí nghiệm Penicillin được hoan nghênh như một

thứ thuốc thần kỳ và đã cứu sống vô số người trong chiến tranh thế giới thứ II [5]

Penicillin là kháng sinh thể hệ đầu tiên có tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều

loại vi khuẩn Penicillin được chiết ra từ dịch nuôi cấy nấm Penicillium chrysogenum

Penicillin lần đầu tiên phát hiện có tác dụng chống vi khuẩn gram dưng Staphylococcus,

Diplococcus nhưng hầu như không có tác dụng chống vi khuẩn gram âm và nấm men

Vài thập niên trở lại đây đã phát hiện ra nhiều loại pencillin mới trong đó một số có hiệu

quả chống lại vi khuẩn gram âm và nấm men như Saccharomyces cerevisae đơn bội và

E.coli [5]

1.1.2 Phân loại

Pencillin gồm nhiều loại, chúng có cấu tạo

gần giống nhau, bao gồm một vòng tiasolidin, một

vòng β-lactam, một nhóm amino có gắn với CO2

và một mạch bên (R) Hai loại Penicillin được

tổng hợp đầu tiên là benzylpenicillin(PenicillinG;

R = C6H5CH2-) và Phenoxymethylpenicillin

(PenicillinV; R = C6H5OCH2-) Và một số loại bán

tổng hợp: Amoxycillin, Ampicillin, Oxacillin,

Cloxacillin [5]

Hình 1: Cấu trúc chung của các penicillin

Sự khác biệt rõ ràng giữa các penicillin bao gồm khác biệt trong phổ hoạt động

của chúng Penicillin trong các muối và các dạng liều khác nhau, ampicillin, và

amoxicillin có hoạt tính chống lại các vi khuẩn hiếu khí gram dương và một số vi khuẩn

kỵ khí Các chất này dễ bị beta-lactamase phá huỷ và do đó không có hiệu quả chống tụ

cầu và các vi khuẩn kỵ khí sản sinh beta-lactamase Ampicillin và amoxicillin có hoạt

tính chống lại một số vi khuẩn hiếu khí gram âm Amoxicillin đã thay thế penicillin V

làm loại penicillin lý tưởng để phòng viêm nội tâm mạc do sinh khả dụng ưu việt của nó

M¹ch bªn

Vßng thiazolindine

Vßng β-lactam

1.1.3 Tác dụng của Penicillin

Giống như các họ kháng sinh khác, penicillin có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt

vi sinh vật gây bệnh

Cơ chế tác dụng chung như sau:

Peptidoglycan là thành phần cơ bản tạo nên tính vững chắc của vách tế bào vi khuẩn Quy trình tổng hợp peptidoglycan được thực hiện nhờ enzym D-alanin transpeptidase Do là axit, các penicillin có khả năng acyl hoá các D-alanin transpeptidase, làm cho các enzym này không thể tham gia vào quá trình tổng hợp peptidoglycan Sinh tổng hợp vách tế bào bị gián đoạn, vi khuẩn không thể tồn tại

Mặt khác, các penicillin còn hoạt hoá enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân huỷ vách tế bào vi khuẩn, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt

1.1.4 Tác hại của penicillin khi tồn dư trong thực phẩm

Phần lớn các kháng sinh an toàn khi sử dụng đúng Tuy nhiên dù ít hay nhiều chúng đều có thể gây ra các tác dụng không mong muốn và tai biến

Penicillin là kháng sinh ít độc, ít tác dụng không mong muốn, ngoại trừ phản ứng

dị ứng Các sản phẩm phân huỷ kết hợp với protein tạo thành các kháng nguyên là nguyên nhân của dị ứng và tuỳ theo cơ địa từng người phản ứng ở mức độ nào

¾ Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh trong thực phẩm như sau:

Một là, có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh và

có thể tồn dư do lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh trong chăn nuôi + Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho gia súc + Kháng sinh cho vào nước uống để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh

+ Kháng sinh cho thêm vào thức ăn cho gia súc để bảo quản súc sản lâu hư + Kháng sinh tiêm vào súc vật hoặc cho súc vật uống trước khi giết thịt với mục đích kéo dài thời gian, tránh hư hỏng thịt tươi

Hai là, có thể cho thẳng vào thực phẩm với mục đích ức chế, tiêu diệt vi sinh vật để bảo

quản thực phẩm Do vận chuyển sản phẩm đi xa, cho kháng sinh vào thực phẩm để bảo quản

Tất cả những nguyên nhân trên làm cho sản phẩm chăn nuôi, thủy sản tồn dư kháng sinh, có ảnh hưởng không tốt đối với người tiêu thụ

1.2 Giới thiệu về Penicillin G và Penicillin V

1.2.1 Thông tin chung

Bảng1: Thông tin chung về penicillin G và V Penicillin

(2S,5R,6R)-3,3-dimethyl-7-thia-1-

phenylacetyl)amino]-4-carboxylic acid

azabicyclo[3.2.0]heptane-2-2,76

Penicillin V

(350,39)

oxo-6-[[2-

(2S,5R,6R)-3,3-dimethyl-7-thia-1-

(phenoxy)acetyl]amino]-4-carboxylic acid

azabicyclo[3.2.0]heptane-2-2,73

30 -

40 phút

1.2.2 Tính chất và tác dụng

Penicillin G và Penicillin V là hai penicillin tự nhiên thu được từ môi trường nuôi

cấy nấm penicillium chrysogenum

Chúng được chỉ định trong bệnh nhiễm khuẩn thông thường: nhiễm khuẩn đường

hô hấp, tai mũi họng, nhiễm khuẩn huyết…

Penicillin G và V có độc tính thấp, nhưng cũng giống như các penicillin khác dễ

gây dị ứng thuốc: mẩn ngứa, mày đay, ngoại ban, hội chứng Stevens- johnson và Lyell,

nguy hiểm nhất là shock phản vệ

Ngoài ra có thể gây viêm tĩnh mạch huyết khối, thiếu máu tan máu, giảm bạch cầu

1.2.3 Tình hình sử dụng Penicillin

Mặc dù thuốc kháng sinh đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc chống lại

nhiều bệnh tật cho con người và các loài gia súc, gia cầm cũng như các loài thủy sinh,

nhưng việc sử dụng bừa bãi trong chăn nuôi có thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng như

gây độc, biến đổi hệ vi khuẩn của người tiêu dùng hoặc làm cho người tiêu dùng cũng bị

kháng thuốc

Theo số liệu của viện Thú y Mỹ (AHI), lượng kháng sinh được sử dụng trong

chăn nuôi ở Mỹ năm 1999 là khoảng 20,42 triệu Pao (9270 tấn), trong đó kháng sinh

nhóm Lonophore và Arsen chiếm nhiều nhất (47,5%) Tetracycline (15,67%), Penicillin

(4,26%), và các loại khác (32,57%)

Theo một báo cáo của Uỷ ban sử dụng dược phẩm trong thức ăn chăn nuôi trực thuộc Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia( NRC) (Mỹ), thiệt hại do lệnh cấm sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi có thể lên tới 2,5 tỷ USD mỗi năm Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã cảnh báo những hiểm hoạ mà loài người có thể phải đối mặt do sự kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh gây ra và WHO đang thúc đẩy một chương trình khuyến cáo tất cả các nước tiến tới cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh như chất kích thích sinh trưởng

Tại Việt Nam, theo kết quả điều tra sơ bộ của Viện khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam cho thấy: có tới 75% số mẫu thịt và 66,7% số mẫu gan của gia súc, gia cầm bán ở các chợ có mức tồn dư kháng sinh vượt ngưỡng cho phép

Sũa

Gan, bầu dục

Thịt Thịt Gan Thận Sũa Penicillin G

(ppb)

4 50 50 50 50 50 4

50

Thịt Penicillin V

nguyên tử AAS của kim loại cadimi trong phức ở pha hữu cơ, hay phân hủy pha hữu cơ lấy cadimi vào dung dịch HCl 1% và đo phổ của cadimi Phương pháp này phức tạp, không đặc trưng và chỉ xác định được lượng tổng Penicillin

Tiêu chuẩn ngành thuỷ sản TCN 197-2004 [8] qui định phương pháp định lượng Penicillin trong sản phẩm thuỷ sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Penicillin trong sản phẩm thuỷ sản được tách ra khỏi nền mẫu bằng dung dịch đệm phosphat, pH 9, làm sạch

và cô đặc dịch chiết trên cột Bond Elut C18, dẫn xuất hoá và định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA Qui trình này trải qua quá trình dẫn xuất phức tạp và mới chỉ dừng lại ở phạm vi thuỷ sản

1.3.2 Thế giới

a) Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS

Tác giả Titus A.M.Msagati [13] và cộng sự đã xác định dư lượng các β-lactam trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng - khối phổ Các tác giả đã chiết và làm sạch mẫu sử dụng hỗn hợp đệm phosphat, tetraethylammonium clorua Et4NCl và acetonitril Sau đó, các β-lactam sẽ được tách và định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ chế độ ion dương (LC-PI-ESI-MS) Giới hạn phát hiện của phương pháp này đối với Penicillin G và penicillin V trong gan và bầu dục là 1 ng/kg ; trong sữa là 0,7 µg/L

b) Phương pháp sắc ký lỏng cặp ion với detector UV

Tác giả Yuko Ito [14] và cộng sự thuộc Viện sức khỏe cộng đồng (Nhật Bản) đã ứng dụng kĩ thuật làm sạch qua cột trao đổi ion để xác định 6 penicillin: Penicillin G, Penicillin V, Oxacillin, Cloxacillin, Nafcillin, và dicloxacillin trong thịt Các penicillin được chiết ra khỏi nền mẫu thịt lợn với nước, nền mẫu thịt bò với NaCl 2%, làm sạch qua cột chiết pha rắn trao đổi ion và xác định bằng sắc ký lỏng cặp ion với detectơ tử ngoại Hiệu suất thu hồi của phương pháp từ 73 - 95% Giới hạn phát hiện của phương pháp cho các penicillin là 0,02 mg/kg

c) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tác giả E.Benito-Pena [11] và cộng sự thuộc trường đại học Madrid (Tây Ban Nha) đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tử ngoại – diot aray (UV-DAD) để xác định đồng thời các kháng sinh nhóm beta-lactam (Penicillin G, amoxicillin, ampicillin, Penicillin V, axacillin, dicloxacillin, và nafcillin) trong nước thải Hai kĩ thuật SPE được so sánh cho quá trình làm sạch và làm giàu mẫu: cột silica pha đảo C18 và cột trao đổi anion hỗn hợp MAX Các penicillin được định lượng bằng sắc ký lỏng sử dụng cột tách C18, chương trình rửa giải gradient và phát hiện với detectơ tử ngoại tại bước sóng 220nm Cột MAX cho hiệu suất thu hồi cao hơn, nằm trong khoảng

82 – 97% và giới hạn phát hiện từ 8 – 24 ng/L

Tác giả Lambert K Sorensen [12] và cộng sự ( Đan Mạch ) đưa ra quy trình xác định đồng thời 7 penicillin trong thịt, gan, bầu dục gia súc và lợn bằng phương pháp HPLC Các penicllin được tách ra khỏi mẫu bằng H2O, loại các tạp chất hữu cơ với hỗn hợp acid sulphuric và natri tungstat Dịch chiết được làm sạch qua cột chiết pha rắn Oasis HLB, được dẫn xuất hoá với anhydric benzoic, 1, 2, 4 - triazole và HgCl2 Các penicillin được tách và định lượng trên cột C18, chương trình rửa giải gradient và phát hiện bằng detectơ tử ngoại tại bước sóng 323nm Giới hạn phát hiện LOD của phương pháp là từ 8,9-11,1 µg/kg đối với amoxicillin, penicillin G, ampicillin, oxacillin, nafcillin và 18,3-20,9 µg/kg cho đicloxacillin

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh (trong thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm) là rất phổ biến và được coi là một tiến bộ của công nghệ sinh học, nhằm làm vật nuôi mau lớn Thế nhưng, việc tuỳ tiện sử dụng thuốc kháng sinh dễ dẫn đến hậu quả: Lượng thuốc kháng sinh tồn dư trong sản phẩm vượt ngưỡng cho phép, người sử dụng loại thực phẩm này trong thời gian dài có thể gây nguy hại cho sức khoẻ Mục tiêu của đề tài là: Xây dựng được phương pháp xác định penicillin G và V với độ nhạy và độ chính xác cao Phân tích một số mẫu thực tế để thẩm định lại qui trình

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Việc phát triển các kỹ thuật xác định dư lượng penicillin G và V trong thực phẩm

là rất cần thiết giúp cho các cơ quan chức năng kiểm soát tốt hơn việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi Để phù hợp với điều kiện của hầu hết các phòng thí nghiệm trong nước, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tử ngoại để phát hiện và định lượng penicillin G và V Cơ sở lí thuyết của phương pháp được tóm tắt dưới đây:

2.2.1 Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn)[4].Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất

lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Hình 2: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

Cũng như tất cả các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phần chính:

- Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích

- Phần tách: là phần trung gian của hệ sắc ký bao gồm cột tách, đôi khi có cột phụ trợ

- Phần phát hiện và xử lí số liệu: phần này bao gồm các detector, phần khuếch đại, computer và phần mềm xử lí số liệu, bộ phận ghi tín hiệu

• Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, đó là sắc

ký lỏng pha liên kết; sắc ký trao đổi ion; sắc ký cặp ion, sắc ký điện di mao quản; sắc ký phân bố lỏng-lỏng; sắc ký rây phân tử Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là sắc ký lỏng pha liên kết

2.2.2 Phân tích định tính và dịnh lượng trong HPLC

Một trong các đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký của các chất trong một hệ pha đã chọn là thời gian lưu của các chất Nghĩa là trong một hệ pha và trong các điều kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích sẽ có thời gian lưu khác nhau và cố định Chính đại lượng này là một tính chất hay thông số để định tính các chất trong một hỗn hợp mẫu

Vì vậy, sau khi đã chọn được các điều kiện tối ưu cho quá trình sắc ký, tiến hành ghi sắc đồ của mẫu phân tích, và xác định thời gian lưu của từng pic ứng với mỗi chất trong sắc đồ Sau đó so sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu của chất chuẩn, từ đó sẽ xác định được trong mẫu phân tích có những chất nào

Trong HPLC có thể dùng một trong 2 phương pháp là phương pháp đường chuẩn hoặc phương pháp thêm tiêu chuẩn để định lượng Việc dùng phương pháp nào trong hai phương pháp đó tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất phân tích

phần hoá học và vật lý dễ mắc sai số lớn Trong trường hợp này để loại trừ ảnh hưởng của nền, người ta dùng phương pháp thêm tiêu chuẩn

2.3 Hoá chất dụng cụ dùng trong nghiên cứu

2.3.1 Dụng cụ

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với detectơ PDA hoặc UV-VIS

- Cột sắc ký C18 (250mm × 4,6mm × 5µm)

- Hệ chiết pha rắn

- Cột chiết pha rắn Strata X-polymeric (500mg, 6ml)

- Máy cất quay chân không

Các loại hóa chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích

- Chuẩn Benzyl penicillin (Penicillin G) (từ Sigma) Penicillin G sodium salt (C16H17N2NaO4S)

- Chuẩn phenoxymetyl penicillin Kali (Penicillin V) (viện kiểm nghiệm thuốc trung ương) C16H17KN2O5S (98,90%)

- Acetonitril

- Kali dihydro photphat

- Dikali hydro photphat

- Acid sulfuric

2.3.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử

2.3.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Penicillin G

- Dung dịch chuẩn gốc Penicillin G 1000mg/l: cân chính xác 0,1g chuẩn Penicillin G, hoà tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml

- Dung dịch chuẩn trung gian Penicillin G 10 mg/l: hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn gốc penicillin G 1000 mg/l cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng nước cất

2.3.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Penicillin V

- Dung dịch chuẩn gốc Penicillin V 1000mg/l: cân chính xác 0,1g chuẩn Penicillin V, hoà tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml

- Dung dịch chuẩn trung gian Penicillin V 10 mg/l: hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn gốc penicillin V 1000 mg/l cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng nước cất

2.3.3.3 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc của 2 penicillin 2µg/ml: hút chính xác 1ml

dung dịch chuẩn trung gian 10 mg/l của mỗi penicillin vào bình định mức 5ml và định mức đến vạch bằng nước cất

Các dung dịch chuẩn penicillin được bảo quản lạnh (nhiệt độ 2 – 4oC), tránh ánh sáng

- Kênh A: Lấy 240ml acetonitril, 60 ml metanol cho vào bình định mức 1000 ml và định mức đến vạch bằng đệm photphat pH 6,5

- Kênh B: Lấy 300ml acetonitril và 200 ml metanol cho vào bình định mức 1000 ml và định mức đến vạch bằng đệm photphat pH 6,5

2.3.3.6 Chuẩn bị dung dịch Natri tungstat 0,68M

Cân 22,43 gam Na2WO4.2H2O, hoà tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml

2.3.3.7 Chuẩn bị dung dịch acid sulfuric 0,68M

Hút 3,8 ml dung dịch H2SO4 đặc vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng nước cất

2.3.3.8 Chuẩn bị dung dịch đệm photphat 25mM, pH 9

Cân 0,34 gam KH2PO4, hoà tan vào nước Chỉnh đến pH 9 bằng NaOH 5M; 0,5M Sau

đó chuyển vào định mức 100ml và định mức đến vạch bằng nước cất

2.3.3.9 Chuẩn bị dung dịch HgCl 2 0,1M

Cân 0,2715 gam HgCl2, hoà tan và định mức bằng nước cất đến 10ml

2.3.3.10 Chuẩn bị dung dịch dẫn xuất

Cân 13,78 gam 1,2,4 – triazol, thêm vào 60 ml H2O và 10ml HgCl2 0,1M Dùng NaOH 0,5 M chỉnh đến pH 9,0 ± 0,05 Sau đó chuyển sang bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng nước cất Để yên 24 giờ trước khi sử dụng

Bảo quản trong bình màu nâu Chỉ sử dụng phần dịch trong phía trên

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tối ưu các điều kiện xác định penicillin G và V bằng HPLC

3.1.1 Chọn bước sóng phát hiện

Detectơ là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp

Penicillin G và V hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại Do vậy, chúng tôi đã lựa chọn

detectơ PDA để phát hiện và định lượng 2 penicillin này Tham khảo tài liệu [11]với các

điều kiện sau:

- Cột Symmestry waters C18 (150mm × 4,6mm × 5µm)

- Detectơ PDA: 220nm

- Nhiệt độ buồng cột: 35oC

- Tốc độ dòng: 1,5ml/phút

- Pha động: A: H2O (0,01% TFA); B: ACN (0,01% TFA) với chương trình gradient:

Bảng 3: Chương trình gradient rửa giải các penicillin (không dẫn xuất)

Bơm mẫu thịt lợn thêm chuẩn thu được sắc đồ sau:

Có thể sử dụng detectơ PDA tại bước sóng 220nm để xác định các penicillin Tuy nhiên giới hạn phát hiện của phương pháp này không cao (LOD ~ 2ppm) Mặt khác, có rất nhiều chất hấp thụ tại vùng bước sóng 220nm, nên sắc đồ thu được chứa nhiều tạp chất gây khó khăn cho việc phát hiện và định lượng chất phân tích Tức là phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc kém Do vậy, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp dẫn xuất hoá các penicillin để mở rộng vùng bước sóng UV làm tăng độ chọn lọc của phương pháp, giảm tối đa ảnh hưởng độ hấp thụ của nền mẫu Tác nhân dẫn xuất được sử dụng ở đây là hỗn hợp 1,2,4-triazole và thuỷ ngân (II) clorid Sản phẩm của quá trình dẫn xuất hấp thụ cực đại tại bước sóng 225nm và 323nm Chúng tôi lựa chọn bước sóng 323nm để phát hiện và định lượng các penicillin

Hình 5: Sắc đồ 3D của hỗn hợp chuẩn Penicillin G 0,4ppm – Penicillin V 0,8ppm

3.1.2 Chọn pha động

Sau pha tĩnh thì pha động là yếu tố thứ hai quyết định đến hiệu quả tách sắc ký Nhìn chung, pha động có thể ảnh hưởng đến: độ chọn lọc của hệ pha, thời gian lưu trữ, hiệu lực của cột tách, độ phân giải, độ rộng của pic sắc ký

Trong HPLC, pha động phân cực được sử dụng phổ biến với thành phần chủ yếu

là nước mang lại tính kinh tế cao Để tách 2 penicillin ra khỏi các chất cản trở trong nền mẫu và định lượng nó một cách dễ dàng và chính xác, pha động sử dụng phải phân cực

Để đảm bảo sự ổn định của kết quả, đặc biệt là thời gian lưu, chúng tôi sử dụng hệ đệm

Hệ đệm được lựa chọn ở đây là đệm photphat 0,1M; pH 6,5 Khảo sát chương trình pha động trên 3 kênh:

A: Đệm photphat 0,1M; pH 6,5; B: ACN; C: MeOH

- Mẫu phân tích: dung dịch chuẩn hỗn hợp 2 penicillin 0,4ppm

Khảo sát các thành phần pha động khác nhau, thu được kết quả sau:

Bảng 4: Ảnh hưởng của thành phần pha động đến thời gian lưu của 2 penicillin Thành phần pha

%A %B %C Thời gian lưu của Pen G (phút) Thời gian lưu của Pen V (phút)

Từ bảng kết quả trên, chúng tôi nhận thấy, với chế độ chạy isocractic: nếu thành

phần pha động chỉ gồm đệm photphat và MeOH thì chất phân tích không được rửa giải;

nếu thành phần pha động chỉ gồm đệm photphat và ACN thì thời gian lưu của 2 penicillin

thấp và chúng không tách khỏi nhau được Thành phần pha động có cả đệm photphat,

ACN và MeOH với các tỉ lệ khác nhau thì thời gian lưu có cao hơn nhưng khả năng tách

của 2 chất ra khỏi nhau vẫn chưa tốt Do vậy, chúng tôi sử dụng chế độ gradient với

chương trình rửa giải như sau:

A: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 700 : 240 : 60

B: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 500 : 300 : 200

Bảng 5: Chương trình gradient rửa giải các penicillin (dẫn xuất)

Thành phần pha động Thời gian (phút)

Ban đầu, giữ ổn định ở 100%A Từ 0-20 phút, thành phần pha động thay đổi

tuyến tính từ 100%A đến 100%B Trong khoảng thời gian này, chất phân tích được rửa

giải Đến 21 phút, quay trở lại 100%A Từ 21-25 phút, duy trì ổn định ở 100%A Đây là

thời gian ổn định và hoạt hóa cột để chạy mẫu tiếp theo

- Pha động: chương trình gradient như trên

- Detectơ: PDA 323nm

- Nhiệt độ buồng cột: 40oC

- Tốc độ dòng: 1ml/phút

- Mẫu phân tích: dung dịch chuẩn hỗn hợp 2 penicillin 0,4ppm

Thu được các kết quả sau:

- Loại cột: Symmestry waters C18

Tóm lại, các thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký là:

- Cột Symmestry waters C18 (250mm × 4,6mm × 5µm)

- Pha động: chương trình gradient

A: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 700 : 240 : 60

B: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 500 : 300 : 200

Thành phần pha động Thời gian (phút)

3.2 Tối ưu hoá các điều kiện xử lí mẫu

Nguyên tắc: Penicillin G và V được tách ra khỏi nền mẫu bằng nước cất, loại các

tạp chất hữu cơ bằng hỗn hợp acid sulphuric và natri tungstat, làm sạch qua cột chiết pha

rắn SPE, dẫn xuất với hỗn hợp 1,2,4-triazole và thuỷ ngân (II) clorid, phát hiện và định

lượng bằng săc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tử ngoại

QUY TRÌNH DỰ KIẾN CHIẾT PENICILLIN G VÀ V