SEMINAR xác định dư lượng penicillin g và v trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC (dược PHÂN TÍCH SLIDE)

Chuyên đề: XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG PENICILLIN G VÀ V TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Đặt vấn đề Kết luận Tính tốn kết Tổng quan penicillin Phương pháp nghiên cứu Đặt vấn đề Kháng sinh chăn nuôi Tồn dư kháng sinh thực phẩm • • • • • • Phịng bệnh Chữa bệnh Thúc đẩy tăng trưởng Người sử dụng Gia súc Môi trường Tổng quan penicillin Penicillin kháng sinh hệ có tính kháng khuẩn mạnh nhiều loại vi khuẩn Penicillin lần phát có tác dụng chống vi khuẩn gram dương Staphylococcus, Diplococcus khơng có tác dụng chống vi khuẩn gram âm nấm men Cấu trúc chung penicillin Tính chất tác dụng pen G V Penicillin G V hai penicillin tự nhiên thu từ môi trường nuôi cấy nấm penicillium chrysogenum Chỉ định bệnh nhiễm khuẩn thông thường: hô hấp, tai mũi họng, nhiễm khuẩn huyết… Penicillin G V có độc tính thấp, dễ gây dị ứng thuốc, nguy hiểm shock phản vệ Có thể gây viêm tĩnh mạch huyết khối, thiếu máu tan máu, giảm bạch cầu Tác hại penicillin người Làm đảo lộn công nghệ chế biến Gây tượng “chọn lọc” vi sinh vật kháng lại chất kháng sinh, đặc biệt tượng “kháng thuốc chéo” Penicillin kháng sinh thường gây dị ứng nhất: mẩn ngứa, mày đay, ngoại ban Nguy hiểm shock phản vệ, penicillin chiếm đầu bảng với tỷ lệ shock phản vệ 1/70.000 Đối tượng nghiên cứu Dư lượng penicillin G V thực phẩm Mục tiêu: Xây dựng phương pháp xác định penicillin G V với độ nhạy độ xác cao PEN G PEN V Thiết bị dụng cụ - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao HPLC với detectơ PDA UV-VIS - Cột sắc ký C18 (250mm× 4,6mm ì 5àm) - H chit pha rn - Ct chiết pha rắn Polymeric (500mg, 6ml) - Máy cất quay chân không - Máy lắc vortex - Máy li tâm, đạt tốc độ 6000 vòng/phút - Máy đồng mẫu - Máy đo pH Thiết bị dụng cụ - Bể điều nhiệt - Cân phân tích điện tử(độ xác 0,00001g) - Cân phân tích(độ xác 0,0001g) - Cân kĩ thuật (độ xác 0,01g) - Cốc có mỏ loại dung tích 50, 100, 250 ml - Bình định mức thuỷ tinh loại dung tích 10, 20, 100 ml, lít lít - Vial loại 1,8 ml - Pipetman loại 200, 1000 ml đầu tuyp - Ống li tâm dung tích 50 ml Hóa chất Các loại hóa chất dùng phương pháp thuộc loại tinh khiết phân tích: - Chuẩn Benzyl penicillin (Penicillin G) - Chuẩn phenoxymetyl penicillin Kali (Penicillin V) - Acetonitril, Methanol, Natritungstat (Na2WO4), Thuỷngân (II) clorid (HgCl2), 1,2,4- triazole (C2H3N3), Natrithiosulfat (Na2S2O3), Natrihydroxid (NaOH), Natriclorid (NaCl), Kali dihydrophotphat (KH2PO4), Dikali hydro photphat (K2HPO4), Acid sulfuric (H2SO4) Xử lý mẫu  Lấy 5g với 20ml nước đồng trong ống li tâm  Thêm 2ml H2SO4 0,68M, 2ml Natri tungstat 0,68M lắc vortex, để yên 5p, li tâm 6000 v/ph 5p  Lọc bình nón 50ml (lọc lấy bã làm lại quy trình trên) Xử lý mẫu  Phần dịch lại cho vào mơi trường có PH = 8-9, NAOH 0,4N với 5ml đệm phosphat 25mM rửa tạp, 3ml MeOH, 3ml H20 cho vào cột SPE  Hút khô vịng 1p, rửa giải với 10ml CAN/bình cất quy, cố quay chúng đến cạn 40 C  Thêm 500 µm đệm photphat 25mM, pH 9, 500µL hỗn hợp dẫn xuất, đưa vào bể điều nhiệt 55 C vịng 30p CÁC THƠNG SỐ TỐI ƯU ãCt Symmestry waters C18 (250mmì4,6mmì5àm) ãPha ng: chng trỡnh gradient oA: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 700 : 240 : 60 oB: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 500 : 300 : 200 •Detectơ: PDA 323nm •Nhiệt độ buồng cột: 40oC •Tốc độ dịng: 1ml/phút KHOẢNG TUYẾN TÍNH VÀ ĐƯỜNG CHUẨN Phương pháp HPLC có khoảng tuyến tính rõ rệt Tất hệ số hồi qui tuyến tính dao động khoảng từ 0,99 đến Khoảng tuyến tính Phương trình đường chuẩn R² (ng/g) Pen G 0,1 – y = 114445x – 3235.9 0,9995 Pen V 0,2 – y = 43182x – 2013.7 0,9997 ĐƯỜNG CHUẨN ĐỘ CHÍNH XÁC  Giới hạn phát phương pháp (LOD) PEN G = 20ppb, PEN V = 40ppb  Giới hạn định lượng phương pháp (LOQ) PEN G = 67ppb, PEN V = 133ppb  Kết phân tích cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao để phân tích dư lượng kháng sinh CAP thịt LOD LOQ thiết bị cao so với giới hạn cho phép nên cần phải làm giàu mẫu ĐỘ LẶP LẠI Sử dụng mẫu trắng, thêm mức chuẩn khoảng đầu, cuối đường chuẩn, mức lặp lần Tính độ lệch chuẩn SD hệ số biến thiên CV: S diện tích pic sắc ký thứ i i S tb diện tích trung bình n lần chạy n số lần chạy lặp ĐỘ LẶP LẠI MẪU mc SD CV (%) Mẫu thực 0,1 643,4 10,7 0,4 3178,3 8,9 0,6 2939,2 5,3 Bảng: Độ lặp lại Penicillin G nồng độ khác MẪU mc SD CV (%) Mẫu thực 0,2 493,5 8,9 0,6 1611,5 7,9 1001,9 2,8 Bảng: Độ lặp lại Penicillin V nồng độ khác ĐỘ LẶP LẠI Theo AOAC, CV% cho phép 100ppb 15%, 1ppm 11% Tại nồng độ penicillin thấp, độ dao động kết lớn Tuy nhiên, cấp độ khảo sát, CV% phương pháp nằm khoảng – 10% phù hợp với yêu cầu AOAC ĐỘ THU HỒI Tính hiệu suất thu hồi phương pháp theo công thức sau : C: nồng độ Pen xác định (µg/g) C': nồng độ Pen tính từ đường chuẩn (µg/ml) V: thể tích định mức trước bơm vào HPLC ( V = 1ml) m: khối lượng mẫu (g) C : m+c nồng độ Pen xác định mẫu thêm chuẩn (µg/g) C : nồng độ Pen có mẫu (µg/g) m m : lượng Pen thêm vào (µg) c Ứng dụng phân tích mẫu thực tế Xác định Penicillin G V nhóm đối tượng: nhóm gia súc (thịt, gan, bầu dục lợn, bị); nhóm gia cầm (thịt gà, thịt ngan, thịt vịt); nhóm thuỷ hải sản (một số loại tơm, cá) để thẩm định lại qui trình Các mẫu lấy ngẫu nhiên số cửa hàng địa bàn nội thành Hà nội Chọn mẫu kĩ thuật lấy mẫu theo TCVN 4833- 1:2002 Mỗi loại mẫu lấy cửa hàng, trộn phân tích Trong số 10 loại mẫu khơng có mẫu phát có penicillin G V Hiệu suất thu hồi nằm khoảng 80 - 93% KẾT LUẬN Đã khảo sát chọn thông số tối ưu cho trình chạy sắc ký Đã tìm điều kiện tối ưu cho q trình xử lí mẫu, hiệu suất thu hồi đạt từ 83 ÷ 90% Đã khảo sát khoảng tuyến tính, lập đường chuẩn, xác định LOD, LOQ phương pháp, thẩm định độ lặp lại, độ thu hồi Tiến hành phân tích 40 mẫu thịt, gan, bầu dục lợn, gà, ngan, vịt, tôm, cá…trên địa bàn thành phố Hà Nội khơng có mẫu phát có penicillin G V Phương pháp HPLC phù hợp cho việc xác định dư lượng Penicillin G V thực phẩm ã đ n b c c v ô c n m Cả ! i õ d theo ... (? ?g/ ml) V: thể tích định mức trước bơm v? ?o HPLC ( V = 1ml) m: khối lượng mẫu (g) C : m+c nồng độ Pen xác định mẫu thêm chuẩn (? ?g/ g) C : nồng độ Pen có mẫu (? ?g/ g) m m : lượng Pen thêm v? ?o (? ?g) ...  Giới hạn định lượng phương pháp (LOQ) PEN G = 67ppb, PEN V = 133ppb  Kết phân tích cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao để phân tích dư lượng kháng sinh CAP thịt LOD LOQ thiết bị cao so v? ??i... thường g? ?y dị ứng nhất: mẩn ngứa, mày đay, ngoại ban Nguy hiểm shock phản v? ??, penicillin chiếm đầu bảng v? ??i tỷ lệ shock phản v? ?? 1/70.000 Đối tượng nghiên cứu Dư lượng penicillin G V thực phẩm