Nghiên cứu chuẩn hóa phương pháp xác định hàm lượng vitamin D (D2 và D3 ) trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Bảng 5 Thời gian lưu của hai chất chuẩn tương ứng với pha động khác nhau tốc độ 1ml/ phút, cột Inertsil ODS 3, detector DAD 265nm Bảng 6 Thời gian lưu của hai chất ứng với tốc độ dòng

TT Nội dung Trang

3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 8

4 Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao áp 9

5 Các phương pháp định lượng bằng HPLC 11

TT C¸c ch÷ viÕt t¾t NghÜa tiÕng ViÖt

3 UV-VIS Quang phæ tö ngo¹i - kh¶ kiÕn

TT Nội dung bảng

Bảng 1 Thời gian lưu của vitamin D 2 và D 3 đối với điều kiện chạy cột

Waters RP- 18, detector DAD, bước sóng 265nm, pha động

Bảng 2 Thời gian lưu của vitamin D 2 chạy cột Inertsil ODS 3 và cột

Waters RP18, detector DAD bước sóng 265nm, pha động ACN : MeOH =75:25, tốc độ dòng 1ml/phút

Bảng 3 Nhận xét các sắc đồ của hai chất chuẩn đối với cột Inertsil ODS 3

detector DAD bước sóng 265nm, Pha động ACN : H2O =75:25, tốc độ dòng 1ml/phút

Bảng 4 Nhận xét kết quả chạy sắc ký hai chuẩn trên cột Inertsil ODS 3

pha động ACN : MeOH = 50: 50, detector DAD bước sóng 265nm, tốc độ dòng 1ml/phút

Bảng 5 Thời gian lưu của hai chất chuẩn tương ứng với pha động khác

nhau tốc độ 1ml/ phút, cột Inertsil ODS 3, detector DAD 265nm

Bảng 6 Thời gian lưu của hai chất ứng với tốc độ dòng khác nhau trên hệ

pha động MeOH: THF: H2O = 93:2:5, detector DAD 265nm, cột Inertsil ODS 3

Bảng 7 Tổng kết điều kiện chạy HPLC phân tích vitamin D

Bảng 8 Tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chuẩn của vitamin D 2

Bảng 9 Tương quan giữa diện tích và nồng độ chuẩn vitamin D 3

Bảng 10 Xác định hàm lượng vitamin D 2 mẫu sữa bột XO

Bảng 11 Xác định hàm lượng vitamin D 3 trong sữa Sunny grow baby

Bảng 12 Xác định hàm lượng vitamin D trong sữa chua nestlé có đường

Bảng 14 Xác định hàm lượng vitamin D 3 trong sữa bột giầu năng lượng

Bảng 15 Xác định hàm lượng vitamin D trong sữa đặc có đường

Bảng 16 Kết quả hàm lượng vitamin D trong một số mẫu khác

Bảng 17 Độ thu hồi của vitamin D 3

Bảng 18 Độ thu hồi của vitamin D 2

Bảng 19 Kết quả phân tích mẫu sữa bột mẫu DDP 4 vật liệu chuẩn

Bảng 20 Tổng hợp các thông số thẩm định

TT Nội dung các hình

Phần tổng quan

Hình 1 Công thức hoá học, công thức cấu tạo của vitamin D2 và D3

Hình 2 Sơ đồ chuyển hoá của vitamin D trong cơ thể

Phần mục tiêu, đối tượng và phương pháp

Hình 3 Mô tả quá trình chạy sắc ký

Hình 4 Sơ đồ mô tả hệ thống HPLC

Hình 5 Đồ thị phụ thuộc diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ

Phần kết quả nghiên cứu

* Khảo sát điều kiện chạy

Hình 6 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,04ppm, cột Waters, detector

DAD bước sóng 265nm, pha động MeOH: H2O = 98:2, tốc độ 1ml/ phútHình 7 Dạng phổ hấp thụ của vitamin D2

Hình 8 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,08ppm, cột Waters, detector

DAD bước sóng 265nm, pha động MeOH: H2O = 98:2, tốc độ 1ml/ phút

Hình 9 Dạng phổ hấp thụ của vitamin D3

Hình 10 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,04ppm, cột Waters, detector

DAD bước sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ dòng 1ml/ phút

Hình 11 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,04ppm, cột Inertsil ODS 3,

detector DAD bước sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ 1ml/ phút

sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ 1ml/ phút Hình 13 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector

DAD bước sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ 1ml/ phút

Hình 14 Sắc đồ chuẩn vitamin D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD bước

sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 50: 50, tốc độ 1ml/ phút Hình 15 Sắc đồ chuẩn vitamin D3, cột Inertsil ODS 3, detector DAD bước

sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 50: 50, tốc độ 1ml/ phút Hình 16 Sắc đồ hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD

bước sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 50:50, tốc độ 1ml/ phút Hình 17 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector

DAD bước sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 90:10, tốc độ 1ml/ phút

Hình 18 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector

DAD bước sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 90:10 tốc độ dòng 1,2 ml/ phút

Hình 19 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector

DAD bước sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 90:10 tốc độ dòng 1,5 ml/ phút

Hình 20 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector

DAD bước sóng 265nm, pha động MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tốc

độ dòng 1 ml/ phút

Hình 21 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector

DAD bước sóng 265nm, pha động MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tốc

độ dòng 1,2 ml/ phút

Hình 22 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD

ml/ phút

265nm, pha động MeOH: THF: H2O = 92:3:5, tốc độ dòng 1,5 ml/ phút Hình 24 Sắc đồ vitamin D3, cột Inertsil ODS 3, detector DAD bước sóng

265nm, pha động MeOH: THF: H2O = 92:3:5, tốc độ dòng 1,5 ml/ phút

* Xác định khoảng tuyến tính

Hình 25 Đường chuẩn vitamin D2

Hình 26 Đường chuẩn vitamin D3

* Sắc đồ chạy mẫu

Hình 27 Sắc đồ xác định hàm lượng vitamin D trong sữa tuơi Kapi

Hình 28 Sắc đồ chạy mẫu sữa tươi xác định hàm lượng vitamin D2

Hình 29 Sắc đồ chạy mẫu sữa bột xác định vitamin D3

Hình 30 Sắc đồ chạy mẫu sữa bột xác định vitamin D3

Phần 1: Mở đầu

Để tồn tại, phát triển và cải thiện nòi giống, cơ thể chúng ta luôn cần

được cung cấp đủ các chất dinh dưỡng, nguồn cung cấp các chất này có nhiều trong thực phẩm ăn vào hàng ngày Các chất dinh dưỡng chính là các nhóm cung cấp năng lượng cho cơ thể như glucid, lipid, protein, nhóm cung cấp muối khoáng, nhóm cung cấp các loại vitamin và nước Theo quan

điểm của các chuyên gia dinh dưỡng hiện nay trên thế giới mà chúng ta

đang sống tồn tại hai thái cực khác nhau, một bên là vực thẳm của sự thiếu

ăn và một bên là vực thẳm của sự thừa ăn Sự thiếu ăn đã dẫn đến tình trạng suy dinh dưỡng do thiếu năng lượng protein, tuy nhiên với sự phát triển của nền khoa học tiến tiến trên thế giới đời sống của người dân ở hầu hết các nước đã được cải thiện, không ngừng nâng cao ở Việt nam với sự hỗ trợ của các chương trình phòng chống suy dinh dưỡng, chương trình VAC và cuộc cách mạng xanh trong ngành nông nghiệp đã góp phần to lớn trong việc tăng cường an ninh thực phẩm quốc gia, vấn đề đói ăn không còn là

điều bức xúc Hàng năm tỷ lệ suy dinh dưỡng đã giảm đi một cách đáng kể Tuy nhiên vấn đề dinh dưỡng mới nảy sinh đó là các bệnh mãn tính liên quan đến dinh dưỡng đang là mối quan tâm của nhiều người Khái niệm thực phẩm chức năng (thực phẩm chữa bệnh) đã trở nên quen thuộc dần với mọi người dân Hiện nay để giải quyết vấn đề này trên thế giới cũng như trong nước đã xuất hiện nhiều loại thực phẩm chữa bệnh, thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng phục vụ cho bệnh nhân liên quan Có thể coi thực phẩm chức năng, vai trò của thực phẩm đối với bệnh mãn tính là hướng tiếp cận rất mới trong ngành dinh dưỡng, thức ăn là thuốc, thuốc là thức ăn [16]

ở Nhật bản cho đến nay đã có khoảng hơn 192 sản phẩm được gọi là thực phẩm chức năng nhằm góp phần vào duy trì, cải thiện chế độ ăn và sức

khoẻ [16] Một trong số các vi chất rất quan trọng đã được bổ sung vào thực phẩm đó là các loại vitamin

Vitamin là những chất không sinh năng lượng nhưng không thể thiếu

được đối với sự tồn tại, phát triển của mỗi cơ thể sống Vitamin có vai trò tạo ra các coenzim cần thiết trong các phản ứng chuyển hoá khác nhau Tất cả các quá trình sống gắn liền với sự trao đổi chất trong cơ thể đều có sự tham gia trực tiếp của vitamin [14] Nguồn cung cấp vitamin chủ yếu là từ thức ăn Khi thiếu vitamin cơ thể sẽ mắc phải một số bệnh lý, như thiếu vitamin A dễ dẫn tới bệnh mù loà, thiếu vitamin B1 dễ bị bệnh tê phù, thiếu vitamin PP bị bệnh pellagra, thiếu vitamin D bị bệnh về xương [17] Hiện nay một thực tế khắc nghiệt đã xảy ra ở các nước đang phát triển là phải

đương đầu với gánh nặng kép giưã bệnh nhiễm trùng, tử vong trẻ em và thiếu dinh dưỡng với các bệnh mãn tính không lây liên quan đến dinh dưỡng [16] Thực tế đã cho thấy thiếu vi chất dinh dưỡng đã góp phần không ít trong gánh nặng kép này Vì vậy vai trò thực phẩm được đánh giá vô cùng quan trọng, việc nghiên cứu ứng dụng thực phẩm chức năng đã

đang trở thành trào lưu mang tính toàn cầu Nói đến thực phẩm chức năng chúng ta không thể nói đến thực phẩm bổ sung vitamin D, một loại vitamin khá quan trọng để phòng chống bệnh còi xương ở trẻ em, loãng xương ở người lớn, hạ calci máu và một số bệnh ngoài da

Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại sữa, bột dinh dưỡng, bánh quy có bổ sung viatmin D Với lý do trên, đề tài này chúng tôi hy vọng chuẩn hoá phương pháp xác định hàm lượng vitamin D bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong một số loại thực phẩm như sữa chua, sữa bột, sữa nước, bánh quy, bột dinh dưỡng để đưa ra quy trình phân tích phù hợp, nhằm đánh giá đúng chất lượng, giá trị dinh dưỡng thực của các sản phẩm thực phẩm

Phần 2: Tổng quan

1 Nguồn gốc và tính chất của vitamin D

VitaminD là chất tinh thể hình kim không màu, không mùi, không tan trong nước, hoà tan trong dầu mỡ, tan trong dung môi hữu cơ như ethanol, chlorofoc, methanol Tên gọi khác của vitamin D là calciferol Vitamin D là một nhóm gồm từ D2 đến D7 song có hai hoạt tính mạnh nhất

là vitamin D2 còn gọi Ergocalciferol và vitamin D3 còn gọi Cholecalciferol Cholecalciferol - C27H44O Ergocalciferol - C28H44O

Vitamin D2

Hình 1: Công thức hoá học, công thức cấu tạo của vitamin D 2 và D 3

Vitamin D có chủ yếu trong thức ăn nguồn gốc động vật như trứng, cá, đặc biệt dịch chiết từ gan cá, bơ, sữa, thịt

Trong cơ thể người vitamin D3 (Cholecalciferol) được tổng hợp từ 7 dehydrocholesterol ở dưới da nhờ ánh sáng tử ngoại

Vitamin D2(Ergocalciferol) được tổng hợp từ ergosterol có trong nấm và men bia

Nói chung, hoạt tính sinh học của hai loại vitamin D2 và vitamin D3không có sự khác nhau nhiều Trong cơ thể vitamin D chuyển hoá ở gan và

thận tạo ra chất chuyển hoá có hoạt tính là 1,25- dihydroxycholecalciferol nhờ enzim hydroxylase [14]

Hình 2: Sơ đồ chuyển hoá của vitamin D trong cơ thể người

Trong da

Trong gan

Trong thận

Dạng hoạt động

2 Tác dụng của vitamin D

- Vitamin D tham gia vào quá trình tạo xương nhờ tác dụng chuyển hoá các chất vô cơ chủ yếu là calci và phosphat, làm tăng hấp thu calci và phosphat

ở ruột, tham gia vào quá trình calci hoá sụn nên nó rất cần cho sự phát triển xương ở trẻ em

- Làm điều hoà calci trong máu, ức chế tế bào sinh ung thư

- Khi thiếu vitamin D ruột không hấp thu đủ calci và phospho làm calci máu giảm gây hậu quả trẻ em chậm lớn, còi xương chân vòng kiềng, chậm biết đi, chậm kín thóp, nguời lớn bị loãng xương, xốp xương, xương thưa dễ gẫy, phụ nữ có thai thiếu vitamin D dễ sinh ra trẻ khuyết tật ở xương [14]

- Nguyên nhân của sự thiếu vitamin D là do cơ thể hấp thu thức ăn kém, do

ít tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, do rối loạn chuyển hoá, do nhu cầu cao ở phụ nữ có thai và cho con bú

-Tuy nhiên dùng vitamin D quá liều cũng gây ra chứng tăng calci máu, tăng calci niệu, đau nhức xương khớp, tạo sỏi thận, tăng huyết áp, có thể gây suy nhược, mệt mỏi, đau đầu, buồn nôn, tiêu chảy, giòn xương [14]

Theo công trình nghiên cứu khảo sát tác dụng của vitamin D đối với bệnh ung thư ở bang Chicago trong 19 năm các tác giả nhận thấy tỷ lệ ung thư kết tràng ở nam giảm 55% nếu hàng ngày được bổ sung vitamin D là 3,75mcg [18] Theo nghiên cứu của Danson - Hughes và các cộng sự tiến hành trên đối tượng phụ nữ được bổ sung vitamin D 400 IU/ ngày và nhóm phụ nữ khác không được bổ sung, cả hai nhóm đều có lượng vitamin D ăn vào hàng ngày là 100 IU Nhận thấy nhóm đối chứng bị giảm đáng kể mật

độ khoáng trong xương so với nhóm được bổ sung [18] Năm 1989 theo khuyến cáo của uỷ ban dinh dưỡng Hoa kỳ (RDA) vitamin D cần bổ sung

là 10mcg/ ngày ở tuổi từ 51- 70 và 15mcg / ngày ở tuổi cao hơn [18] Theo

nghiên cứu của trường Y Harvard được đăng trên tạp chí của hiệp hội y học

Mỹ cho thấy vitamin D có thể giúp giảm nguy cơ mắc bệnh đa xơ cứng Các nhà nghiên cứu đã so sánh lượng vitamin D ở 257 mẫu huyết tương trong số hơn 7 triệu mẫu của nhân viên quân đội Mỹ, họ phát hiện rằng người da trắng nhóm có hàm lượng vitamin D cao nhất có nguy cơ mắc bệnh đa xơ cứng thấp nhất Bệnh đa xơ cứng là bệnh mãn tính của hệ thần kinh, bắt đầu với các triệu chứng như mất trí nhớ, suy nhược, mệt mỏi, đau

đớn hoặc liệt, chóng mặt và sau đó ảnh hưởng tới tim mạch

3 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

Cùng với sự phát triển của nền khoa học kỹ thuật tiên tiến, với sự bùng nổ của ngành công nghệ thông tin, hiện nay hàng loạt các hệ thống máy phân tích hoá học đã được cải tiến nâng cấp, nhằm xác định nhiều loại chất hoá học và đồng thời nâng cao độ nhạy của phép phân tích cũng như

độ lặp lại của kết quả kiểm nghiệm Trên thế giới nhiều nhà phân tích hoá học đã có nhiều công trình nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin D trong thực phẩm như thịt, cá, sữa, trong máu Đó là nghiên cứu hàm lượng vitamin hoà tan trong chất béo của mẫu sữa chua bằng phương pháp HPLC với detector PDA của M.M Delgado Zamarreno, A Sanchez Perez của trường đại học Salamanca Tây ban nha đã đưa ra các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích vitamin A, E, D như điều kiện thuỷ phân, tách các chất trong khi xử lý mẫu, kết quả của nghiên cứu này đưa ra độ thu hồi vitamin

D3 là 91 ± 5% với hàm lượng vitamin D3 trong mẫu là 0,09 mcg/100g ± 5% [11] Theo nghiên cứu công bố trên Food Chemistry Vol.57, No.1 95-

99, 1996 ở Anh các nhà nghiên cứu đưa ra cách xử lý mẫu, điều phân tích xác định hàm lượng vitamin D trong thực phẩm, kết quả nghiên cứu này cho thấy hệ số biến thiên sau khi làm lặp lại ba lần đối với vitamin D3 và D2

là <10%, độ thu hồi của phương pháp là 90 -110% với D2 và D3, giới hạn

phát hiện là 1,5-2 ng [12] Trong công trình nghiên cứu đăng trên tạp chí Chromatography A của bộ môn thực phẩm, dinh dưỡng Đại học Georgia Athens Mỹ, bộ môn Dinh dưỡng trên người và khoa học thực phẩm trường Bách khoa Virginia ngày 26 tháng 1 năm 1998 đã đưa ra điều kiện và yếu

tố ảnh hưởng quá trình phân tích hàm lượng vitamin A, E, D trong thức ăn

động vật bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu này cho thấy độ thu hồi của phương pháp là 93-107% [19] Trong bài báo của tạp chí Food composition and analysis 16 (2003) có công trình nghiên cứu hàm lượng vitamin D3 và 25 hydroxyvitamin D3 trong thịt lợn tươi và thịt lợn chín, đã

đưa ra kết quả nồng độ vitamin D3 đối với thịt tươi là từ 0,05 đến 0,21 mcg/100g với thịt chín là 0,07-0,14 mcg/100g Sau khi làm 49 thí nghiệm lặp lại họ đã đưa ra hệ số biến thiên là 7,0%, làm 51 thí nghiệm khác hệ số biến thiên là 7,3% [7] Ngoài ra còn nhiều công trình nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin D trong máu và huyết thanh, trong thực vật Một số nghiên cứu đã đưa ra hàm lượng vitamin D trong cá thu là 15mcg/100g, trong gan bò 1mcg/100g, trong trứng gà 2mcg/100g, trong nấm rơm là 2mcg/100g [8]

Hiện nay ở Việt nam chúng tôi nhận thấy việc nghiên cứu vitamin D trong thực phẩm chưa được làm nhiều, trong bảng thành phần thức ăn Việt nam chưa đề cập đến hàm lượng vitamin D Trong danh mục tiêu chuẩn Việt nam (TCVN) chúng tôi cũng chưa thấy một quy trình chuẩn nào để xác định hàm lượng vitamin D bằng HPLC, vì vậy sau khi tham khảo các tài liệu cùng với điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu chuẩn hoá phương pháp xác định hàm lượng vitamin D trong một số loại thực phẩm bằng HPLC

Phần 3

1 Mục tiêu

Như đã đề cập trong phần tổng quan mục tiêu đề tài chúng tôi chọn

là “ chuẩn hoá phương pháp xác định hàm lượng vitamin D (D2và D3) trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC’’

2 Đối tượng

Trong khuôn khổ tổng kinh phí của đề tài là 20 triệu đồng, chúng tôi chỉ có khả năng tiến hành trên đối tượng thực phẩm là mẫu sữa bột, sữa chua, sữa đặc, bánh quy và siro

3 Nội dung và phương pháp

Để đáp ứng với mục tiêu nói trên chúng tôi thực hiện các nội dung sau đây:

- Khảo sát điều kiện chạy dung dịch chuẩn vitamin D2 và vitamin D3

- Xác định giới hạn phát hiện (LOD)

detector PDA và các thiết bị phụ trợ khác như máy cất quay, máy lọc hút chân không đáp ứng tốt cho việc phân tích nên chúng tôi đã chọn phương pháp này để nghiên cứu Đây là phương pháp có nhiều ưu điểm và hiện nay

Hình 3: Mô tả quá trình chạy sắc ký

4.2 Hệ thống HPLC:

Hệ thống HPLC bao gồm các bộ phận chính được mô tả dưới đây

Rửa giải qua cột

Quá trình sắc ký

Sắc đồ Pha động

Pha tĩnh

6: Bình chứa dung môi thải

7: Hệ thống máy tính ghi dữ liệu phân tích

Trong đề tài này chúng tôi sử dụng detector mảng diod (DAD) và chạy sắc ký pha ng−ợc (pha động phân cực, pha tĩnh ít phân cực) để xác

- Phương pháp chuẩn hoá diện tích

Trong đề tài này chúng tôi sử dụng phương pháp chuẩn ngoại để phân tích

Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản trong đó dung dịch chất chuẩn và mẫu thử được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Sau đó so sánh diện tích pic hoặc chiều cao của mẫu thử với diện tích pic hoặc chiều cao dung dịch chất chuẩn để tính nồng độ chất có trong mẫu

Có thể dùng phương pháp chuẩn hoá một điểm hoặc nhiều điểm

* Chuẩn hoá một điểm (phương pháp so sánh):

Chọn nồng độ dung dịch chất chuẩn gần bằng nồng độ mẫu thử, tính theo công thức sau

S

C S

C

s

s x

x =

Trong đó: Cx nồng độ mẫu thử

Cs nồng độ dung dịch chất chuẩn

Sx diện tích hoặc chiều cao pic mẫu thử

Ss diện tích hoặc chiều cao pic dung dịch mẫu chuẩn

* Chuẩn hoá nhiều điểm:

Chuẩn bị dãy dung dịch các chất chuẩn với nồng độ tăng dần tiến hành chạy sắc ký Vẽ đồ thị liên quan giữa diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ mỗi chất chuẩn Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính nồng độ các chất cần xác định Thực hiện việc tính toán này theo hai cách

- áp diện tích hoặc chiều cao pic vào đường chuẩn để suy ra nồng độ của chất trong mẫu

Hình 5: Đồ thị tương quan diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ

- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính Y= a + b C

Trong đó :

Y Diện tích hay chiều cao pic

a Giao điểm của đường chuẩn với trục tung

b Độ dốc của đường chuẩn

6 Quy trình phân tích thử nghiệm

Sau khi đã tham khảo các tài liệu chúng tôi đã thống nhất xây dựng quy trình phân tích dự kiến và sử dụng các hoá chất thiết bị nh− sau phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

6.2 Hoá chất sử dụng

- Dung môi methanol của Merck loại dùng cho HPLC

- Dung môi tetra hydrofuran THF của Merck

- Dung môi ethanol loại PA của Trung quốc

- Dung môi ete dầu hoả loại PA của Trung quốc (30-60)

- Dung dịch muối natri clorid 5% loại PA của Trung quốc

- Dung môi ethanol tuyệt đối loại PA của Merck

- Chất chống ô xi hoá Tert butyl hydroquinol (TBHQ) PA của Trung quốc

6.3 Thiết bị và dụng cụ

- Hệ thống HPLC của Thermo Finnigan với detector DAD

- Cột Inertsil ODS -3, 5àm, 250 x4,0 mm của Japan

- Cột tách chiết ODS 2 của Waters Spherisorb 5àm; 4,0 x150mm

- Cân phân tích XT 220 của Thuỵ sĩ độ chính xác 10- 4g

- Máy quang phổ UV-VIS của Nhật

- Máy cất quay chân không loại Eyela của Nhật

6.4.1 Pha dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn vitamin D2 gốc 100 ppm: Cân trên cân phân tích 0,0100g vitamin D2 cho vào bình định mức 100ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi ethanol của Merck

- Dung dịch chuẩn trung gian vitamin D2 nồng độ 1ppm: Lấy 1ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 100 ml pha loãng bằng ethanol đến vạch

- Dung dịch chuẩn vitamin D3 gốc 100 ppm: Cân trên cân phân tích 0,0100g vitamin D2 cho vào bình định mức 100ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi ethanol của Merck

- Dung dịch chuẩn trung gian vitamin D3 nồng độ 1ppm: Lấy 1ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 100 ml pha loãng bằng ethanol đến vạch

- Xác định lại nồng độ các dung dịch chuẩn trung gian trên

Sử dụng máy quang phổ UV-VIS đo độ hấp thụ (Abs) của mỗi dung dịch chuẩn trung gian vitamin D2, D3 ở bước sóng 265 nm Tính nồng độ thực của dung dịch chuẩn (C) với hệ số ε = 18466 với vitamin D3 và ε = 18843 với vitamin D2

- Pha loãng các dung dịch chuẩn trung gian thành các dung dịch chuẩn làm việc với nồng độ khác nhau để xây dựng đường chuẩn

6.4.2 Chuẩn bị mẫu phân tích

- Mẫu được đồng nhất kỹ trước khi xử lý: Đối với mẫu rắn phải xay hoặc nghiền kỹ và trộn đều Mẫu dạng bột, lỏng, sệt phải được trộn khuấy kỹ

- Cân khoảng 0,5- 50 g mẫu độ chính xác 0,1g cho vào lọ nhựa

- Mẫu được xà phòng hoá bằng cách cho thêm 40 ml ethanol, 25 ml KOH

80 % , khoảng 0,1 g TBHQ, xà phòng hoá ở 75 0C trong 1 giờ hoặc ở nhiệt

độ phòng qua đêm

- Chiết các chất không xà phòng hoá bằng ete dầu hoả, hai lần mỗi lần 25

ml Tập hợp lớp ete vào phễu chiết khác

- Rửa sạch lớp ete bằng dung dịch NaCl 5 % đến khi dung dịch trung tính

- Lớp ete cho vào bình cất quay và chưng cất đến còn khoảng 5ml

- Làm sạch qua cột SPE - Si loại 6ml:

Các bước làm sạch:

+ Cột được ổn định bằng 4 ml dung môi ethyl acetat: n-hexan = 7:73

+ Sau đó nạp dung dịch chiết mẫu ở trên vào cột

+ Rửa giải bằng 20 ml dung dịch ethyl acetat : n-hexan = 7:73

+ Dung dịch rửa giải được cất quay đến cạn

+ Hoà cặn còn lại bằng 1ml pha động lấy dung dịch bơm vào cột HPLC

6.4.3 Điều kiện chạy sắc ký dự kiến như sau

- Hệ thống HPLC của Thermo Finnigan

- Cột tách chiết pha ngược Inertsil ODS 3 và Waters RP18

- Căn cứ vào đường chuẩn để tính hàm lượng vitamin D trong mẫu theo công thức sau

Trong đó:

V: Thể tích dịch chiết cuối cùng để chạy sắc ký HPLC (ml)

Cm: Nồng độ dung dịch chiết mẫu tính theo đường chuẩn (àg/ml)

m: Khối lượng của mẫu phân tích (g)

X: Hàm lượng Vitamin D trong mẫu thử (àg/g)

PhÇn 4: KÕt qu¶ nghiªn cøu

1 Kh¶o s¸t chän ®iÒu kiÖn ch¹y s¾c ký chuÈn vitamin D 2 vµ vitamin D 3

Hình 9: Dạng phổ hấp thụ UV của vitamin D 3

Bảng 1 : Thời gian lưu của vitamin D 2 và D 3 với điều kiện chạy cột Waters RP- 18, detector DAD bước sóng 265nm, pha động MeOH: H 2 O =

98: 2, tốc độ dòng 1ml/phút

Name Retention T ime Area

Height

Hình 11: Sắc đồ chuẩn của vitamin D 0,04 ppm cột 3Waters RP-18

Bảng 2 : Thời gian lưu của vitamin D 2 chạy cột Inertsil ODS 3 và cột

Waters RP-18, detector DAD bước sóng 265nm, pha động ACN : MeOH

=75: 25, tốc độ dòng 1ml/phút

Cột Waters RP-18

theo chúng tôi sẽ tiến hành trên cột ODS 3

Thí nghiệm 3:

Khảo sát điều kiện chạy sắc ký vitamin D3 và D2 cột Inertsil ODS 3, detector DAD bước sóng 265nm, pha động là ACN : MeOH = 75:25, tốc độ dòng 1ml/phút