Xác định dư lượng Penicillin G và V trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Header Page of 120 Bé y tÕ viÖn dinh d−ìng -Z”Y - báo cáo tổng kết đề tài xác định d lợng penicillin g v thực phẩm phơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao Chủ nhiệm đề tài: ThS Trần quang thủy 7106 16/02/2009 Hà Nội - 2008 luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 MỞ ĐẦU An toàn vệ sinh thực phẩm đặt lên hàng đầu công tác bảo vệ sức khoẻ người Trong tiến trình gia nhập WTO, thị trường hàng hoá Việt nam mở rộng, đặc biệt lĩnh vực xuất mặt hàng nông sản, thuỷ sản Tuy nhiên, việc kiểm sốt dư lượng hố chất kháng sinh có hại đến sức khoẻ người tiêu dùng chưa thực nghiêm túc nên số lô hàng bị thị trường nhập phát kháng sinh có hại cao Tình trạng khơng gây thiệt hại lớn kinh tế cho doanh nghiệp mà ảnh hưởng nghiệm trọng đến uy tín chất lượng hàng Việt nam thị trường giới Trong chăn nuôi nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh (trong thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm) phổ biến coi tiến công nghệ sinh học Thế nhưng, việc tuỳ tiện sử dụng thuốc kháng sinh dễ dẫn đến hậu quả: Lượng thuốc kháng sinh tồn dư sản phẩm vượt ngưỡng cho phép, người sử dụng loại thực phẩm thời gian dài gây nguy hại cho sức khoẻ Penicillin kháng sinh hệ có tính kháng khuẩn mạnh nhiều loại vi khuẩn Ban đầu, hoan nghênh thứ thuốc thần kì cứu sống vơ số người chiến tranh giới thứ hai Mặc dù Penicillin đóng vai trò quan trọng việc chống lại nhiều bệnh tật cho người loài động vật, việc lạm dụng chăn ni dẫn đến tượng nhờn thuốc, giảm khả kinh tế vật nuôi, gây thiệt hại cho người chăn nuôi Hơn tồn dư Penicillin sản phẩm chăn ni gây nhiều vấn đề nghiêm trọng như: ngộ độc, biến đổi hệ vi khuẩn người tiêu dung làm cho người tiêu dung bị kháng thuốc… Việc phát triển kĩ thuật xác định lượng tồn dư Penicillin thực phẩm phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm nước trở thành công cụ hữu hiệu giúp quan chức kiểm soát tốt vấn đề đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm Trong đề tài nghiên cứu phương pháp xác định dư lượng Penicillin thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Phương pháp có độ nhạy, độ chọn lọc độ xác cao luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu kháng sinh nhóm Penicillin 1.1.1 Đại cương Năm 1928, Alexander Fleming phát nấm mốc thuộc giống Penicillium ức chế phát triển vi khuẩn Fleming gọi chất kháng khuẩn chưa biết tới Penicillin 10 năm sau, nhóm nhà khoa học thuộc trường Đại học Oxford bắt đầu nghiên cứu chất chuột thí nghiệm Penicillin hoan nghênh thứ thuốc thần kỳ cứu sống vô số người chiến tranh giới thứ II [5] Penicillin kháng sinh thể hệ có tính kháng khuẩn mạnh nhiều loại vi khuẩn Penicillin chiết từ dịch nuôi cấy nấm Penicillium chrysogenum Penicillin lần phát có tác dụng chống vi khuẩn gram dưng Staphylococcus, Diplococcus khơng có tác dụng chống vi khuẩn gram âm nấm men Vài thập niên trở lại phát nhiều loại pencillin số có hiệu chống lại vi khuẩn gram âm nấm men Saccharomyces cerevisae đơn bội E.coli [5] 1.1.2 Phân loại Pencillin gồm nhiều loại, chúng có cấu tạo gần giống nhau, bao gồm vòng tiasolidin, vòng β-lactam, nhóm amino có gắn với CO2 mạch bên (R) Hai loại Penicillin tổng hợp benzylpenicillin(PenicillinG; R = C6H5CH2-) Phenoxymethylpenicillin (PenicillinV; R = C6H5OCH2-) Và số loại bán tổng hợp: Amoxycillin, Ampicillin, Oxacillin, Cloxacillin [5] Mạch bên Vòng thiazolindine Vòng -lactam Hỡnh 1: Cu trúc chung penicillin Sự khác biệt rõ ràng penicillin bao gồm khác biệt phổ hoạt động chúng Penicillin muối dạng liều khác nhau, ampicillin, amoxicillin có hoạt tính chống lại vi khuẩn hiếu khí gram dương số vi khuẩn kỵ khí Các chất dễ bị beta-lactamase phá huỷ khơng có hiệu chống tụ cầu vi khuẩn kỵ khí sản sinh beta-lactamase Ampicillin amoxicillin có hoạt tính chống lại số vi khuẩn hiếu khí gram âm Amoxicillin thay penicillin V làm loại penicillin lý tưởng để phòng viêm nội tâm mạc sinh khả dụng ưu việt luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 1.1.3 Tác dụng Penicillin Giống họ kháng sinh khác, penicillin có tác dụng kìm hãm tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh Cơ chế tác dụng chung sau: Peptidoglycan thành phần tạo nên tính vững vách tế bào vi khuẩn Quy trình tổng hợp peptidoglycan thực nhờ enzym D-alanin transpeptidase Do axit, penicillin có khả acyl hố D-alanin transpeptidase, làm cho enzym tham gia vào trình tổng hợp peptidoglycan Sinh tổng hợp vách tế bào bị gián đoạn, vi khuẩn tồn Mặt khác, penicillin hoạt hố enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân huỷ vách tế bào vi khuẩn, kết vi khuẩn bị tiêu diệt 1.1.4 Tác hại penicillin tồn dư thực phẩm Phần lớn kháng sinh an toàn sử dụng Tuy nhiên dù hay nhiều chúng gây tác dụng không mong muốn tai biến Penicillin kháng sinh độc, tác dụng không mong muốn, ngoại trừ phản ứng dị ứng Các sản phẩm phân huỷ kết hợp với protein tạo thành kháng nguyên nguyên nhân dị ứng tuỳ theo địa người phản ứng mức độ ¾ Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh thực phẩm sau: Một là, nhiễm lẫn vào thức ăn tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh tồn dư lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh chăn nuôi + Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho gia súc + Kháng sinh cho vào nước uống để phòng bệnh mùa dịch bệnh + Kháng sinh cho vào nước uống để chữa bệnh gia súc + Kháng sinh cho thêm vào thức ăn cho gia súc để bảo quản súc sản lâu hư + Kháng sinh tiêm vào súc vật cho súc vật uống trước giết thịt với mục đích kéo dài thời gian, tránh hư hỏng thịt tươi Hai là, cho thẳng vào thực phẩm với mục đích ức chế, tiêu diệt vi sinh vật để bảo quản thực phẩm Do vận chuyển sản phẩm xa, cho kháng sinh vào thực phẩm để bảo quản Tất nguyên nhân làm cho sản phẩm chăn nuôi, thủy sản tồn dư kháng sinh, có ảnh hưởng khơng tốt người tiêu thụ 1.2 Giới thiệu Penicillin G Penicillin V 1.2.1 Thông tin chung luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 Bảng1: Thông tin chung penicillin G V Penicillin Danh pháp (KLPT) (IUPAC) Penicillin G (334,4) Penicillin V (350,39) Cấu trúc hóa học (2S,5R,6R)-3,3-dimethyl-7oxo-6-[(2phenylacetyl)amino]-4thia-1azabicyclo[3.2.0]heptane-2carboxylic acid pKa T1/2 2,76 (2S,5R,6R)-3,3-dimethyl-7oxo-6-[[2(phenoxy)acetyl]amino]-4thia-1azabicyclo[3.2.0]heptane-2carboxylic acid 2,73 30 40 phút 1.2.2 Tính chất tác dụng Penicillin G Penicillin V hai penicillin tự nhiên thu từ môi trường nuôi cấy nấm penicillium chrysogenum Chúng định bệnh nhiễm khuẩn thông thường: nhiễm khuẩn đường hô hấp, tai mũi họng, nhiễm khuẩn huyết… Penicillin G V có độc tính thấp, giống penicillin khác dễ gây dị ứng thuốc: mẩn ngứa, mày đay, ngoại ban, hội chứng Stevens- johnson Lyell, nguy hiểm shock phản vệ Ngồi gây viêm tĩnh mạch huyết khối, thiếu máu tan máu, giảm bạch cầu 1.2.3 Tình hình sử dụng Penicillin Mặc dù thuốc kháng sinh đóng vai trò quan trọng việc chống lại nhiều bệnh tật cho người loài gia súc, gia cầm loài thủy sinh, việc sử dụng bừa bãi chăn ni gây nhiều vấn đề nghiêm trọng gây độc, biến đổi hệ vi khuẩn người tiêu dùng làm cho người tiêu dùng bị kháng thuốc Theo số liệu viện Thú y Mỹ (AHI), lượng kháng sinh sử dụng chăn nuôi Mỹ năm 1999 khoảng 20,42 triệu Pao (9270 tấn), kháng sinh luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 nhóm Lonophore Arsen chiếm nhiều (47,5%) Tetracycline (15,67%), Penicillin (4,26%), loại khác (32,57%) Theo báo cáo Uỷ ban sử dụng dược phẩm thức ăn chăn nuôi trực thuộc Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia( NRC) (Mỹ), thiệt hại lệnh cấm sử dụng kháng sinh thức ăn chăn ni lên tới 2,5 tỷ USD năm Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cảnh báo hiểm hoạ mà loài người phải đối mặt kháng kháng sinh vi khuẩn gây bệnh gây WHO thúc đẩy chương trình khuyến cáo tất nước tiến tới cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh chất kích thích sinh trưởng Tại Việt Nam, theo kết điều tra sơ Viện khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp Việt Nam cho thấy: có tới 75% số mẫu thịt 66,7% số mẫu gan gia súc, gia cầm bán chợ có mức tồn dư kháng sinh vượt ngưỡng cho phép 1.2.4 Giới hạn cho phép Trước tình hình chất kháng sinh sử dụng tràn lan dẫn đến tồn dư thực phẩm có nguy gây hại cao cho sức khỏe người tiêu dùng, nhiều nước giới đưa giới hạn cho phép dư lượng penicillin loại thực phẩm sau: Bảng 2: Giới hạn cho phép tồn dư penicillin G V thực phẩm Việt nam [6] TCN thuỷ sản Quốc gia EU Penicillin G Sũa Gan, bầu dục Thịt Thịt Gan Thận Sũa 50 50 50 50 50 (ppb) Penicillin V Thịt (ppb) 25 (46/2007/QĐ-BYT) 50 1.3 Các phương pháp xác định Penicillin 1.3.1 Trong nước Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5147-90 [9] qui định phương pháp gián tiếp sử dụng quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS xác định Penicillin tổng số thịt sản phẩm thịt, dùng làm thực phẩm cho người thức ăn gia súc Phương pháp dựa vào phản ứng tạo phức đặc trưng hoàn toàn định lượng cadimi với thuốc thử phenaltrolin-cadimi sinh phức bền Chiết phức nitrobenzen đo phổ hấp thụ luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 nguyên tử AAS kim loại cadimi phức pha hữu cơ, hay phân hủy pha hữu lấy cadimi vào dung dịch HCl 1% đo phổ cadimi Phương pháp phức tạp, không đặc trưng xác định lượng tổng Penicillin Tiêu chuẩn ngành thuỷ sản TCN 197-2004 [8] qui định phương pháp định lượng Penicillin sản phẩm thuỷ sản sắc ký lỏng hiệu cao Penicillin sản phẩm thuỷ sản tách khỏi mẫu dung dịch đệm phosphat, pH 9, làm cô đặc dịch chiết cột Bond Elut C18, dẫn xuất hoá định lượng sắc ký lỏng hiệu cao với detector PDA Qui trình trải qua trình dẫn xuất phức tạp dừng lại phạm vi thuỷ sản 1.3.2 Thế giới a) Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS Tác giả Titus A.M.Msagati [13] cộng xác định dư lượng β-lactam thực phẩm sắc ký lỏng - khối phổ Các tác giả chiết làm mẫu sử dụng hỗn hợp đệm phosphat, tetraethylammonium clorua Et4NCl acetonitril Sau đó, β-lactam tách định lượng sắc ký lỏng khối phổ chế độ ion dương (LC-PI-ESI-MS) Giới hạn phát phương pháp Penicillin G penicillin V gan bầu dục ng/kg ; sữa 0,7 µg/L b) Phương pháp sắc ký lỏng cặp ion với detector UV Tác giả Yuko Ito [14] cộng thuộc Viện sức khỏe cộng đồng (Nhật Bản) ứng dụng kĩ thuật làm qua cột trao đổi ion để xác định penicillin: Penicillin G, Penicillin V, Oxacillin, Cloxacillin, Nafcillin, dicloxacillin thịt Các penicillin chiết khỏi mẫu thịt lợn với nước, mẫu thịt bò với NaCl 2%, làm qua cột chiết pha rắn trao đổi ion xác định sắc ký lỏng cặp ion với detectơ tử ngoại Hiệu suất thu hồi phương pháp từ 73 - 95% Giới hạn phát phương pháp cho penicillin 0,02 mg/kg c) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Tác giả E.Benito-Pena [11] cộng thuộc trường đại học Madrid (Tây Ban Nha) phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với detectơ tử ngoại – diot aray (UV-DAD) để xác định đồng thời kháng sinh nhóm beta-lactam (Penicillin G, amoxicillin, ampicillin, Penicillin V, axacillin, dicloxacillin, nafcillin) nước thải Hai kĩ thuật SPE so sánh cho trình làm làm giàu mẫu: cột silica pha đảo C18 cột trao đổi anion hỗn hợp MAX Các penicillin định lượng sắc ký lỏng sử dụng cột tách C18, chương trình rửa giải gradient phát với detectơ tử ngoại bước sóng 220nm Cột MAX cho hiệu suất thu hồi cao hơn, nằm khoảng 82 – 97% giới hạn phát từ – 24 ng/L luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 Tác giả Lambert K Sorensen [12] cộng ( Đan Mạch ) đưa quy trình xác định đồng thời penicillin thịt, gan, bầu dục gia súc lợn phương pháp HPLC Các penicllin tách khỏi mẫu H2O, loại tạp chất hữu với hỗn hợp acid sulphuric natri tungstat Dịch chiết làm qua cột chiết pha rắn Oasis HLB, dẫn xuất hoá với anhydric benzoic, 1, 2, - triazole HgCl2 Các penicillin tách định lượng cột C18, chương trình rửa giải gradient phát detectơ tử ngoại bước sóng 323nm Giới hạn phát LOD phương pháp từ 8,9-11,1 µg/kg amoxicillin, penicillin G, ampicillin, oxacillin, nafcillin 18,320,9 µg/kg cho đicloxacillin luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng mục tiêu nghiên cứu Trong chăn nuôi nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh (trong thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm) phổ biến coi tiến công nghệ sinh học, nhằm làm vật nuôi mau lớn Thế nhưng, việc tuỳ tiện sử dụng thuốc kháng sinh dễ dẫn đến hậu quả: Lượng thuốc kháng sinh tồn dư sản phẩm vượt ngưỡng cho phép, người sử dụng loại thực phẩm thời gian dài gây nguy hại cho sức khoẻ Mục tiêu đề tài là: Xây dựng phương pháp xác định penicillin G V với độ nhạy độ xác cao Phân tích số mẫu thực tế để thẩm định lại qui trình 2.2 Phương pháp nghiên cứu Việc phát triển kỹ thuật xác định dư lượng penicillin G V thực phẩm cần thiết giúp cho quan chức kiểm soát tốt việc sử dụng kháng sinh chăn nuôi Để phù hợp với điều kiện hầu hết phòng thí nghiệm nước, chúng tơi lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với detectơ tử ngoại để phát định lượng penicillin G V Cơ sở lí thuyết phương pháp tóm tắt đây: 2.2.1 Nguyên tắc chung phương pháp HPLC Sắc ký lỏng trình tách xảy cột tách với pha tĩnh chất rắn pha động chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn)[4].Mẫu phân tích chuyển lên cột tách dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, chất phân tích phân bố liên tục pha động pha tĩnh Trong hỗn hợp chất phân tích, cấu trúc phân tử tính chất lí hố chất khác nhau, nên khả tương tác chúng với pha tĩnh pha động khác Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác tách khỏi Hình 2: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page 10 of 120 Cũng tất thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC hình dung gồm phần chính: - Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn mẫu phân tích - Phần tách: phần trung gian hệ sắc ký bao gồm cột tách, đơi có cột phụ trợ - Phần phát xử lí số liệu: phần bao gồm detector, phần khuếch đại, computer phần mềm xử lí số liệu, phận ghi tín hiệu • Sắc ký lỏng hiệu cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, sắc ký lỏng pha liên kết; sắc ký trao đổi ion; sắc ký cặp ion, sắc ký điện di mao quản; sắc ký phân bố lỏng-lỏng; sắc ký rây phân tử Phương pháp sử dụng rộng rãi sắc ký lỏng pha liên kết 2.2.2 Phân tích định tính dịnh lượng HPLC Một đại lượng đặc trưng cho tách sắc ký chất hệ pha chọn thời gian lưu chất Nghĩa hệ pha điều kiện tách HPLC chọn chất phân tích có thời gian lưu khác cố định Chính đại lượng tính chất hay thơng số để định tính chất hỗn hợp mẫu Vì vậy, sau chọn điều kiện tối ưu cho trình sắc ký, tiến hành ghi sắc đồ mẫu phân tích, xác định thời gian lưu pic ứng với chất sắc đồ Sau so sánh thời gian lưu chất phân tích với thời gian lưu chất chuẩn, từ xác định mẫu phân tích có chất Trong HPLC dùng phương pháp phương pháp đường chuẩn phương pháp thêm tiêu chuẩn để định lượng Việc dùng phương pháp hai phương pháp tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích hàm lượng chất phân tích Hi = k1.Ci Si = k2 Ci Hi, Si chiều cao pic diện tích pic tương ứng chất i Ci nồng độ chất i K1, k2 số thực nghiệm Phương pháp đường chuẩn có ưu điểm phân tích hàng loạt mẫu đối tượng, nhanh, đơn giản, dễ làm Tuy nhiên thành phần mẫu phân tích phức tạp, việc pha dung dịch chuẩn để phù hợp với mẫu phân tích thành phần nền, thành luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 10 of 120 Header Page 26 of 120 3.3 Thẩm định phương pháp 3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đường chuẩn Hút xác dung dịch chuẩn hỗn hợp I: penG 2µg/ml, penV 4µg/ml chuẩn hỗn hợp II: penG 20µg/ml, penV 40µg/ml vào vial theo bảng sau: Bảng 8: Khảo sát khoảng tuyến tính lập đường chuẩn STT Thể tích chuẩn (µl) 50 (I) 100 (I) 150 (I) 200 (I) 250 (I) 300 (I) 350 (I) 50 (II) Thể tích đệm photphat 25mM, pH (µl) 450 400 350 300 250 200 450 400 500 500 500 500 Lắc vortex 10s Thể tích dẫn xuất (µl) 500 500 500 500 Lắc vortex 30s, rung siêu âm 55oC 30 phút Nồng độ penG (ng/ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 1,0 Nồng độ penV (ng/ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,2 1,4 Làm nguội, tiêm vào hệ thống HPLC 19057 30925 43263 53670 65440 72101 87527 Diện tích pic penV (mAU) 6319 15559 24055 32526 41017 47485 52510 61859 10 12 Minutes 14 mAU mAU PenV 14.016 34526 PenG 12.640 45263 8564 Diện tích pic penG (mAU) 16 18 20 22 24 Hình 14: Sắc đồ chuẩn hỗn hợp Pen G 0,4ppm, Pen V 0,8ppm Vẽ đồ thị mối quan hệ diện tích pic vào nồng độ chất thu đồ thị sau: luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 26 of 120 25 area area Header Page 27 of 120 Pen G 100000 80000 60000 40000 20000 0 0.5 1.5 ppm Pen V 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 0.5 1.5 2.5 ppm y = 114445x - 3235.9 R2 = 0.9995 Pen G 60000 40000 20000 0.2 0.4 0.6 y = 43182x - 2013.7 R2 = 0.9997 50000 40000 30000 20000 10000 80000 area area Hình 15: Đồ thị mối quan hệ nồng độ penicillin G V với diện tích pic Từ đồ thị ta thấy: - Bắt đầu từ nồng độ 0,7ppm mối quan hệ diện tích pic nồng độ penicillin G khơng tuyến tính Như vậy, giới hạn tuyến tính penicillin G 0,6ppm - Bắt đầu từ nồng độ 1,2ppm mối quan hệ diện tích pic nồng độ penicillin V khơng tuyến tính Như vậy, giới hạn tuyến tính penicillin V 1ppm Dựng đường chuẩn khoảng tuyến tính penicillin: 0.8 ppm 0.5 Pen V 1.5 ppm Hình 16: Đường chuẩn penicillin G V 3.3.2 Xác định giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ - Giới hạn phát định nghĩa nồng độ nhỏ chất phân tích mà có tín hiệu sắc ký lớn gấp lần tín hiệu đường (S/N = 3) [7] Sử dụng mẫu thịt không phát penicillin, thêm chuẩn hỗn hợp penicillin (bắt đầu từ giới hạn đường chuẩn), dẫn xuất tiến hành chạy sắc ký Tại nồng độ pen G 20ppb, pen V 40ppb tín hiệu chất phân tích thu lớn gấp lần tín hiệu đường Do LOD Pen G 20ppb, pen V 40ppb - Giới hạn định lượng định nghĩa nồng độ nhỏ chất phân tích mà phép phân tích định lượng xác với độ tin cậy 95% Theo lý thuyết thống kê trong hố phân tích LOQ nồng độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấp 10 lần tín hiệu đường (S/N = 10), tức LOQ = 3,33 LOD Vì giới hạn định lượng phương pháp Pen G 67ppb, Pen V 133ppb luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 27 of 120 26 10 12 14 0.0 -0.2 16 18 20 22 24 Minutes Hình 17: Sắc đồ chạy mẫu nồng độ Pen G: 60ppb, pen V: 120ppb Khuyến nghị: Do giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng thiết bị cao so với giới hạn cho phép nên q trình phân tích cần phải làm giàu mẫu 3.3.3 Độ lặp lại Một phương pháp phân tích tốt ngồi việc có sai số nhỏ yêu cầu có độ lặp lại cao Theo lý thuyết thống kê, đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại độ lệch chuẩn SD hệ số biến thiên CV Sử dụng mẫu thịt lợn không phát penicillin, thêm mức chuẩn khoảng đầu, cuối đường chuẩn Tại mức thêm chuẩn, phân tích lặp lần Tính độ lệch chuẩn SD hệ số biến thiên CV theo công thức sau: SD = ∑ (S i − Stb ) CV (%) = n −1 SD × 100 S tb Trong đó: Si diện tích pic sắc ký thứ i Stb diện tích trung bình n lần chạy n số lần chạy lặp Bảng 9: Độ lặp lại Penicillin G nồng độ khác m mC Si (g) (µg) (mAU) mẫu thực 5,5048 KPH 1a 4,9469 0,1 6950 1b 5,1623 0,1 5723 1c 5,2144 0,1 6001 2a 5,0781 0,4 33071 2b 4,9465 0,4 35685 Mẫu luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 28 of 120 27 Smedian SD CV (%) 6001 643,4 10,7 35685 3178,3 8,9 mAU PenV 13.931 3220 0.0 PenG 12.576 5562 0.2 -0.2 mAU 0.2 Header Page 28 of 120 Header Page 29 of 120 2c 5,2148 0,4 39396 3a 5,3462 0,6 58896 3b 5,4301 0,6 55563 3c 5,0125 0,6 61423 55563 2939,2 5,3 Bảng 10: Độ lặp lại Penicillin V nồng độ khác m mC Si (g) (ng) (mAU) mẫu thực 5,5048 KPH 1a 4,9469 0,2 5560 1b 5,1623 0,2 6012 1c 5,2144 0,2 5026 2a 5,0781 0,6 20168 2b 4,9465 0,6 23056 2c 5,2148 0,6 20373 3a 5,3462 36094 3b 5,4301 35896 3c 5,0125 34268 Mẫu Smedian SD CV (%) 5560 493,5 8,9 20373 1611,5 7,9 35896 1001,9 2,8 Theo AOAC, CV% cho phép cấp độ 100ppb 15%, 1ppm 11% Tại nồng độ penicillin thấp, độ dao động kết lớn Tuy nhiên, cấp độ khảo sát, CV% phương pháp nằm khoảng – 10% phù hợp với yêu cầu AOAC 3.3.4 Độ thu hồi Từ kết khảo sát độ lặp lại, tính hiệu suất thu hồi phương pháp theo công thức sau : C= C '.V m H= (Cm+c − Cm ) × m × 100 mc Trong đó: C: nồng độ Penicillin xác định (µg/g) C': nồng độ Penicillin tính từ đường chuẩn (µg/ml) V: thể tích định mức trước bơm vào HPLC ( V = 1ml) luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 29 of 120 28 Header Page 30 of 120 m: khối lượng mẫu (g) Cm+c : nồng độ Penicillin xác định mẫu thêm chuẩn (µg/g) Cm: nồng độ Penicillin có mẫu (µg/g) mc: lượng Penicillin thêm vào (µg) Bảng 11: Hiệu suất thu hồi pen G nồng độ khác Mẫu mC (µg) Stb (mAU) C’ (µg/ml) mẫu thực KPH KPH mẫu 0,1 6224 0,083 83 mẫu 0,4 36050 0,343 86 mẫu 0,6 58627 0,541 90 H (%) Bảng 12: Hiệu suất thu hồi pen V nồng độ khác Mẫu mC (µg) Stb (mAU) C’ (µg/ml) H (%) mẫu thực KPH KPH mẫu 0,2 5532 0,175 87 mẫu 0,6 21199 0,538 89 mẫu 1,0 35419 0,867 87 Nhận xét: Theo AOAC, hiệu suất thu hồi cho phép cấp độ 100ppb – 1ppm 80 – 110% Độ thu hồi trung bình penicillin G 83 – 90%, penicillin V 87 – 89% Như vậy, phương pháp có độ thu hồi nằm giới hạn cho phép AOAC 3.4 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế Chúng xác định Penicillin G V nhóm đối tượng: nhóm gia súc (thịt, gan, bầu dục lợn, bò); nhóm gia cầm (thịt gà, thịt ngan, thịt vịt); nhóm thuỷ hải sản (một số loại tơm, cá) để thẩm định lại qui trình Các mẫu lấy ngẫu nhiên số cửa hàng địa bàn nội thành Hà nội Chọn mẫu kĩ thuật lấy mẫu theo TCVN 48331:2002 Mỗi loại mẫu lấy cửa hàng, trộn phân tích Mỗi mẫu sau trộn, phân tích lặp lại lần có kèm mẫu thêm chuẩn để xác định độ lặp độ thu hồi đối tượng mẫu thu bảng kết sau: luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 30 of 120 29 Header Page 31 of 120 Bảng 13: Kết phân tích số mẫu thực tế Diện tích pic PenG Diện tích pic PenV Nồng độ Pen G Nồng độ Pen V (ng/g) (ng/g) - - KPH KPH 0 - - KPH KPH 5,1286 0 - - KPH KPH d 5,7654 0,15 0,6 11493 21063 a 5,2348 0 - - KPH KPH b 5,1463 0 - - KPH KPH c 5,0024 0 - - KPH KPH d 5,3527 0,15 0,6 10973 18957 a 5,1497 0 - - KPH KPH b 4,6825 0 - - KPH KPH c 5,1396 0 - - KPH KPH d 5,0782 0,15 0,6 12755 22096 a 5,1463 0 - - KPH KPH b 5,2224 0 - - KPH KPH c 5,1782 0 - - KPH KPH d 5,3323 0,15 0,6 10768 19975 a 5,1478 0 - - KPH KPH Thịt b 5,2563 0 - - KPH KPH vịt c 5,9872 0 - - KPH KPH d 5,4481 0,15 0,6 11041 18992 a 5,6284 0 - - KPH KPH b 5,1326 0 - - KPH KPH Khối lượng cân mc mc (PenG) (PenV) (g) (ng) (ng) a 5,0163 Thịt b 5,4201 bò c Đối tượng Thịt lợn Thịt gà Thịt ngan Bầu dục Mẫu luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 31 of 120 30 Hiệu suất thu hồi PenG Hiệu suất thu hồi PenV (%) (%) 86 89 83 81 93 93 82 85 83 81 Header Page 32 of 120 lợn c 5,5542 0 - - d 5,2563 0,25 22853 36459 a 5,5786 0 - - KPH KPH b 5,6582 0 - - KPH KPH c 5,4263 0 - - KPH KPH d 5,7825 0,25 20795 35597 a 5,0152 0 - - KPH KPH Cá b 5,0562 0 - - KPH KPH nục c 5,1275 0 - - KPH KPH d 5,4681 0,2 0,8 15039 28534 a 5,7824 0 - - KPH KPH Cá b 5,0100 0 - - KPH KPH trôi c 5,1437 0 - - KPH KPH d 5,5210 0,2 0,8 16042 29014 a 5,1287 0 - - KPH KPH b 5,6813 0 - - KPH KPH c 5,0172 0 - - KPH KPH d 5,0500 0,2 0,8 15539 27685 Gan lợn Tôm KPH KPH 91 89 84 87 80 88 84 90 82 86 (PenV) (PenG) mAU mAU Trong số 10 loại mẫu (bao gồm: thịt lợn, thịt bò, gan lợn, gan bò, bầu dục lợn, thịt gà, thịt ngan, thịt vịt, tôm, cá) mẫu phát có penicillin G V Hiệu suất thu hồi nằm khoảng 80 - 93% 0 10 12 Minutes Hình 18: Sắc đồ mẫu gan lợn luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 32 of 120 31 14 16 18 20 1.0 0.0 0.5 0.0 10 12 14 16 18 20 22 24 Minutes 10 12 14 1.5 mAU 1.5 0.5 PenV 14.549 28534 2.0 2.0 PenG 13.152 15039 2.5 2.5 1.0 mAU Hình 19: Sắc đồ mẫu thịt gà thêm chuẩn 0,15ng penG 0,6ng penV 1.0 0.5 16 18 20 22 24 Minutes Hình 20: Sắc đồ mẫu cá nục thêm chuẩn 0,2ng PenG 0,8ng PenV 10 12 PenV 14.656 36459 14 mAU mAU PenG 13.237 22853 16 18 20 22 24 Minutes Hình 21: Sắc đồ mẫu bầu dục lợn thêm chuẩn 0,25ng PenG 1ng PenV luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 33 of 120 32 mAU PenV 14.475 22096 1.0 PenG 13.088 12755 1.5 0.5 mAU 1.5 Header Page 33 of 120 Header Page 34 of 120 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Trên sở nghiên cứu điều kiện thực nghiệm, với mục đích xây dựng phương pháp HPLC để xác định dư lượng Penicillin G V thực phẩm, kết thu sau: - Đã khảo sát chọn thông số tối ưu cho trình chạy sắc ký: chọn cột tách, chọn bước sóng phát hiện, pH pha động, thành phần pha động, chương trình rửa giải… - Đã tìm điều kiện tối ưu cho q trình xử lí mẫu, hiệu suất thu hồi đạt từ 83 ÷ 90% - Đã khảo sát khoảng tuyến tính, lập đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp, thẩm định độ lặp lại, độ thu hồi - Tiến hành phân tích 40 mẫu thịt, gan, bầu dục lợn, gà, ngan, vịt, tôm, cá…trên địa bàn thành phố Hà Nội khơng có mẫu phát có penicillin G V Từ kết thu nhận thấy phương pháp HPLC phù hợp cho việc xác định dư lượng Penicillin G V thực phẩm Đồng thời mở hướng việc dùng phương pháp xác định chất lại nhóm kháng sinh Penicillin: Amoxicillin, ampicillin, cloxacillin, nafcillin… Chúng hi vọng kết thu từ đề tài hoàn chỉnh thành thường qui xác định dư lượng penicillin G V thực phẩm, góp phần cho việc tra, kiểm tra an toàn thực phẩm, mang lại niềm tin cậy cho người tiêu dùng luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 34 of 120 33 Header Page 35 of 120 Tài liệu tham khảo [1] Lê Trung Sơn (2005), Xác định số hợp chất hữu phương pháp sắc ký lỏng có độ phân giải cao (HPLC), Luận văn thạc sĩ khoa học, 2005 [2] Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến (1999), Vi sinh vật học NXB Giáo dục [3] Nguyễn Thị Vân Thành (2006), Tách xác định đồng thời Tetracylines thức ăn gia súc phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, Khoá luận tốt nghiệp, 2006 [4] Nguyễn Văn Ri (2004), Chuyên đề phương pháp tách chất.ĐHKHTN [5] Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị (1999), Hoá sinh học NXB Giáo dục [6] QĐ 46/2007/QĐ-BYT, Quy định giới hạn tối đa nhiễm sinh học hố học thực phẩm [7] Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng chun đề thống kê hố phân tích.ĐHKHTN [8] TCN 197-2004: Penicillins sản phẩm thuỷ sản: Phưng pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu cao [9] TCVN 5147-90: Thịt sản phẩm thịt Phương pháp xác định dư lượng Penicillin [10] Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2003) Hoá học phân tích - Phần 2: Các phương pháp phân tích cơng cụ [11] E Benito-Pena, A.I Partal-Rodera (2006), Evaluation of mixed mode solid phase extraction cartridges for the preconcentration of beta-lactam antibiotics wastwater using liquid chromatography with UV-DAD detection, Analytica Chimica acta 556 415-422 [12] Lambert K Sorensen, Lena K Snor, Simultaneous determination of seven penicillins in muscle, liver and kidney tissues from cattle and pigs by multiresidue highperformance liquid chromatographic method, Journal of Chromatography B, 734 307318 [13] Titus A.M Msagati (2007), Determination of ò-lactam residues in foodstuffs of animal origin using supported liquid membrane extraction and liquid chromatographymass spectrometry, Food Chemistry 100 836-844 [14] Yuko Ito, Yoshitomo Ikai, Hisao Oka (1999), Application of ion-exchange cartridge clean-up in food analysis II Determination of benzylpenicillin, phenoxymethylpenicillin, oxacillin, cloxacillin, nafcillin and dicloxacillin in meat using liquid chromatography with ultraviolet detection, Journal of Chromatography A, 855 247-253 luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 35 of 120 34 Header Page 36 of 120 Thường quy kĩ thuật Xác định dư lựơng penicillin G V thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Nguyên tắc Penicillin G V tách khỏi mẫu nước cất, loại tạp chất hữu hỗn hợp acid sulphuric natri tungstat, làm qua cột chiết pha rắn SPE, dẫn xuất với hỗn hợp 1,2,4-triazole thuỷ ngân (II) clorid, phát định lượng sắc ký lỏng hiệu cao với detectơ tử ngoại Phạm vi áp dụng Phương pháp áp dụng cho thịt, gan, thận gia súc, gia cầm, thuỷ hải sản Thiết bị,dụng cụ hoá chất 3.1 Thiết bị, dụng cụ - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao HPLC với detectơ PDA UV-VIS - Cột sắc ký C18 (250mm × 4,6mm × 5µm) - Hệ chiết pha rắn - Cột chiết pha rắn Polymeric (500mg, 6ml) - Máy cất quay chân không - Máy lắc vortex - Máy li tâm, đạt tốc độ 6000 vòng/phút - Máy đồng mẫu - Máy đo pH - Bể điều nhiệt - Cân phân tích điện tử (độ xác 0,00001g) - Cân phân tích (độ xác 0,0001g) - Cân kĩ thuật (độ xác 0,01g) - Cốc có mỏ loại dung tích 50, 100, 250 ml - Bình định mức thuỷ tinh loại dung tích 10, 20, 100 ml, lít lít - Vial loại 1,8 ml - Pipetman loại 200, 1000 ml đầu tuyp - Ống li tâm dung tích 50 ml luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 36 of 120 35 Header Page 37 of 120 Chú thích: Có thể dùng loại thiết bị, dụng cụ tương đương khác 3.2 Hố chất Các loại hóa chất dùng phương pháp thuộc loại tinh khiết phân tích - Chuẩn Benzyl penicillin (Penicillin G) (từ Sigma) Penicillin G sodium salt (C16H17N2NaO4S) - Chuẩn phenoxymetyl penicillin Kali (Penicillin V) (viện kiểm nghiệm thuốc trung ương) C16H17KN2O5S (98,90%) - Acetonitril - Methanol - Natri tungstat (Na2WO4) - Thuỷ ngân (II) clorid (HgCl2) - 1,2,4- triazole (C2H3N3) - Natri thiosulfat (Na2S2O3) - Natri hydroxid (NaOH) - Natri clorid (NaCl) - Kali dihydro photphat (KH2PO4) - Dikali hydro photphat (K2HPO4) - Acid sulfuric (H2SO4) 3.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch thử 3.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Penicillin G - Dung dịch chuẩn gốc Penicillin G 1000mg/l: cân xác 0,10000g chuẩn Penicillin G, hoà tan định mức nước cất đến 100 ml - Dung dịch chuẩn trung gian Penicillin G 10 mg/l: hút xác 1ml dung dịch chuẩn gốc penicillin G 1000 mg/l cho vào bình định mức 100ml định mức đến vạch nước cất 3.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Penicillin V - Dung dịch chuẩn gốc Penicillin V 1000mg/l: cân xác 0,1g chuẩn Penicillin V, hoà tan định mức nước cất đến 100 ml - Dung dịch chuẩn trung gian Penicillin V 10 mg/l: hút xác 1ml dung dịch chuẩn gốc penicillin V 1000 mg/l cho vào bình định mức 100ml định mức đến vạch nước cất luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 37 of 120 36 Header Page 38 of 120 3.3.3 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc I (Penicillin G 2µg/ml, Penicillin V 4µg/l): hút xác 1ml dung dịch chuẩn trung gian Penicillin G 10 mg/l, 2ml penicillin V 10mg/l vào bình định mức 5ml định mức đến vạch nước cất Các dung dịch chuẩn penicillin bảo quản lạnh (nhiệt độ – 4oC), tránh ánh sáng 3.3.4 Đệm photphat 0,1M pH 6.5 Cân 7,98 gam K2HPO4.3H2O; 8,84 gam KH2PO4 3,89 gam Na2S2O3 Hoà tan hỗn hợp vào nước chuyển vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch nước cất 3.3.5 Chuẩn bị pha động chạy sắc ký - Kênh A: Lấy 240ml acetonitril, 60 ml metanol cho vào bình định mức 1000 ml định mức đến vạch đệm photphat pH 6,5 - Kênh B: Lấy 300ml acetonitril 200 ml metanol cho vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch đệm photphat pH 6,5 Chú thích: Rung siêu âm kỹ kênh pha động để loại bọt khí trước sử dụng 3.3.6 Chuẩn bị dung dịch Natri tungstat 0,68M Cân 22,43 gam Na2WO4.2H2O, hoà tan định mức nước cất đến 100 ml 3.3.7 Chuẩn bị dung dịch acid sulfuric 0,68M Hút 3,8 ml dung dịch H2SO4 đặc vào bình định mức 100ml định mức đến vạch nước cất 3.3.8 Chuẩn bị dung dịch đệm photphat 25mM, pH Cân 0,34 gam KH2PO4, hoà tan vào nước Chỉnh đến pH sử dụng NaOH 5M NaOH 0,5M Sau chuyển vào định mức 100ml định mức đến vạch nước cất 3.3.9 Chuẩn bị dung dịch HgCl2 0,1M Cân 0,2715 gam HgCl2, hoà tan định mức nước cất đến 10ml 3.3.10 Chuẩn bị dung dịch dẫn xuất Cân 13,78 gam 1,2,4 – triazol, thêm vào 60 ml H2O 10ml HgCl2 0,1M Dùng NaOH 0,5 M chỉnh đến pH 9,0 ± 0,05 Sau chuyển sang bình định mức 100ml định mức đến vạch nước cất Để yên 24 trước sử dụng Bảo quản bình màu nâu Chỉ sử dụng phần dịch phía Các bước tiến hành Các mẫu đồng kĩ trước phân tích 4.1 Chiết mẫu luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 38 of 120 37 Header Page 39 of 120 Cân xác khoảng 5g mẫu đồng kĩ vào ống li tâm 50ml, thêm 20ml nước cất, đồng máy nghiền mẫu Thêm 2ml Acid sulfuric 0,68M, 2ml Natri tungstat 0,68M, lắc vortex Để yên phút Li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút phút Lọc dịch vào bình nón 50ml Bã chiết lặp thêm lần gộp tồn dịch chiết vào bình nón 50ml Chỉnh pH dịch chiết - sử dụng NaOH 4N NaOH 0,4N làm qua cột chiết pha rắn Polymeric 4.2 Làm qua SPE - Hoạt hoá cột với : 3ml MeOH 3ml H2O cất - Nạp mẫu: tốc độ 1-2 ml/phút - Rửa tạp: 5ml đệm photphat 25mM, pH - Rửa giải: lần, lần 5ml ACN vào bình cất quay 100ml Cô quay đến cạn 40oC chuẩn bị cho q trình dẫn xuất 4.3 Dẫn xuất hố mẫu Thêm 500µL đệm photphat 25mM, pH vào bình cất quay, lắc vortex, thêm 500µL dẫn xuất, lắc chuyển sang vial 1,8ml (sử dụng pipet pasteur) Rung siêu âm 55 ± 2oC 30 phút Để nguội bơm vào hệ thống HPLC 4.4 Dẫn xuất hoá chuẩn Lập dãy chuẩn làm việc penicillin theo bảng sau (sử dụng vial dung tích 1,8ml pipetman loại - 1000µl): STT vial Thể tích chuẩn hỗn hợp I (µl) 50 100 150 200 250 Thể tích đệm photphat 25mM, pH (µl) 450 400 350 300 250 500 500 500 500 Lắc vortex 10s Thể tích dẫn xuất (µl) 500 Lắc vortex 30s, rung siêu âm 55oC 30 phút Nồng độ penG (ng/ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Nồng độ penV (ng/ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 Làm nguội, tiêm vào hệ thống HPLC 4.5 Điều kiện chạy sắc ký - Ct Symmestry waters C18 (250mm ì 4,6mm ì 5àm) (hoặc tương đương) - Pha động: chương trình gradient A: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 700 : 240 : 60 B: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 500 : 300 : 200 luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 39 of 120 38 Header Page 40 of 120 Thời gian (phút)%A %A %B 100 20 100 21 100 25 100 - Detectơ: PDA 323nm UV 323nm - Nhiệt độ buồng cột: 40oC - Tốc độ dòng: 1ml/phút Tính tốn kết Hàm lượng Penicillin mẫu tính sau: X = C×V×K/m Trong đó: X: hàm lượng penicillin có mẫu ( ng/g) V: thể tích dịch chiết trước bơm vào HPLC (ml) C: nồng độ Penicillin tính từ đường chuẩn (ng/ml) K: hệ số pha lỗng m: khối lượng mẫu (g) Kiểm sốt chất lượng Kết trung bình cộng kết hai lần xác định song song Hai kết không chênh lệch 20% kết trung bình Hà nội, ngày Viện Dinh dưỡng TTKNVSATTP luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 40 of 120 39 tháng năm 200 Chủ nhiệm đề tài ... toàn thực phẩm Trong đề tài nghiên cứu phương pháp xác định dư lượng Penicillin thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Phương pháp có độ nhạy, độ chọn lọc độ xác cao luan van thac si-tai... ion xác định sắc ký lỏng cặp ion v i detectơ tử ngoại Hiệu suất thu hồi phương pháp từ 73 - 95% Giới hạn phát phương pháp cho penicillin 0,02 mg/kg c) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Tác giả... Phương pháp phức tạp, không đặc trưng xác định lượng tổng Penicillin Tiêu chuẩn ngành thuỷ sản TCN 197-2004 [8] qui định phương pháp định lượng Penicillin sản phẩm thuỷ sản sắc ký lỏng hiệu cao