Phân tách bằng các phương pháp sắc ký và nghiên cứu một số tính chất của ribonuclease từ nọc rắn hổ mang

Bộ giáo dục đào tạo Trờng đại học s phạm hà nội Nguyễn huy trí Phân tách phơng pháp sắc ký nghiên cứu số tính chất ribonuclease từ nọc rắn hổ mang Chuyên ngµnh: Sinh häc thùc nghiƯm M· sè: 60 42 30 Luận văn thạc sĩ sinh học Ngời hớng dẫn khoa häc: NCVC TS NGUN V¡N THIÕT Hµ néi, 2010 MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Ribonuclease (RNase) nhóm enzyme quan tâm nghiên cứu nhiều Đây nhóm enzyme có phân bố rộng rãi, đóng vai trò quan trọng q trình trao đổi chất acid nucleic, thực chức tiêu hóa tham gia vào phản ứng miễn dịch thể Đặc biệt thập kỷ gần đây, nhà khoa học phát nhiều tính chất (hay hoạt tính) sinh học quan trọng enzyme thuộc siêu họ RNase A (đây nhóm RNase ngoại tiết động vật có xương sống từ lưỡng cư đến lớp thú), có hoạt tính gây độc tế bào (hay hoạt tính cytotoxin),các hoạt tính kháng khuẩn kháng virus số hoạt tính khác Ví dụ như: RNase từ số lồi ếch (ếch đồng Nhật Bản Rana japonica, ếch bò Rana catesbeiana ếch báo phương bắc Rana pipens) có hoạt tính chống ung thư, đặc biệt RNase từ loài ếch báo phương bắc tác động đặc hiệu lên tế bào u mà không ảnh hưởng lên tế bào bình thường, enzyme gọi onconase (enzyme đặc hiệu với tế bào ung thư) Ngồi enzyme có hoạt tính chống HIV-1 cao Các enzyme thuộc nhóm RNase ngoại tiết khác RNase từ tinh dịch bò nhiều RNase ngoại tiết người (các enzyme tạo thành siêu họ RNase A người) có hoạt tính chống virus chúng phận cấu thành hệ thống chống virus người enzyme RNase RNase bạch cầu ưa eosin (bạch cầu ưa acid) tiết Những năm gần ngồi việc tìm số RNase nguồn gốc tự nhiên có đặc điểm onconase & BS-RNase, nhà khoa học nghiên cứu tạo chế phẩm RNase nhân tạo có hoạt tính chống ung thư, nhờ vận dụng phương pháp sinh học phân tử công nghệ gen Dạng biến thể RNase tạo cách thay một vài gốc amino acid cần cho tương tác với protein ức chế (RI) tạo thêm liên kết disunfide làm tăng độ bền vững cấu trúc giảm bớt nhạy cảm với protein tế bào Các nghiên cứu mở hướng nghiên cứu lĩnh vực hóa dược nhằm sản xuất chế phẩm dược cao cấp sở RNase để phòng chống ung thư Nọc rắn nguồn dược liệu cổ truyền quý, khơng phải ngẫu nhiên mà biểu tượng tồn ngành Y giới hình ảnh rắn nhả nọc Nọc rắn xử lý hết độc có tác dụng: - Chống đơng, chống hình thành huyết khối, giảm fibrinogen, độ dính máu, độ ngưng kết tiểu cầu - Có tác dụng giảm đau rõ rệt: Nọc độc rắn với liều 0,188 mg/kg có tác dụng giảm đau - lần morphin với liều 1mg/kg mà khơng gây nghiện Có thể trị loại đau thần kinh, ung thư - Có tác dụng chống ung thư (Theo kết nghiên cứu dược lý đại) Đáng ý chất phát nọc rắn, ni dưỡng hình thành tế bào thần kinh có ý nghĩa với bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer bệnh khác mà tế bào thần kinh não chết Để góp phần tìm hiểu thêm RNase tự nhiên có khả có hoạt tính cytotoxin nguồn tài ngun đa dạng phong phú Việt Nam Chúng chọn đề tài nghiên cứu RNase từ nọc rắn nhằm tìm hiểu tính chất enzyme Luận văn tơi có tiêu đề: “Phân tách phương pháp sắc kí nghiên cứu số tính chất ribonuclease từ nọc rắn hổ mang” MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả tách chiết làm enzyme RNase phương pháp sắc kí - Nghiên cứu số tính chất enzyme ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Đối tượng: RNase từ nọc rắn hổ mang - Phạm vi nghiên cứu: Sử dụng phương pháp sắc kí để phân tách làm enzyme RNase từ nọc rắn hổ mang, nghiên cứu số tính chất enzyme PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thực nghiệm áp dụng biện pháp phân tách đại (bằng máy sắc kí) phương pháp nghiên cứu động học xúc tác enzyme GIẢ THIẾT KHOA HỌC - RNase có ý nghĩa to lớn nhiều loại bệnh Y học Ngoài chức tiêu hóa tham gia (trực tiếp hay gián tiếp) hoạt động mã, phiên mã, sinh tổng hợp protein, RNase thực nhiều vai trò phòng chống virus, vi khuẩn, kháng giun… Nồng độ hoạt tính RNase dịch bào dịch thể có liên quan đến trạng thái bệnh lý nhiều loại bệnh khác nhau: Nồng độ enzyme tăng kết phản ứng thể chống lại bệnh tật (ví dụ: Bệnh tăng bạch cầu tủy mãn tính, hội chứng mệt mỏi kinh niên phát thấy lượng RNase tăng lên tế bào ngoại vi) - Trong tương lai nhiều dạng RNase nghiên cứu để tạo loại thuốc tác động hiệu lên khối u Nhiều bệnh hiểm nghèo phòng chống chữa trị hiệu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU KHÁI QUÁT CHUNG VỀ NHÓM RNASE 1.1 Lịch sử nghiên cứu RNase (RNase) bắt đầu nghiên cứu từ năm 1920 Walter Jones phát chất tác từ tuyến tụy có khả thủy phân acid nucleic nấm men, vào thời điểm cấu trúc hóa học acid nucleic nói chung acid ribonucleic (ARN) nói riêng chưa biết đến Sau Dubos Thompson tinh ARN phát chất đặt tên RNase chúng tham gia vào trình depolymer hóa ARN Tới năm 1940, Kunitz kết tinh RNase, tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu sau Vào đầu năm 1950, ba nhà khoa học Salganik (Liên Xô), Bernet (Úc), Leclerk (Bỉ) tiến hành thử nghiệm khả chữa bệnh virus nuclease nói chung RNase nói riêng [6461] Kết bước đầu cho thấy enzyme có khả kìm hãm phát triển số loại virus gây bệnh ospovaxin, herpes, adenovirus (chứa ADN) hay virus viêm não, viêm tủy, virus cúm (chứa ARN) Năm 1958, Sie Kevitz Palade xác định nơi khư trú enzyme tuyến tụy nhờ kỹ thuật kháng thể huỳnh quang Những năm 1960-1970 nhờ ưu nguồn vật liệu, khả tinh chế kích thước phân tử nhỏ (~ 14kDa), RNase tuyến tụy bò (RNase A, EC 3.1.27.5) trở thành mơ hình mẫu nghiên cứu enzyme nói riêng nghiên cứu protein nói chung RNase A enzyme xác định trình tự amino acid enzyme thứ xác định cấu trúc 3D (sau lysozyme carboxy-peptidase A) Vào năm 1972 giải thưởng Nobel hóa học trao cho Stanford Moor, William Stein Christian Anfinsen với cơng trình nghiên cứu họ RNase Năm 1984 Bruce Merifield vinh dự nhận giải thưởng cao quý với công trình nghiên cứu liên quan đến RNase A [50, 51, 52] Từ năm cuối thập kỷ 80 tới nay, nhiều nghiên cứu nghiên cứu theo hướng ứng dụng RNase tiến hành song song liên quan chặt chẽ với nhau, đặc biệt nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc chức sinh học RNase Kết nghiên cứu mở triển vọng cho nghiên cứu nhằm sản xuất dược phẩm sở RNase có khả chữa trị bệnh hiểm nghèo ung thư bệnh virus [13, 18, 28, 40, 41, 50] 1.2 Tính đặc hiệu chất sở phân loại RNase Tính đặc hiệu chất điểm khác biệt chủ yếu enzyme với chất xúc tác khác enzyme với enzyme khác Nhóm nuclease tham gia trực tiếp vào trình trao đổi chất acid nucleic Chúng đặc trưng tính đặc hiệu chất rộng che phủ (chồng chéo) Việc phân loại nuclease khó khăn khơng thống Ngoài phản ứng thủy phân, enzyme thuộc nhóm tham gia xúc tác phản ứng chuyển nhóm: RNase tụy tạo thành 2’,3’-monophosphate vòng nhờ phản ứng chuyển vị nhanh khoảng 1000 lần so với phản ứng thủy phân giai đoạn sau phản ứng tạo thành 3’-monophosphate [26] Trong hệ thống phân loại enzyme năm 1964, enzyme xếp vào nhóm transferase (EC 2.7.7.16 EC 2.7.7.17) Việc phân loại khơng hợp lí deoxyRNase (DNase) có chức sinh học với RNase thủy phân acid nucleic lại xếp vào nhóm hydrolase (EC 3.1.4.6) [25] Những nghiên cứu khác biệt tương đối, tùy thuộc vào enzyme cụ thể Ví dụ số vi khuẩn tốc độ chuyển nhóm thủy phân RNase tương đương nên chất trung gian (nucleotide vòng) khơng tích lũy q trình phản ứng Để đặc trưng cho tính đặc hiệu enzyme thuộc nhóm nuclease, Laskovski đưa dấu hiệu (tương đối không phụ thuộc) khác [20, 23, 24] Theo tính đặc hiệu gốc đường cấu trúc nên nucleotide, nuclease phân chia thành hai nhóm lớn: RNase DNase Theo vị trí liên kết bị thủy phân, nuclease phân chia thành exonuclease endonuclease Theo sản phẩm thủy phân: Liên kết phosphodiester bị thủy phân từ phía phân tử ARN, tạo thành sản phẩm 5’-phosphate hay 3’-phosphate Một số exonuclease tác động vào phân tử polynucleotide từ phía đầu 3’, số khác lại tác động vào phía đầu 5’ Theo tính đặc hiệu với bazơ đơn vị nucleotide liền kề với nucleotide bị thủy phân: Tính đặc hiệu nhiều enzyme không đáng kể Chẳng hạn RNase thực vật Escherichia coli (EC 3.1.27.1) thủy phân liên kết theo vị trí 3’ purine pyrimidine nucleotide; RNase tuyến tụy (EC 3.1.27.5) chiếm vị trí trung gian: Thủy phân liên kết theo vị trí 3’ pyrimidine nucleotide Trong đó, enzyme mã số EC 3.1.27.3 endonuclease đích thực, thủy phân ARN vị trí 3’ gốc Guanine nucleotide Tính đặc hiệu cấu trúc: mạch đơn hay mạch kép (đa số nuclease thể độ đặc hiệu cao theo dấu hiệu này) Tính đặc hiệu trình tự nucleotide… Một số dấu hiệu tính đến hệ thống phân loại enzyme vào năm 1978 Trong hệ thống phân loại này, 14 phân nhóm nuclease đưa vào để phân loại nuclease tốt Chắc chắn thời gian tới hệ thống phân loại nuclease nói chung RNase nói riêng thay đổi cấu trúc chức nhiều enzyme phát thêm [20] Tuy vậy, trường hợp RNase (hay nuclease) mà ta quan tâm nằm sơ đồ chung phân loại nuclease sau: - Phân loại nuclease dựa tính đặc hiệu chất, phân biệt: + DNase (thủy phân ADN) + RNase (thủy phân ARN) + Nuclease hỗn tạp hay không đặc hiệu (theo gốc) đường thủy phân ADN ARN - Phân loại nuclease dựa vị trí liên kết bị thủy phân, phân biệt: + Endonuclease + Exonuclease 3’-exonuclease 5’-exonuclease 1.3 Cơ chế xúc tác RNase Phản ứng hóa học mà RNase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết phosphodiester phân tử acid nucleic Quá trình thủy phân ARN RNase xúc tác xảy qua giai đoạn theo chế xúc tác kiềm - acid chung với tham gia gốc His-12 His-119 [20, 26, 37, 47, 51, 52] - Giai đoạn 1: Phân cắt chuỗi polymer tạo sản phẩm trung gian phosphate vòng mà khơng giải phóng nhóm acid Trong giai đoạn này, His-12 đóng + vai trò chất xúc tác kiềm chung (nhận proton H vị trí 2’) His-119 đóng vai trò acid chung (proton hóa nhóm khỏi RNA-O-) diễn nhanh - Giai đoạn 2: Giải phóng nhóm acid thứ hai thuộc gốc phosphate trình thủy phân dẫn xuất phosphate vòng Giai đoạn diễn chậm vai trò hai gốc His-12 His-119 lại ngược lại His-119 tương tác với H2O theo chế xúc tác kiềm chung (nhận proton) His-12 đảm nhận việc proton hóa nhóm khỏi (sản phẩm) vị trí C-2’ CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA RNASE RNase A enzyme có khối lượng phân tử nhỏ (~ 14 kDa) cấu tạo từ mạch polypeptide từ 124 gốc amino acid, thành phần amino acid có 19 tổng số 20 loại amino acid có protein (khơng có amino acid Trytophan) Cơng thức phân tử dạng khơng tích điện RNase A C575H907N171O192S12 với khối lượng phân tử xác Mr = 13686 Da [50, 51, 52] Về hình dạng, RNase A giống thận, gốc amino acid trung tâm hoạt động nằm vùng “hốc” (cleff) - vùng lõm thận [51] Cấu trúc bậc hai điển hình RNase A gồm phiến cấu trúc  nằm song song ngược chiều kề bên cạnh chuỗi xoắn  ngắn Trong phân tử có cầu nối disulfide tạo thành từ gốc Cysteine vị trí 26-84, 40-95, 58-110 65-72 Các cầu nối bị phá vỡ lượng -mercaptoethanol dư thừa, tạo thành nhóm SH tự dẫn tới biến tính làm hoạt tính enzyme [26, 51] Hầu hết RNase thuộc siêu họ RNase A có cấu trúc monomer, có RNase tinh dịch bò (BS-RNase) có cấu trúc bậc (dimer) [15, 17] BSRNase tách dạng dimer hai tiểu đơn vị thành phần nối với hai cầu disunfide [1917] Enzyme đồng đẳng RNase A, trạng thái cân hỗn hợp gồm cấu trúc bậc IV hoàn toàn khác [36] Trung tâm hoạt động RNase A ngồi hai nhóm chức tham gia trực tiếp vào q trình xúc tác nhóm imidazol gốc His-12 His-119 (trong nhóm đóng vai trò acid, nhóm đóng vai trò bazơ q trình xúc tác) có mạch bên gốc Lys-7, Lys-41, Lys-66, Asp-121 mạch carbon gốc Phe Gly-11 [13, 20, 28] TÍNH ĐA HÌNH PHÂN TỬ CỦA RNASE TRONG TẾ BÀO Nhiều cơng trình nghiên cứu RNase tiến hành nhóm sinh vật từ dạng có cấu tạo đơn giản vi khuẩn đến sinh vật bậc cao người cho thấy mn hình mn vẻ enzyme thuộc nhóm Trong cá thể có tồn nhiều dạng RNase khác nhau, ví dụ vi khuẩn E.coli có tới 20 loại RNase [46]; nọc rắn hổ mang Ấn Độ chứa dạng RNase liên hợp-phân li (phụ thuộc vào nồng độ NaCl) [42]; kết nghiên cứu ban đầu Việt Nam cho thấy tồn dạng RNase khác nọc rắn hổ mang Việt Nam [5, 7] Ở người, tới phát enzyme khác thuộc siêu họ RNase A Chúng đánh số từ đến để phân loại dựa khác biệt cấu trúc chức sinh học Các gen mã hóa cho protein liên kết với cánh tay dài nhiễm sắc thể số 14 [61] Dưới đặc điểm nhóm RNase người thuộc siêu họ RNase A 3.1 RNase RNase có nhiều quan khác thể có nhiều tuyến tụy Trình tự amino acid tương đồng tới 70% so với RNase A Chức RNase tiêu hóa - thủy phân ARN thức ăn [55, 61] 3.2 RNase (EDN - eosinophil derived neurotoxin) RNase phát độc tố thần kinh có nguồn gốc từ tế bào bạch cầu ưa acid nên gọi EDN Đây protein tế bào lympho có hoạt tính ribonucleolytic Một số gốc amino acid như: Gly-2, Lys66, Lys-7, Arg-10, Phe-120, Asp-14 bị thay đổi khơng bảo thủ đóng vai trò quan trọng chức năng; gốc amino acid His-12, His-119, Lys-41 nhiều gốc khác giữ lại tạo nên trung tâm hoạt động (TTHĐ) phân tử enzyme [55, 61] 3.3 RNase (ECP - eosinophil cationic protein) Cũng giống RNase 2, RNase phát protein mang điện dương tế bào bạch cầu ưa acid, điểm đẳng điện protein pI = 10,8 (enzyme protein kiềm) tương đồng tới 70% với RNase ECP RNase người có hoạt tính kháng khuẩn, kháng côn trùng độc với tế bào thần kinh Hoạt tính nuclease ECP thấp nhiều so với RNase đặc tính xúc tác bình thường gần khơng đổi so với RNase Tuy hoạt tính ribonucleolytic ECP lại khơng cần thiết cho hoạt tính kháng khuẩn [22, 55, 61] 3.4 RNase RNase có trình tự amino acid tương đồng 43% với RNase 1, 31% với RNase 30% với RNase Enyme tương đồng với RNase gan bò gan lợn tới 90%, điều chứng tỏ tính bảo thủ RNase lớn [55, 61] 3.5 RNase (Angiogenin) Angiogenin có trọng lượng phân tử 14 400 Da giống RNase A tới 65% trình tự amino acid, cầu disunfide gốc amino acid chức chủ yếu TTHĐ RNase bảo tồn ỏ angiogenin So với RNase 1, trình tự amino acid angiogenin tương đồng 35%, 27% 39% Angiogenin có tính đặc hiệu yếu với chất chuẩn RNase bù lại, hoạt tính ribonucleolytic angiogienin lại quan trọng việc hình thành mạch máu [61] 3.6 RNase (RNase K6) 10 2.0687 0.1872 2.0217 0.2311 1.3809 0.1235 1.7017 0.1047 2.3341 0.1887 2.2904 0.2442 1.542 0.1196 1.9175 0.1347 2.4817 0.2679 1.8961 0.1383 2.2141 0.1576 1.9265 0.1455 2.5331 0.1648 2.3823 0.1678 2.571 0.1835 ỉnh ỉnh ỉnh ỉnh [S], OD260 A (P), OD260 [S], OD260 A (P), OD260 [S], OD260 A (P), OD260 [S], OD260 A (P), OD260 0 0 0 0 0.2684 0.0083 0.2516 0.0182 0.1458 0.0000 0.3403 0.0404 0.2922 0.0006 0.1503 0.0027 0.3243 0.0301 0.5348 0.0323 0.4063 -0.0021 0.5878 0.0794 0.4241 0.0346 0.785 0.1104 0.6053 -0.0030 0.6188 0.1116 0.6407 0.0716 0.8142 0.0886 0.8712 0.0024 0.7876 0.1118 0.7578 0.0882 1.0472 0.1253 0.9805 0.0009 1.0591 0.1297 0.9821 0.1055 1.2715 0.1643 1.2059 0.0159 1.2428 0.1201 1.0134 0.1132 1.5331 0.1875 1.4745 0.0381 1.5867 0.1195 1.2521 0.1200 1.7963 0.2111 1.5189 0.0486 1.6277 0.1283 1.406 0.1186 2.1006 0.2134 1.6755 0.0589 1.9357 0.1195 1.5991 0.1251 2.1571 0.2051 1.9791 0.0885 2.0941 0.1262 1.8835 0.1191 2.1497 0.1433 2.3457 0.1136 2.121 0.1183 2.4082 0.1552 Từ kết bảng 3.21 xây dựng đường cong biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính đỉnh RNase tương ứng vào nồng độ chất (động học bão hòa enzyme chất) giá trị pH tối ưu (hình 3.22) 0.20 P Đ1 0.3P Vm Đ2 0.2 0.10 0.1 0.05 0.00 S0,5 0.5 1.5 [S] [S] 2.5 0 0.5 1.5 2.5 0.25 Đ3 P 0.2 P Đ4 0.2 0.15 0.1 0.1 0.05 [S] 0 [S] Đ6 P 0.2 P 0.15 Đ5 0.1 0.1 0.05 [S] 0 0.15 0.5 1.5 2.5 0.5 1.5 2.5 Đ8 0.25 P 0.2 Đ7 P [S] 0.15 0.1 0.1 0.05 0.05 [S] [S] 0 0.5 1.5 2.5 Hình 3.22 Động học bão hòa enzyme chất đỉnh RNase nọc rắn hổ mang nhận sau sắc kí trao đổi ion Đường thẳng song song với trục hồnh phía tốc độ cực đại phản ứng, giao đường thẳng song song với trục tung – xác định giá trị S0,5 RNase Các đồ thị hình 3.22 cho thấy tất đỉnh RNase nọc rắn hổ mang không tuân theo động học Michaelis-Menten: tất đường cong P – [S] dạng hyperbol, mà lại có dạng sigma (hình chữ S) Hơn nữa, cực đại đỉnh RNase khác đáng kể vể tính chất động học Ví dụ, dải nồng độ chất khảo sát có RNase đỉnh bão hòa chất, ngồi đỉnh RNase dường bão hòa chất, nhiên cực đại đỉnh RNase bão hòa chất lại có giá trị S0,5 khác (S0,5 đại lượng sử dụng để đánh giá lực enzyme chất trường hợp enzyme có động học sigma, giống số Michaelis – Km, sử dụng để đánh giá lực enzyme chất trường hợp enzyme có động học Michaelis-Menten, tức đường cong bão hòa enzyme chất có dạng hyperbol) Bốn đỉnh RNase lại chưa bão hòa chất vùng nồng độ chất khảo sát, đỉnh RNase dường gần tiến tới mức bão hòa, đỉnh RNase chưa thấy dấu hiệu bão hòa Từ số đồ thị tính giá trị S0,5 đỉnh RNase tương ứng, ví dụ đỉnh RNase có S0,5 = ~ 0,45 đơn vị OD, đỉnh RNase có S0,5 = ~ 0,6 đơn vị OD Như vậy, theo tính chất RNase nọc rắn hổ mang khác tất enzyme khác thuộc siêu họ Rnase A KẾT LUẬN Từ kết nhận rút kết luận sau: Đã tối ưu hóa q trình phân tách protein enzyme RNase nọc rắn hổ mang phương pháp sắc kí trao đổi ion cột SP Sepharose Fast Flow theo giá trị pH vùng pH rộng từ 4,0 đến 7,5 Kết nhận cho thấy: a) Trong vùng pH protein RNase nọc rắn hổ mang phân tách thành nhiều đỉnh khác đỉnh RNase gần trùng với đỉnh protein tương ứng; phân tách tốt đỉnh protein enzyme đạt giá trị pH 6,0 b) Khi tăng giá trị pH đỉnh protein enzyme có xu hướng dịch chuyển phía bên trái sắc kí đồ và, ngược lại, giảm pH đỉnh lại có xu hướng dịch chuyển phía bên phải sắc kí đồ RNase nọc rắn hổ mang Việt Nam có tính đa hình phân tử cao: sắc kí trao đổi ion giá trị pH 4,0; 4,5 pH 7,5 phân tách enzyme thành đỉnh, giá trị pH từ 5,0 đến 7,0 – nhận được tới đỉnh RNase khác nhiều điện tích bề mặt Dưới góc độ tách chiết làm enzyme, để nhận chế phẩm RNase từ nọc rắn hổ mang có mức độ làm cao nên tiến hành trình sắc kí cột SP Shepharose Fast Flow vùng pH acid (pH = 4,0  6,0), với giá trị pH tối ưu cho q trình sắc kí pHopt = 5,0 Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử cột Superdex 75 phân tách RNase nọc rắn thành 3-4 đỉnh khác kích thước phân tử, có đỉnh đỉnh lại đỉnh phụ Các kết củng cố kết luận tồn đa hình phân tử RNase nọc rắn hổ mang nhận phương pháp sắc kí trao đổi ion nêu RNase nọc rắn hổ mang Việt Nam thành viên đặc biệt siêu họ RNase A, có nhiều tính chất phân biệt với enzyme khác siêu họ enzyme lớn này, là: a) Tính đa hình phân tử cao nêu trên; 70 b) Enzyme thể hoạt tính xúc tác cao vùng pH acid: tất đỉnh RNase nhận có pHopt vùng pH = 2,5  4,0 c) Đường cong bão hòa enzyme chất RNase nọc rắn hổ mang khơng có dạng hyperbol, mà có dạng sigma Cuối cần phải nhấn mạnh tính đa hình phân tử cao RNase nọc rắn hổ mang tính chất lí thú, tính chất lại gây khó khăn lớn cho việc tách chiết tinh chế enzyme Các kết tối ưu hóa q trình sắc kí protein nọc rắn cột SP Sepharose Fast Flow theo giá trị pH mà tiến hành nghiên cứu mở khả sử dụng hiệu phương pháp sắc kí trao đổi ion để làm enzyme từ nọc rắn hổ mang TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Nguyễn Văn Thiết (2002), “Nghiên cứu hoạt tính ribonucleolytic nọc rắn hổ mang”, T/c Dược liệu, tập 7(6), tr 181-185 Nguyễn Văn Thiết, Ngơ Thị Hải Yến (2003), Một số tính chất đặc trưng ribonuc - lease từ nọc rắn hổ mang đen Việt Nam (Naja naja), BC HNKH toàn quốc lần II “Những vấn đề NCCB KH sống NCCB SH, NN, YH”, Huế, 25 - 26/7/2003, Nxb KH&KT, tr 515 - 518 Nguyễn Văn Thiết (2003), “Ảnh hưởng số yếu tố lên hoạt tính ribonucleolytic nọc rắn hổ mang đen (Naja naja)”, T/c Dược liệu, tập 8(4), tr 118-122 Nguyễn Văn Thiết (2003), Tính đa hình phân tử ribonuclease từ nọc rắn hổ mang đen I – Hai dạng động học T/c Dược Liệu, tập 8(6), tr 167-170 Nguyễn Văn Thiết, Ngơ Thị Hải Yến, Trần Đình Toại (2004), Hai dạng phân tử khác ribonuclease nọc rắn hổ mang Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học hội Hóa sinh y dược Hà Nội tỉnh phía Bắc, Hà Nội, 8-2004, tr 85-91 Nguyễn Văn Thiết, Ngơ Thị Hải Yến (2004), Tính đa hình phân tử ribonuclease từ nọc rắn hổ mang đen II - Các dạng sắc kí T/c Dược liệu, tập 9(3), tr 89-93 Nguyễn Văn Thiết (2005), Ảnh hưởng số yếu tố lên pH tối ưu ribonuclease nọc rắn hổ mang T/c Dược liệu, tập 10(5), tr 153-158 Nguyễn Văn Thiết, Giang Thái Sơn (2006) Kết tách enzim ribonucleaza từ nọc rắn hổ mang phương pháp sắc kí trao đổi ion cột CM-xen-lu-lô T/c Sinh học tập 28(3), tr 83-87 Nguyễn Văn Thiết (2008), So sánh kết phân tách Ribonuclease nọc rắn hổ mang thiết bị FPLC với kết sắc kí theo phưng pháp thủ cơng T/c Dược liệu, tập 13(4), tr 189-194 10 Nguyễn Văn Thiết, Trần Thị Thơm, Trần Đình Toại (1995), “Tách chiết nghiên cứu tính chất RNase tụy”, Tạp chí Sinh học, tập 17(3), tr:49-52 Tài liệu tiến Anh: 11 Antigani A., Naddeo M., Cubellis M R., Russo A., D’Alessio G (2001), “Antitumor action of seminal ribonuclease, its dimeric structure, and its resistance to the cytosolic ribonuclease inhibitor”, Biochem, vol 40(12), pp 3492-3496 12 Blacburn P., Wilson G., Moore S., (1977), “Ribonuclease inhibitor from human placenta: Purification and properties”, JBC, vol 252(16), pp 5904-5910 13 Bretscher L E., Abel R L., Raines R T (2000), “Ribonuclease A variant with low catalytic activity but high cytotoxicity”, JBC, vol 275(14), pp 9893-9896 14 Cafaro V., De Lorenzo C., Piccoli R., Bracale A., Mastronicola M R., Di Donato A., D’Alessio G (1995), “The antitumor action of seminal ribonuclease and its quaternary conformations”, FEBS lett., vol 359(1), pp 31-34 15 Ciglic M I., Jackson P J., et.al (1998), “Origin of dimeric structure in the ribonuclease superfamily”, Biochem J., vol 37(12), pp 4008-4022 16 Cole J L., caroll S S., Kuo L C (1996), “Stoichiometry of 2’, 5’oligoadenylate-induced dimerization of ribonuclease L A sedimentation equilibrium strudy”, JBC, vol 271(8), pp 3979-3981 17 D’Alessio G (1999), “Evolution of oligomeric proteins The unusual case of a dimeric ribonuclease”, Eur J Biochem., vol 266, pp 699-708 18 Di Donato A., Cafaro V., D’Alessio G (1994), “Ribonuclease A can be transformed into a dimeric ribonuclease with antitumor activity’ JBC, vol 269(26), pp 17394-17396 19 Di Donato A., Cafaro V., De Nigris M., Rizzo M., D’Alessio G (1993), “The determinants of the dimeric structure of seminal ribonuclease are located in its Nterminal region”, Biochem Biophys Res Commun., vol 194(3), pp 1440-1445 rd 20 Dixon M., Webb E C (1979), Enzymes, edition, Longman Group Ltd., New York 21 Domachowske J B., Bonville C A., Dyer K D and Rosenberg H F (1998), “Evolution of antiviral activity in the Ribonuclease A gene superfamily: evidence for a specific interation between eosinophil-derived neurotoxin (EDN/RNase 2) and respiratory synctial virus”, Nucleic Acids Res, vol 26(23), pp 5327-5332 22 Domachowske J B., Dyer K D., Adam A G., Leto T L and Rosenberg H F (1998), “Eosinophil cationic protein: RNase is another RNase A-family ribonuclease with direct antiviral activity”, Nucleic Acids Res, vol 26(14), pp 3358-3363 23 Enzyme Nomenclature (1978-1979), Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry on the Nomenclature and Clasification of Enzymes, Elsevier Publishing Company, New York 24 Enzyme Nomenclature(1972-1973), Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature of the Nomenclature and Clasification of Enzymes, together with their Units and the Symbols of Enzyme Kinetics, Elsevier Publishing Company, Amsterdam 25 Enzyme Nomenclature (1964-1965), Recommendations of the International Union of Biochemistry on the Nomenclature and Clasification of Enzymes, together with their Units and the Symbols of Enzyme Kinetics, Elsevier Publishing Company, Amsterdam 26 Fersht A (1977), Enzyme Structure and Mechanism, Freeman and Company Ltd 27 Frank D N., Pace N R (1998), “Ribonucleases P: Unity and Diversity in a tRNA Processing Ribozyme”, Annu Rev Biochem., vol 67, pp 153-180 28 Gaur D., Swaminathan S., Batra J (2001), “Interaction of human pancreatic ribonuclease with human ribonuclease inhibitor: Generation of inhibitor-resistant cytotoxic variants”, JBC, vol 276, pp 24978-24984 29 Haigis M C., Kurten E L., Raines R T (2003), “Ribonuclease inhibitor as an intracellular sentry”, Nucleic Acids Research, vol 31, pp 31024 – 1032 30 Harder J., Schroder J M (2002), “RNase 7, a novel innate immune defense antimicrobial protein of healthy human skin”, JBC, vol 277(48), pp 4677946784 31 Hooper, L V., Stappenbeck T S., Hong C V., and Gordon J I (2003), Angiogenins: a new class of microbicidal proteins involved in innate immunity, Nat Immunol vol pp.269-273 32 Huang H C., Wang S C., Leu Y J., Lu S C., Liao Y D (1998), “The Rana catesbeina rcr Gene encoding a cytotoxic ribonuclease: Tissue distribution, cloning, purification, cytotoxicity and active residues for RNase activity”, JBC, vol.273, pp 6395-6401 33 Huhn M., Sasse S., Tur M.K., Matthey B., Schinköthe T., Rybak S.M., Barth S., Engert A., 2001 Human Angiogenin Fused to Human CD30 Ligand (AngCD30L) Exhibits Specific Cytotoxicity against CD30-positive Lymphoma, Cancer Research, vol 61, pp 8737-8742 34 Khabar K S., Dhalla M., Siddiqui Y., Zhou A., Al-Ahdah M N., Der S D., Silverman R H and Williams B R (2000), “Effect of deficiency of the doublestranded RNA-dependent protein kinase, PKR, on antiviral resistance in the presence or absence of ribonuclease L: HSV-1 replication is particularli sensitive to deficiency of the major IFN-mediated enzymes”, J Interferon Cytokine Res, vol 20(7), pp 653-659 35 Kim J S., Soucek J., Matousek J., Raines R T (1995), “Mechanism of ribonuclease cytotoxicity”, JBC, vol 270(52), pp 31097-31102 36 Kim J S., Soucek J., Matousek J., Raines R T (1995), “Structural basis for the biological activities of bovine seminal ribonuclease”, JBC, vol 270(18), pp 10525-10530 37 Landt O., Tholke J., Grunert H P., Saenger W., Hahn U (1997), “Ribonuclease T1 is active when both catalytic histidines are replaced by aspartate”, Bio Chem., vol 387 (6), pp 553-558 38 Lee J E., Raines R T (2003), “Contribution of active site residues to the function of Onconase, a ribonuclease with antitumoral activity”, Biochem, vol 42, pp 11443-11450 39 Leland P A., Schultz W., Kim B.-M., Raines R T (1998), “RNase A variants with potent cytotoxic activity”, PNAS, vol 95(18), pp 10407-10412 40 Leland P A., Staniszewski K E., Kim B M., Raines R T (2001), “Endowing human pancreatic ribonuclease with toxicity for cancer cells”, JBC, vol 276(46), pp 43095-43102 41 Leland P A., Raines R T (2001), “Cancer chemotherapy-Rionucleases to the rescue”, JBC, vol 8, pp 405-413 42 Mahalakshmi Y V., Jagahnadham M V., Pandit M W (2000), “Ribonuclease from cobra snake venom: Purification by affinity chromatography and further characterization”, IUBMB Life, vol 49, pp 309-316 43 McCubbin A G., Kao T (2000), “Molecular recognition and response in pollen and pistil interactions”, Annu Rev Dev Biol., vol 16, pp 333-364 44 Moenner M., Vosoghi M., Ryazantsev S., Glitz D G (1998), “Ribonuclease inhibitor protein of human erythrocytes: characterization, loss of activity in response to oxidative stress, and association with Heinz bodies”, Bloods Cells, Molecules and Diseases, vol 24(8), pp 149-164 45 Murthy B S., Sirdeshmukh R (1992), “Sensitivity of monomeric and dimeric forms of bovine seminal ribonuclease to human placental ribonuclease inhibitor”, JBC, vol 281, pp 343-348 46 Murray P D (1993), “Ribonucleas multiplicity, diversity and complexity”, JBC, vol 268(18), pp 13011-13014 47 Parry S., Newbigin E., Currie G., Bacic A., Oxley D (1997), “Identification of active-site histidine residues of a self-incompatibility ribonuclease from a wild tomato”, Plant Physiol., vol 115(4), pp 1421-1429 48 Pfeifer K., Ushijima H., Lozenz B., Muller W E., Shroder H C (1993), “Evidence for age-dependent impairment of antiviral 2’,5’-oligoadenylate synthetase: Ribonuclease L-system in tissues of rat”, Meg Ageing De., vol 67(12), pp 101-114 49 Pouckova P., Soucek J., Matousek J., Zadinova M., Hlauskova D, Pilivkova J, Navratill (1998), “Antitumor action of bovine seminal ribonuclease”, Folia Microbiol, vol 43(5), pp 511-512 50 Raines R T (1999), “Ribonuclease A: from model system to cancer chemotherapeutic”, Enzymatic mechanism, IOC press, Washington, DC., pp 235249 51 Raines R T (2004), “Active site of Ribonuclease A”, Artificial Nucleases, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg., pp 19-32 52 Raines R T (1998), “Ribonuclease A”, Chem Rev., vol 98, pp 1045-1065 53 Rudolph B., R Podschun, H Sahly, S Schubert, J M Schroder, and Harder J (2006), “Identification of RNase as a Novel Human Antimicrobial Protein”, Antimicrob Agents Chemother., vol 50(9), pp 3194-3196 54 Russo N., Antignani A., D’Alessio G (2000), “In vitro evolution of a dimeric variant of human pancreatic ribonuclease”, Biochem., vol 39(13), pp 3585-3591 55 Sorrentino S., Libonati M (1997), “Structure-function relationships in human ribonuclease: Main distinctive features of the major RNase types”, FEBS lett., vol 404, pp 1-5 56 Wu Y N., Mikulski S M., Ardelt W., Rybark S M., Youle R J (1993), “A cytotoxic ribonclease: study of the mechanism of onconase cytotoxicity”, JBC, vol 268(14), pp 10686-10693 57 Youle R T., Wu Y., N et.al (1994), “RNase inhibition of human immunodeficiency virus infection of H9 cells”, Proc Nalt Acad Sci USA., vol 91, pp 6012-6016 58 Zhang J., Dyer K D., Rosenberg H F (2002), “RNase 8, a novel RNase a superfamily ribonuclease expressed uniqueli in placenta”, Nucleic Acids Research, vol 30(5), pp 1169-1175 Tài liệu tiếng Nga 59 Бaбкинa Г.Т., Василенко С.К (1964), “Hyклеазная aктивность ядов cpeднеазиатских змеей”, Биохимия, том 29(2), cтp 268 - 272 60 Василенко С.К., Бaбкинa Г.Т (1965), “Выделение и cвойcтва нуклеазы из яда кобры”, Биохимия, том 30(4), cтp 705-712 61 Власов A.B (1998), “Pибонуклеазы человека”, Биохимия, том 63(12), cтp 1587-1599 62 Koчeтoв Г.A (1980), Пpaктическое pyководство по энзимологии, Издательство Высшая Школа, Mocквa, 272 cтp 63 Meшкoвa Н.П., Ceвepин C.E [под общей рдакцией] (1979), Практикум по Биохимии, Издательство Mocкoвcкого университета, Mocквa, 430 cтp 64 Caлганик Р.И (1985), “Ферменты победают вируєы”, Наука в CCCP, (Издание Акадмии наук CCCP) номер 4-1985, cтp 98-103 PHỤ LỤC Bảng 1: Kết phân tách Protein sắc ký cột SP Sepharose Fast Flow giá trị pH 4,0 thực máy sắc ký FPLC Retentio Area Height Retention Area Height No n (ml) (mAU*ml) (mAU) (ml) (mAU*ml) (mAU) -1,81 0,6894 1,558 56,84 9,4253 4,041 0,21 0,3877 0,638 10 65,11 5,0668 1,13 3,39 0,2311 0,238 11 113,79 1398,6809 123,397 4,91 0,0017 0,012 12 133,69 1491,2446 114,529 6,75 1,313 0,864 13 165,28 491,4223 52,568 18,32 419,1595 147,84 14 183,2 22,0696 3,791 19,92 106,1328 95,605 15 222,15 72,1715 8,128 26,56 0,003 0,034 16 233,75 133,2486 9,61 Total number of detected peaks 16 Total area ( mAU*ml) 4151,248 Area in evaluated peaks ( mAU*ml) 4151,2479 Ratio peak area / total area Total peak width (ml) 152,3 Calculated from Tri SP NRHM 14 10 09001:1_UV Baseline Tri SP NRHM 14 10 09001:1_UV@01,BASEM No Bảng 2: Kết phân tách Protein sắc ký cột SP Sepharose Fast Flow giá trị pH 4,5 thực máy sắc ký FPLC Retentio Area Height Retention Area Height No n (ml) (mAU*ml) (mAU) (ml) (mAU*ml) (mAU) -2,03 0,0051 0,086 11 72,33 3,3167 5,063 -1,81 1,0254 2,361 12 85,79 1676,8667 157,921 -0,77 1,6621 0,835 13 106,99 436,522 53,984 5,92 33,2436 9,727 14 130,34 2068,7398 129,452 13,78 151,1015 76,106 15 174,04 21,4761 4,139 16,72 448,9569 144,275 16 198,11 30,4458 5,129 22,23 0,5102 0,563 17 220,77 75,9623 7,292 51,11 0,4936 1,139 18 221,68 26,6264 8,077 62,89 2,3727 2,064 19 234,72 60,675 7,132 10 69,66 28,6362 7,041 Total number of detected peaks 19 Total area ( mAU*ml) 5068,6398 Area in evaluated peaks ( mAU*ml) 5068,6379 Ratio peak area / total area Total peak width (ml) 161,61 Calculated from Tri SP NRHM 08 10 09001:1_UV Baseline Tri SP NRHM 08 10 09001:1_UV@01,BASEM No Bảng 3: Kết phân tách Protein sắc ký cột SP Sepharose Fast Flow giá trị pH 5,0 thực máy sắc ký FPLC Retentio Area Height Retention Area Height No n (ml) (mAU*ml) (mAU) (ml) (mAU*ml) (mAU) -1,81 1,0719 1,534 11 71,75 1748,9913 165,197 0,21 0,3986 0,488 12 81,85 87,5393 20,806 1,33 0,258 0,378 13 95,5 354,1323 37,95 1,79 0,4195 0,794 14 103,77 288,451 44,276 3,44 0,1798 0,21 15 119,93 767,2607 109,304 6,67 7,3514 4,744 16 127,71 1282,7617 128,085 8,21 6,1989 3,938 17 168,9 99,3472 10,401 14,08 146,6122 89,027 18 176,85 3,804 2,239 16,69 474,9354 147,597 19 197,49 139,6307 9,567 10 53,51 29,0272 8,705 20 216,1 6,9636 1,201 Total number of detected peaks 30 Total area ( mAU*ml) 5445,8621 Area in evaluated peaks ( mAU*ml) 5445,3345 Ratio peak area / total area 0,999903 Total peak width (ml) 176,02 Calculated from Tri SP NRHM 06 10 09001:1_UV Baseline Tri SP NRHM 06 10 09001:1_UV@01,BASEM No Bảng 4: Kết phân tách Protein sắc ký cột SP Sepharose Fast Flow giá trị pH 5,5 thực máy sắc ký FPLC Retentio Area Height Retention Area Height No n (ml) (mAU*ml) (mAU) (ml) (mAU*ml) (mAU) -1,81 1,6042 2,69 11 110,24 381,2777 65,679 0,24 1,2673 0,937 12 122,9 1623,4324 120,387 2,72 1,0166 0,802 13 159,24 147,7343 15,574 6,45 24,2459 13,197 14 167,85 67,1997 10,049 13,6 176,9991 65,095 15 179,08 153,0502 16,273 16,85 486,6123 148,85 16 201,42 3,4418 0,883 61,45 1598,0203 173,202 17 202,99 1,4289 0,94 72,38 130,2543 29,076 18 213,5 31,2633 2,613 84,22 406,2354 39,262 19 225,71 0,0348 0,061 10 99,66 30,9714 7,922 20 230,88 0,0057 0,091 Total number of detected peaks 21 Total area ( mAU*ml) 5266,0992 Area in evaluated peaks ( mAU*ml) 5266,0954 Ratio peak area / total area 0,999999 Total peak width (ml) 171,21 Calculated from Tri SP NRHM 15 10 09001:1_UV Baseline Tri SP NRHM 15 10 09001:1_UV@01,BASEM No Bảng 5: Kết phân tách Protein sắc ký cột SP Sepharose Fast Flow giá trị pH 6,0 thực máy sắc ký FPLC Retentio Area Height Retention Area Height No n (ml) (mAU*ml) (mAU) (ml) (mAU*ml) (mAU) -2,01 0,0106 0,216 10 74,68 124,7969 21,13 -1,72 1,4887 3,375 11 91,86 555,6001 74,692 6,29 10,7311 9,213 12 117,19 1950,6117 136,432 13,56 242,2891 87,835 13 132,25 27,8034 7,45 16,67 478,2115 145,338 14 135,13 28,2557 7,087 37,79 573,6305 41,328 15 145,9 196,9529 22,635 47,45 881,1832 124,815 16 199,63 9,8607 2,209 58,57 224,0728 48,558 17 200,68 12,8484 2,271 65,95 364,7415 57,791 Total number of detected peaks 17 Total area ( mAU*ml) 5683,0949 Area in evaluated peaks ( mAU*ml) 5683,089 Ratio peak area / total area 0,999999 Total peak width (ml) 157,44 Calculated from Tri SP 75mgNR 15 80 24 09001:1_UV Baseline Tri SP 75mgNR 15 80 24 09001:1_UV@01,BASEM No Bảng 6: Kết phân tách Protein sắc ký cột SP Sepharose Fast Flow giá trị pH 6,5 thực máy sắc ký FPLC Retentio Area Height Retention Area Height No n (ml) (mAU*ml) (mAU) (ml) (mAU*ml) (mAU) -2,05 0,0015 0,041 11 107,46 2,604 1,256 -1,76 0,4161 0,855 12 130,82 1645,6196 107,382 -0,96 0,1637 0,351 13 152,54 15,9665 2,932 6,32 18,0536 9,998 14 194,69 1,6294 0,58 17,2 703,2279 131,509 15 195,2 2,0869 0,597 51,13 1505,9328 166,356 16 198,74 1,2946 0,51 64,04 127,0145 22,764 17 202,24 0,1565 0,313 77,79 343,6372 61,037 18 202,72 0,0897 0,285 86,94 41,4405 9,136 19 214,29 28,1251 2,465 10 97,87 269,8654 47,412 20 245,88 0,0008 0,012 Total number of detected peaks 20 Total area ( mAU*ml) 4707,3274 Area in evaluated peaks ( mAU*ml) 4707,3263 Ratio peak area / total area Total peak width (ml) 158,38 Calculated from Tri NRHM 14 10001:1_UV Baseline Tri NRHM 14 10001:1_UV@01,BASEM No 80 Bảng 7: Kết phân tách Protein sắc ký cột SP Sepharose Fast Flow giá trị pH 7,0 thực máy sắc ký FPLC Retentio Area Height Retention Area Height No n (ml) (mAU*ml) (mAU) (ml) (mAU*ml) (mAU) -2,05 0,0023 0,083 11 118,23 65,1097 13,888 -1,81 0,5286 2,08 12 143,24 1988,7932 123,579 6,66 3,7044 3,833 13 160,94 21,6015 4,713 13,65 350,3428 92,596 14 204,93 0,0038 0,017 17,17 446,9508 118,593 15 205,68 0,0184 0,031 32,34 525,9594 35,374 16 206,32 0,0055 0,022 48,36 160,9106 21,04 17 212,66 1,0882 1,253 65,42 302,783 46,673 18 220,37 37,4902 4,017 74,17 148,5405 31,751 19 245,85 0,0001 0,003 10 92,22 352,2872 50,569 Total number of detected peaks 19 Total area ( mAU*ml) 4406,1231 Area in evaluated peaks ( mAU*ml) 4406,1201 Ratio peak area / total area 0,999999 Total peak width (ml) 159,88 Calculated from Tri SP NRHM 20 10 09001:1_UV Baseline Tri SP NRHM 20 10 09001:1_UV@01,BASEM No Bảng 8: Kết phân tách Protein sắc ký cột SP Sepharose Fast Flow giá trị pH 7,5 thực máy sắc ký FPLC Retentio Area Height Retention Area Height No n (ml) (mAU*ml) (mAU) (ml) (mAU*ml) (mAU) -1,81 1,317 1,812 106,1 666,1722 75,7 0,21 0,0885 0,232 10 135,45 227,4566 27,01 6,43 40,9076 17,397 11 156,78 2251,3947 138,929 13,52 558,3853 158,726 12 173,07 80,7418 9,896 16,8 1713,1456 204,811 13 210,43 6,2997 1,043 67,22 198,0305 19,859 14 222,27 42,7094 4,538 81,46 541,4223 80,914 15 245,84 0,0013 0,012 92,15 352,5998 43,11 Total number of detected peaks 15 Total area ( mAU*ml) 6680,6748 Area in evaluated peaks ( mAU*ml) 6680,6723 Ratio peak area / total area Total peak width (ml) 214,7 Calculated from Tri SP 70mg NRHM 04 11 09001:1_UV Baseline Tri SP 70mg NRHM 04 11 09001:1_UV@01,BASEM No ... NGHIÊN CỨU - Đối tượng: RNase từ nọc rắn hổ mang - Phạm vi nghiên cứu: Sử dụng phương pháp sắc kí để phân tách làm enzyme RNase từ nọc rắn hổ mang, nghiên cứu số tính chất enzyme 4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN... nghiên cứu số tính chất ribonuclease từ nọc rắn hổ mang MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả tách chiết làm enzyme RNase phương pháp sắc kí - Nghiên cứu số tính chất enzyme ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN... rắn hổ mang với mục đích tìm quy trình sơ để làm enzyme Sau nghiên cứu số tính chất hố lý xúc tác RNase từ nọc rắn hổ mang Việt Nam 3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÁCH RNASE NỌC RẮN BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC