Bước đầu xác định hàm lượng daidzein geristrin và 17 acid amin trong đậu tương và sản phẩm chế biến

BỘ Y TẾ VIỆN DINH DƯỠNG ][\^ Báo cáo kết quả đề tài khoa học công nghệ BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DAIDZEIN, GENISTEIN VÀ 17 ACID AMIN TRONG ĐẬU TƯƠNG VÀ SẢN PHẨM CHẾ BIẾN Chủ nhiệm đề tài: ThS. Lê Hồng Dũng ThS. Lê Thị Hồng Hảo Nơi thực hiện: Khoa Thực phẩm - VSATTP Cơ quan chủ quản: Viện Dinh dưỡng 6626 06/11/2007 HÀ NỘI - 2007 BỘ Y TẾ VIỆN DINH DƯỠNG ][\^ Báo cáo kết quả đề tài khoa học công nghệ BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DAIDZEIN, GENISTEIN VÀ 17 ACID AMIN TRONG ĐẬU TƯƠNG VÀ SẢN PHẨM CHẾ BIẾN Chủ nhiệm đề tài: ThS. Lê Hồng Dũng ThS. Lê Thị Hồng Hảo Cán bộ phối hợp: PGS. TS. Hà Thị Anh Đào KS. Vũ Thị Hồi CN. Bùi Thị Ngoan KS. Trần Thắng Kinh phí: 40 triệu đồng Nguồn: Chiến lược dinh dưỡng Quốc gia HÀ NỘI - 2007 1. Đặt vấn đề Đậu, đỗ là nhóm thực phẩm quan trọng cung cấp một lượng đáng kể protein cho cơ thể. Các loại đậu hạt thường chứa từ 20 đến 24% protein và 3 đến 5% chất xơ. Hạt đậu đã già thậm chí còn chứa nhiều protein hơn (30–42%) [1]. Ngoài việc cung cấp một nguồn protein quan trọng cho con người, một số loại đậu, đỗ chứa nhiều các acid amin rất quan trọng như lysin và tryptophan. Acid amin là một thành phần quan trọng trong cấu tại nên protein, tham gia nhiều chức năng quan trọng như cấu tạo tế bào, phục hồi mô, cấu tạo nên các kháng thể chống lại vi khuẩn và virus, cấu tạo enzym và hệ thống hormon. Acid amin tạo nên ARN (acid ribo nucleic), ADN (acid deoxy nucleic) vận chuyển oxy đi khắp cơ thể và tham gia vào hoạt động của các cơ. Acid amin được cung cấp cho cơ thể từ thực phẩm giàu protein. Có 22 acid amin quan trọng đối với cơ thể , trong đó có 9 acid amin thiết yếu, là các acid amin cơ thể không tự tổng hợp được gồm histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, threonin, tryptophan và valin. Sự thiếu hụt acid amin dẫn đến cơ thể mệt mỏi, hạ đường huyết, dị ứng [30]. Giá trị của một loại thức ăn không những phụ thuộc vào số lượng chất đạm có trong thức ăn ấy mà còn phụ thuộc vào số lượng và tỷ lệ cân đối các acid amin, nghĩ a là chất lượng của protein thức ăn. Ngoài ra đối với các nước đang phát triển, thức ăn động vật mà protein có chất lượng tốt còn chưa đủ, thì việc phân tích các acid amin cần thiết trong thức ăn thực vật lại càng cần thiết. Nó giúp ta phương hướng phối hợp các thức ăn với nhau để nâng cao chất lượng của protein trong khẩu phần. Vì vậy xác định hàm lượng các acid amin trong thực phẩm là rất c ần thiết. Một nhóm các chất hóa thực vật trong các cây họ đậu được quan tâm nhiều nhất hiện nay là phytoestrogen. Phytoestrogen có cấu trúc hóa học tương tự các hormon oestrogen, oestradiol ở cơ thể động vật và cũng có hoạt tính của oestrogen. Tuy nhiên hoạt tính này thấp hơn nhiều lần so với oestrogen động vật (chỉ bằng khoảng 1/500 đến 1/1000 hoạt tính oestradiol). Vì vậy các phytoestrogen có thể có tác dụng kháng oestrogen bằng cơ chế cạnh tranh tại các receptor của oestrogen [2,3]. Các nhóm phytoestrogen chính trong tự nhiên là isoflavon, coumestan và lignan, trong đó isoflavon là các hợp chất được quan tâm nhất. Isoflavon có nhiều ở thực vật họ đậu, nhất là đậu tương (Glycine max, G. hispida, G. soja) . Hai hợp chất isoflavon quan trong nhất là genistein và daidzein. Gần đây, nhiều nghiên cứu dịch tễ đã cho thấy chế độ ăn có nhiều isoflavon và các lignan có khả năng làm giảm nguy cơ mắc một số bệnh ung thư, tim mạch và các rối loạn ở phụ nữ sau thời kỳ mãn kinh [2,3,4]. M ặc dù chưa có những khẳng định chắc chắn về tác dụng sinh học trong cơ thể người, nhưng nhiều nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ các phytoestrogen có thể đóng vai trò bảo vệ một số bệnh mãn tính, đặc biệt là khả năng phòng và điều trị bệnh ung thư tuyến tiền liệt nhờ khả năng kháng androgen của các hợp chất nhóm này [5,6]. Bên cạnh những tác dụng có lợi c ủa phytoestrogen, tác dụng bất lợi trên cơ thể người cũng đang được nghiên cứu. Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu trên động vật cho thấy chế độ ăn giàu phytoestrogen gây ra một số tác dụng phụ nhưng chưa có nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng bất lợi trên người. Một số nghiên cứu quan sát thấy nguy cơ tăng hội chứng bệnh tự miễn tuyến yên ở trẻ nhỏ khi dùng bột dinh dưỡng bổ sung đậu tương và có liên quan đến sự ức chế hệ thống men peroxidase tuyến yên do isoflavon [33, 34, 35]. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu kỹ lưỡng nào về tác dụng lâu dài của phytoestrogen kể cả tác dụng có lợi và tác dụng bất lợi. Nghiên cứu năm 2001 của Julie và cộng sự [32] khi bổ sung 40mg/ngày trên nam giới tình nguyện khỏe mạnh (lượng isoflavon ăn vào tương đương như ở nhiều nước châu Á) cho thấy không có ảnh hưởng đối v ới hormon gonadotrophin hoặc hormon sinh dục nam. Nghiên cứu này cũng không loại trừ khả năng khi bổ sung phytoestrogen liều cao và trong thời gian dài có thể ảnh hưởng đến sức khỏe sinh sản ở nam giới. Thành phần và hàm lượng các isoflavon trong thực phẩm đã được nghiên cứu và công bố từ nhiều nghiên cứu khác nhau trên thế giới [7,8,9,10,11]. Nhiều cơ sở dữ liệu về các isoflavon hiện nay đã được công bố [7,10]. Để phân tích thành phần các phytoestrogen nói chung và các isoflavon nói riêng, nhiều phương pháp đã được phát triển và được chuẩn hóa tại các phòng thí nghiệm trên thế giới. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược được ứng dụng rộng rãi nhất trong phân tích các isoflavon. Cột sắc ký thường dùng nhất là cột C18 với pha động gồm acetonitril và acid acetic hoặc acid phosphoric. Detector thường dùng trong phân tích các isoflavon là detector UV hoặc photodiode array (PDA) ở bước sóng 249nm và 260nm. Ngoài ra detector điện hóa cũng được ứng dụng trong một số nghiên cứu cho thấy có độ nhạy và chọn lọc cao vớ i các isoflavon. Gần đây, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đã được sử dụng trong phân tích đồng thời các hợp chất daidzein và genistein trong thực phẩm cũng như các mẫu phẩm sinh hóa. Phương pháp sắc ký khí khối phổ thường được áp dụng để xác định lượng vết các isoflavon với độ nhạy cao và rất đặc hiệu. Các phương pháp phân tích isoflavon và phytoestrogen trong thực phẩm hiện vẫn tiếp tục được hoàn thiện nhằ m cung cấp cơ sở dữ liệu phục vụ các nghiên cứu trong lĩnh vực khoa học thực phẩm và y học [12,13,14,15, 16, 17, 18, 19]. Phương pháp cổ điển để phân tích acid amin được phát triển bởi Moore và Stein [44]. Các acid amin tự do được xác định bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion với dẫn xuất sau cột (ninhydrin hoặc o-phthalaldehyde). Cùng với kỹ thuật này, nhiều phương pháp mới đã được phát triển và ứng dụng để phân tích acid amin như sắ c ký điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS), sắc ký khí (GC/FID), sắc ký khí khối phổ [36, 37, 39, 40, 41, 42, 46, 47]. Mỗi phương pháp có ưu điểm và những hạn chế riêng. Trong điều kiện phòng thí nghiệm của Viện Dinh dưỡng phương pháp dẫn xuất trước cột với 6-aminoquinolyl-N-hydroxysucinimidyl carbamate (AQC) cho phép xác định cả acid amin bậc 1 và bậc 2 với detector huỳnh quang ( λ Ex =250 nm; λ Em =395 nm). Phương pháp sử dụng AQC làm chất tạo dẫn xuất là đã được áp dụng phổ biến trên thế giới để xác định acid amin trong nhiều đối tượng thực phẩm, như phân tích acid amin trong thức ăn trẻ em [42]. Hiện nay, không chỉ riêng nước ta mà nhiều nước khác trên thể giới đang phải tiếp tục giải quyết tình trạng nghèo đói và suy dinh dưỡng. Trong khi đó, thừa dinh dưỡng kèm theo các bệnh mẵn tính như tim mạ ch và tiểu đường đang trở nên một thách thức lớn trong giai đoạn chuyển tiếp hiện nay. Vấn đề thừa cân và béo phì ở một bộ phận dân cư đô thị (trẻ em, học sinh, lứa tuổi trung niên) và một số bệnh mạn tính có liên quan đến dinh dưỡng như tăng huyết áp và đái tháo đường đang nổi lên có ý nghĩa sức khỏe cộng đồng [20]. Để giải quyết vấn đề này c ần thiết phải kết hợp nhiều giải pháp chiến lược, trong đó đảm bảo một chế độ ăn lành mạnh và phù hợp là một trong những giải pháp rất quan trọng. Các nghiên cứu về vai trò các chất có hoạt tính sinh học trong chế độ ăn đối với các bệnh mãn tính như tim mạch, béo phì và tiểu đường là rất cần thiết trong giai đoạn hiện nay. Để thực hiện những nghiên cứ u này, cần thiết phải xây dựng các cơ sở dữ liệu đối với các hoạt chất sinh học trong tự nhiên như các carotenoids, sterols, flavonoid, isoflavonoid Trong chế độ ăn của người châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng, các thực phẩm từ đậu tương chiếm một vị trí quan trọng. Theo kết quả Tổng điều tra dinh dưỡng năm 2000 của Viện Dinh dưỡng, mức tiêu thụ thực phẩm nhóm đậu, đỗ đã tă ng lên đáng kể trong năm 2000, với khoảng 6 g/người/ ngày so với 2,8g/người/ngày trong năm 1990. Đậu phụ, loại thực phẩm giàu đạm thực vật thông dụng ở Việt Nam cũng có mức tiêu thụ tăng lên đến 13,4 g/người/ngày trong năm 2000 so với 6,8g/người/ngày trong năm 1990 [31]. Tuy nhiên, việc phân tích các thành phần có hoạt tính sinh học trong thực phẩm Việt Nam còn hạn chế, chủ yếu mới có số liệu của một số loại carotenoid trong rau, quả. Số liệu phân tích các acid amin trong thực ph ẩm Việt Nam còn thiếu, đặc biệt đối với một số acid amin quan trọng như lysin. Những nghiên cứu, phân tích về thành phần dinh dưỡng và đặc biệt các thành phần có hoạt tính sinh học trong thực phẩm nhóm đậu, đỗ và các sản phẩm chế biến ở nước ta còn chưa đầy đủ. Nhằm bổ sung và hoàn thiện số liệu của Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam và cung cấp số liệu cho các nghiên cứu dinh d ưỡng, việc xác định thành phần một các acid amin quan trọng như lysin, methionin và số chất hóa thực vật như genistein và daidzein là rất cần thiết. Vì vậy, đề tài này được thực hiện nhằm bước đầu xác định hàm lượng một số isoflavon và acid amin trong thực phẩm nhóm đậu, đỗ và sản phẩm chế biến, phục vụ cho công tác nghiên cứu chế độ ăn trong phòng và điều trị bệnh. 2. Mục tiêu của đề tài Mục tiêu chung: Phân tích hàm lượng genistein, daidzein và 17 acid amin quan trọng trong đậu tương và hai loại sản phẩm chế biến nhằm bước đầu cung cấp số liệu cho Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam Mục tiêu cụ thể: - Áp dụng và chuẩn hóa phương pháp phân tích genistein, daidzein và 17 acid amin trong đậu và sản phẩm chế biến - Xác định hàm lượng hai loại phytoestrogen chủ yếu (genistein, daidzein) và 17 acid amin chính trong đậu tương và sản phẩm chế biến 3. Phương pháp nghiên cứu 3.1. Hóa chất, dụng cụ 3.1.1. Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong đề tài là các hóa chất tinh khiết phân tích. Acetonitril, methanol, ethanol, n-hexan, acid chlorhydric và acid acetic được mua của hãng Merck (Đức), aceton được mua của hãng Riedel-de Haen (Đức). Nước cất sử dụng trong phân tích là nước cất 2 lần và được lọc qua màng lọc 0,45 µ m. Các dung môi pha động đều được lọc qua màng 0,45 µ m trước khi sử dụng. Chất chuẩn daidzein (tinh khiết 98%) và genistein (tinh khiết 98%) được mua từ hãng Sigma (Mỹ). Màng lọc dung môi pha động PVDF 47 mm x 0,45 µ m của hãng Pall Coporation (M ỹ), giấy chỉ thị màu vạn năng pH 1-14 của Merck (Đức). Chất tạo dẫn xuất 6- aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl carbamat, hỗn hợp chuẩn 17 acid amin của hãng Waters (Mỹ), các chuẩn đơn từng acid amin của hãng Prolabo (Pháp). Pha các dung dịch chuẩn: Chất chuẩn gốc daidzein và genistein được pha trong methanol và có nồng độ tương ứng là 120 µ g/ml và 80 µ g/ml tương ứng. Dung dịch chuẩn làm việc được pha loãng bằng methanol đến nồng độ 1,2 µ g/ml và 0,8 µ g/ml tương ứng. Các dung dịch chu ẩn được bảo quản ở 0 o C. Chuẩn hỗn hợp (17 acid amin) được pha từ dung dịch có chứa 2,5 mmol/ µ l cho tất cả các acid amin và 1,25 mmol/ µ l đối với cystin trong HCl 20 mmol để được dung dịch chuẩn làm việc có chứa 100 pmol/ µ l đối với 17 acid amin và 50 pmol/ µ l đối với cystein. Dung dịch chuẩn làm việc được bảo quản trong lọ màu sẫm bảo quản bằng tủ lạnh âm sâu -20 0 C dùng được trong vòng 1 tháng. Các chuẩn đơn được hoà tan trong nước và bảo quản trong môi trường acid với các điều kiện tương tự như chuẩn hỗn hợp. 3.1.2. Dụng cụ, thiết bị Hệ thống sắc ký được sử dụng là của hãng Waters (Mỹ), gồm bơm dung môi 2690 có bộ phận bơm mẫu tự động, detector PDA 2996, detector huỳnh quang 2475, phần mềm Empower. Cột sắc ký dùng cho phân tích acid amin là cột Amino acid AccQ-Tag (150mm x 4,6mm x 3,5 µ m) của hãng Waters (Mỹ ). Đề tài sử dụng các dụng cụ thông thường phòng thí nghiệm gồm máy ly tâm, bể siêu âm, máy lắc ngang, máy lắc ống nghiệm, bếp cách thủy và các dụng cụ thủy tinh. 3.2. Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích Đề tài triển khai áp dụng một số phương pháp đã công bố trên thế giới, khảo sát và chọn lựa các điều kiện phân tích phù hợp nhất với phòng thí nghiệm. Phương pháp được lựa chọn sẽ được thẩm đị nh và đưa ra quy trình phân tích trên mẫu thực. 3.3. Phương pháp lấy mẫu phân tích Nghiên cứu này sử dụng phương pháp lấy mẫu phân tầng [21]. Đây là phương pháp phù hợp nhất trong việc phân tích và xây dựng cơ sở dữ liệu các thành phần thực phẩm. Quần thể thực phẩm được phân tầng theo vùng địa lý, theo mùa, theo mức độ tiêu thụ, hoặc theo khu vực phân phối trên thị trường, các điểm bán lẻ Trong đề tài này, mẫu được lự a chọn ngẫu nhiên từ các chợ bán lẻ trên thị trường Hà Nội và số liệu thu được sẽ đại diện cho khu vực này. Đối tượng mẫu: gồm 3 loại thực phẩm 1. Đậu tương (đậu nành) 2. Các sản phẩm chế biến từ đậu tương: đậu phụ, sữa đậu nành Cỡ mẫu Cỡ mẫu được tính toán và ước lượng theo công thức sau [21] N ≥ (t α n-1 ) 2 SD 2 / (A x µ ) 2 trong đó: N là cỡ mẫu A là độ chính xác của kết quả phân tích (có giá trị 0,1 hoặc 0,05) µ là giá trị trung bình (kết quả phân tích) của quần thể, thu được từ các nghiên cứu trước đây SD độ lệch chuẩn của giá trị trung bình t là giá trị thu được từ bảng thống kê chuẩn (bảng Student), với α là giới hạn tin cậy (95% hoặc 99%) Tính toán cỡ mẫu cụ thể dựa theo bảng sau (đối v ới đậu nành): Thông số (đậu nành) Daidzein (mg/100g) Genistein (mg/100g) µ 20,16 67,47 SD 3,03 13,40 t ( α =0,05) 2,069 2,069 Độ chính xác 0,1 (0,05) 0,1 (0,05) Cỡ mẫu yêu cầu với độ chính xác 0,1 10 17 Cỡ mẫu yêu cầu với độ chính xác 0,05 39 69 Như vậy, để có số liệu đảm bảo độ chính xác 0,1, cần lấy 10 mẫu phân tích daidzein và 17 mẫu phân tích genistein, tương tự để đảm bảo độ chính xác 0,05, cần lấy 39 mẫu phân tích daidzein và 69 mẫu phân tích genistein. Trong khuôn khổ của đề tài này chúng tôi chọn cỡ mẫu phân tích tối thiểu là n = 17, với độ chính xác là 0,1. Tổng số mẫu phân tích cho 3 loại thực phẩm là 17 x 3 = 51 mẫu Các chỉ tiêu phân tích: 17 loại acid amin và hai loại isoflavon là daidzein và genistein. Thu thập mẫu Mẫu được thu thập bằng cách bốc thăm ngẫu nhiên từ các chợ đại diện cho 9 quận nội thành Hà Nội, gồm Chợ Thái Hà, chợ Hôm, chợ Mơ, chợ Trương Định, chợ Hàng Da, chợ Ngã Tư Sở, chợ Thành Công, chợ Lê Quý Đôn và chợ Ngô Sĩ Liên. 4. Kết quả và bàn luận 4.1. Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích acid amin 4.1.1. Giai đoạn thuỷ phân mẫu Theo một số tác giả [24, 25, 28] phươ ng pháp chủ yếu dùng để thuỷ phân tách các acid min ra khỏi thực phẩm là thuỷ phân trong môi trường acid chlorhydric có nồng độ cao. Quy trình thuỷ phân và phân tích mẫu như sau: Cân 0,5-1,0 g mẫu (hoặc 10 ml sữa) vào ống nghiệm thành dày ↓ Thêm 10ml HCl 15% Loại không khí bằng nitơ, đậy kín ↓ Thủy phân ở 125 o C trong 23 giờ ↓ Để nguội, đuổi hết HCl dư ↓ Định mức bằng HCl 20 mmol ↓ Tạo dẫn xuất ↓ Xác định trên HPLC bằng detector huỳnh quang Tạo dẫn xuất Hút 0,5 ml mẫu pha trong HCl 20mM vào lọ 1,5ml có nắp, thêm 70 µ l borate để tạo môi trường dẫn xuất có pH = 8,2 - 9,7, lắc trên máy lắc ống nghiệm, thêm 20 µ l AQC (3mg/ml trong acetonitril), lắc đều bằng tay khoảng 1 phút. Đậy kín, ủ ở 55 o C trong 10 phút (mẫu sau dẫn xuất ổn định ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 tuần). 4.1.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) - LOD được xác định bằng nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó cho các pic có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N =3). Để xác định giới hạn phát hiện, nạp chất chuẩn với nồng độ thấp nhất định nằm trong khoảng tuyến tính và tính theo công thức sau: LOD = C s *3h n /2h s (h n : chiều cao nhiễu, dung dịch có nồng độ C s cho chiều cao h s ) - LOQ: là nồng độ chất phân tích tại đó có tín hiệu 10 lần nhiễu đường nền (S/N = 10). LOQ = LOD*3,3 Bảng 1: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp TT Acid amin LOD (µg/ml) LOQ (µg/ml) 1 Acid aspartic 0,033 0,108 2 Serin 0,026 0,086 3 Acid glutamic 0,028 0,093 4 Glycin 0,023 0,075 5 Histidin 0,013 0,042 7 Arginin 0,053 0,174 8 Threonin 0,053 0,176 9 Alanin 0,061 0,200 10 Prolin 0,090 0,298 11 Cystein 0,026 0,085 12 Tyrosin 0,015 0,051 13 Valin 0,009 0,029 14 Methionin 0,043 0,142 15 Lysin 0,181 0,598 16 Isoleucin 0,089 0,295 17 Leucin 0,008 0,026 18 Phenylalanin 0,008 0,026 4.1.3. Khoảng tuyến tính Để tiến hành xác định khoảng tuyến tính của phương pháp phân tích, chúng tôi pha một dãy chuẩn có nồng độ từ 0,1 đến 100 µ g/ml cho 17 acid amin, từ 0,05 đến 50 µ g/ml đối cystin và tiến hành đo cho tất cả các acid amin. Kết quả cho thấy đồ thị tuyến tính trong khoảng 0,2 đến 100 µ g/ml cho 17 acid amin, còn 0,1 đến 50 µ g/ml đối cystin với hệ số tương quan đạt được từ 0,997 đến 0,9998 cho tất cả các acid amin. 4.1.4. Độ lặp lạ i của phương pháp Để khảo sát độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm trên 3 loại mẫu. Mỗi loại mẫu tiến hành phân tích trên 6 mẫu. Độ lệch chuẩn được tính theo công thức: 1 )( 1 2 2 − − = ∑ = n mtbmi S n i Độ lệch chuẩn tương đối được tính theo công thức: RSD = s*100/X TB Bảng 2: Kết quả về độ lặp lại hàm lượng trong mẫu hạt đậu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 N x TB S RSD Các acid amin g/ 100g g/ 100g (%) Acid aspartic 4,444 4,435 4,511 4,421 4,431 4,507 6 4,453 0,040 0,91 Serin 1,615 1,627 1,634 1,594 1,605 1,629 6 1,613 0,016 1,01 Acid glutamic 8,97 8,952 9,105 8,82 8,943 9,078 6 8,988 0,104 1,15 Glycin 2,406 2,431 2,442 2,382 2,399 2,435 6 2,411 0,024 1,01 Histidin 1,879 1,875 1,907 1,816 1,873 1,901 6 1,882 0,033 1,76 Arginin 4,01 4,051 4,073 3,969 3,997 4,058 6 4,018 0,042 1,03 Threonin 2,062 2,058 2,093 2,041 2,056 2,087 6 2,066 0,020 0,96 Alanin 2,564 2,559 2,603 2,539 2,557 2,595 6 2,569 0,024 0,95 Prolin 2,77 2,765 2,812 2,742 2,762 2,803 6 2,776 0,027 0,96 Cystein 0,172 0,171 0,174 0,173 0,169 0,174 6 0,172 0,002 1,13 Tyrosin 1,702 1,699 1,728 1,685 1,697 1,723 6 1,706 0,016 0,97 Valin 2,108 2,104 2,146 2,087 2,152 2,134 6 2,112 0,028 1,33 Methionin 0,902 0,9 0,915 0,893 0,899 0,913 6 0,904 0,009 0,95 Lysin 1,849 1,845 1,877 1,781 1,843 1,903 6 1,853 0,041 2,22 Isoleucin 2,002 1,998 2,032 1,982 1,996 2,026 6 2,006 0,019 0,95 Leucin 3,582 3,575 3,636 3,547 3,572 3,625 6 3,59 0,034 0,95 Phenylalanin 3,468 3,461 3,52 3,433 3,457 3,509 6 3,475 0,033 0,96 Hình 1: Sắc đồ các chuẩn 17 acid amin bằng dẫn xuất AQC. Cột AccQ-Tag (150mm x 4,6mm x 3,9 µ m). Tốc độ dòng 1ml/phút, nhiệt độ cột 35 o C, chương trình dung môi như mục 4.3.1. Detector huỳnh quang , λ Ex =250 nm; λ Em =395 nm Bảng 3: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu trong mẫu hạt đậu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 N x TB S RSD Các acid amin Phót phót (%) Acid aspartic 14,12 14,16 14,24 14,29 14,13 14,23 6 14,20 0,07 0,48 Serin 15,64 15,69 15,77 15,82 15,59 15,66 6 15,69 0,09 0,55 Acid glutamic 16,46 16,52 16,60 16,66 16,53 16,54 6 16,55 0,07 0,42 Glycin 17,76 17,35 17,91 17,95 17,65 17,77 6 17,73 0,22 1,22 Histidin 18,41 18,49 18,58 18,64 18,59 18,58 6 18,55 0,08 0,45 Arginin 21,26 21,29 21,31 21,33 21,27 21,32 6 21,30 0,03 0,13 Threonin 21,42 21,50 21,48 21,53 21,53 21,47 6 21,49 0,04 0,19 Alanin 22,07 22,10 22,13 22,14 22,18 22,12 6 22,12 0,04 0,17 Prolin 23,37 23,40 23,42 23,42 23,39 23,41 6 23,40 0,02 0,08 Cystein 26,42 26,13 26,16 26,45 26,13 26,16 6 26,24 0,15 0,57 Tyrosin 26,76 26,80 26,82 26,80 26,75 26,78 6 26,79 0,03 0,10 Valin 27,90 27,93 27,96 27,95 27,94 27,95 6 27,94 0,02 0,08 Methionin 28,46 28,50 28,52 28,51 28,51 28,53 6 28,50 0,02 0,09 Lysin 31,12 31,15 31,17 31,16 31,14 31,16 6 31,15 0,02 0,06 Isoleucin 31,91 31,94 31,96 31,96 31,95 31,95 6 31,95 0,02 0,06 Leucin 32,51 32,55 32,57 32,56 32,56 32,56 6 32,55 0,02 0,07 Phenylalanin 33,99 34,04 34,06 34,05 34,05 34,06 6 34,04 0,03 0,08 Bảng 4: Kết quả về độ lặp lại hàm lượng trong mẫu đậu phụ Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 N x TB S RSD Các acid amin g/ 100g g/ 100g (%) Acid aspartic 0,303 0,312 0,307 0,290 0,302 0,306 6 0,303 0,008 2,51 Serin 0,371 0,370 0,367 0,367 0,369 0,375 6 0,370 0,003 0,80 Acid glutamic 1,071 1,069 1,087 1,102 1,068 1,084 6 1,080 0,014 1,25 Glycin 0,379 0,379 0,385 0,376 0,368 0,384 6 0,379 0,006 1,62 Histidin 0,435 0,434 0,454 0,431 0,434 0,440 6 0,438 0,008 1,93 Arginin 1,514 1,511 1,505 1,499 1,509 1,532 6 1,512 0,011 0,74 Threonin 0,612 0,611 0,621 0,606 0,610 0,619 6 0,613 0,006 0,95 Alanin 0,162 0,161 0,164 0,157 0,161 0,164 6 0,162 0,003 1,61 Prolin 0,235 0,234 0,238 0,221 0,234 0,237 6 0,233 0,006 2,71 Cystein 0,068 0,068 0,069 0,066 0,068 0,069 6 0,068 0,001 1,41 Tyrosin 0,601 0,600 0,610 0,589 0,599 0,608 6 0,601 0,008 1,25 Valin 0,204 0,204 0,207 0,212 0,204 0,207 6 0,206 0,003 1,58 Methionin 0,070 0,070 0,071 0,068 0,070 0,071 6 0,070 0,001 1,91 Lysin 0,413 0,412 0,419 0,409 0,412 0,418 6 0,414 0,004 0,95 Isoleucin 0,213 0,212 0,216 0,221 0,212 0,215 6 0,215 0,003 1,51 Leucin 0,349 0,348 0,354 0,356 0,348 0,353 6 0,351 0,003 0,95 Phenylalanin 0,752 0,751 0,763 0,756 0,750 0,761 6 0,755 0,006 0,75 [...]... hm lng tng acid amin l cao nht so vi u cỏc ch khỏc 10,6% Kt qu hm lng tng 17 acid amin trong u ph theo Bng thnh phn ca USA l 14,9% Kt qu ti Bng 17 cho thy, trong thnh sa u nnh cú cỏc acid amin cn thit cho c th Trong 8 ch c tin hnh thu thp mu, phõn tớch v ly giỏ tr trung bỡnh cho thy tng hm lng 18 acid amin nm trong khong 11 18mg/lit Trong ú ngoi acid glutamic cú t l cao nht mt s acid amin khụng... 0 ,17 0,15 0,24 0,15 Kt qu ti Bng 15 cho thy, trong thnh phn ca ht u tng cú cỏc acid amin cn thit cho c th Trong 7 ch c tin hnh thu thp mu, phõn tớch v ly giỏ tr trung bỡnh cho thy tng hm lng 18 acid amin nm trong khong 33 40% Trong ú ngoi acid glutamic cú t l cao nht mt s acid amin khụng thay th cng cú hm lng khỏ cao nh phenylalanin, leucin, isoleucin, threonin, valin v lysin Kt qu hm lng tng 17 acid. .. threonin, valin v lysin Kt qu hm lng tng 17 acid amin trong ht u tng theo Bng thnh phn ca USA l 37,99% Kt qu ti Bng 16 cho thy, trong thnh phn ca u ph cú cỏc acid amin cn thit cho c th Trong 6 ch c tin hnh thu thp mu, phõn tớch v ly giỏ tr trung bỡnh cho thy tng hm lng 18 acid amin nm trong khong 7 10% Trong ú ngoi acid glutamic cú t l cao nht mt s acid amin khụng thay th cng cú hm lng khỏ cao nh phenylalanin,... thời gian lu trong mẫu đậu phụ Cỏc acid amin Ln 1 Ln 2 Ln 3 Ln 4 Ln 5 Ln 6 N Phút xTB S RSD (%) phút Acid aspartic 13,91 13,98 13,89 14,10 13,58 13,71 6 13,86 0,19 1,36 Serin 15,50 15,57 15,47 15,64 15,13 15,26 6 15,43 0,20 1,27 Acid glutamic 16,35 16,42 16,30 16,45 15,94 16,07 6 16,26 0,21 1,26 Glycin 17, 22 17, 30 17, 17 17, 32 16,80 16,94 6 17, 13 0,21 1,21 Histidin 18,41 18,49 18,34 18,44 17, 95 18,08... 7: Kết quả độ lặp lại thời gian lu trong mẫu sữa đậu nành Cỏc acid amin Ln 1 Ln 2 Ln 3 Ln 4 Ln 5 Ln 6 N Phút xTB S RSD (%) phút Acid aspartic 13,74 13,87 13,84 13,85 13,86 13,72 6 13,81 0,07 0,48 Serin 15,30 15,44 15,41 15,43 15,45 15,31 6 15,39 0,07 0,44 Acid glutamic 16,11 16,27 16,24 16,27 16,26 16,12 6 16,21 0,08 0,46 Glycin 16,99 17, 12 17, 10 17, 14 17, 12 17, 09 6 17, 09 0,05 0,31 Histidin 18,13 18,28... thiờn i vi daidzein l 11,6% v vi genistein l 8,6%, thu hi i vi daidzein l 103,7 111,6 % v vi genistein l 107,2 112,1% 5.1.2 ti ó phõn tớch 51 mu gm u tng, u ph v sa u nnh Kt qu nh sau: - Ht u tng, u ph v sa u nnh cú cỏc acid amin cn thit cho c th Tng hm lng 17 acid amin trong u tng chim khong 33 40% khi lng, khong 710% khi lng trong u ph, v cú khong 11-18 mg acid amin/ lớt sa u nnh Trong cỏc... cao nh arginin, phenylalanin, leucin, tyrosin, threonin v lysin Kt qu hm lng tng 17 acid amin trong sa u nnh theo Bng thnh phn ca USA l 3,65% Cú s khỏc bit ln v nng tng 17 acid amin so vi bng thnh phn ca M cú th l do s khỏc nhau v m c ca loi sa u nnh do quy trỡnh sn xut khỏc nhau Hình 9 Sắc đồ các acid amin trong hạt đậu tơng Ct AccQ-Tag (150mm x 4,6mm x 3,9àm) Tc dũng 1ml/phỳt, nhit ct 35oC, chng... đồ mẫu sữa đậu nành chợ Văn Chơng Cột Luna C18 (2), tốc độ dòng 1ml/phút Gradient nh Bảng 1 Detector PDA ở 260 nm 5 Kt lun v khuyn ngh 5.1 Kt lun 5.1.1 ti ny ó ng dng v chun húa cỏc iu kin phõn tớch nh lng 17 acid amin v hai loi isoflavon v daidzein v genistein trong ht u tng, u ph v sa u nnh - Phng phỏp cú bin thiờn i vi cỏc loi acid amin l 0,2-7,5%; thu hi i vi cỏc loi acid amin nm trong khong... 0,022 2,958 98,2 Phenylalanin 3,759 0,028 3,786 98,4 Các acid amin Bảng 9: Kết quả độ thu hồi với nền mẫu đậu phụ Các thông số Các acid amin Acid aspartic Serin Acid glutamic Glycin Histidin Arginin Threonin Alanin Prolin Cystein Tyrosin Valin Methionin Lysin Isoleucin Leucin Phenylalanin Hàm lợng trong Hàm lợng chuẩn thêm mãu (g/100g) n = 3 vào (mg/100g) 0,292 0,341 1,035 0,348 0,391 1,333 0,559 0,158... ký: Ct Luna (2) C18, 250 mm x 4.6 mm, c ht 5àm Pha ng A: Acid acetic 0,1 %; pha ng B: Acetonitril 80% trong acid acetic 0,1% Chng trỡnh dung mụi: bng 11 (mc 4.2.1) Detector PDA bc súng 260 nm, nhit bung ct l 35oC 4.4 Kt qu phõn tớch mu 4.4.1 Kt qu phõn tớch cỏc acid amin Bng 15 Hm lng trung bỡnh cỏc acid amin trong mu ht u tng Hm lng cỏc acid amin (g/100g) Tờn mu Asp Ser Glu Gly His Arg Thr Ala Pro . dụng và chuẩn hóa phương pháp phân tích genistein, daidzein và 17 acid amin trong đậu và sản phẩm chế biến - Xác định hàm lượng hai loại phytoestrogen chủ yếu (genistein, daidzein) và 17 acid amin. thực hiện nhằm bước đầu xác định hàm lượng một số isoflavon và acid amin trong thực phẩm nhóm đậu, đỗ và sản phẩm chế biến, phục vụ cho công tác nghiên cứu chế độ ăn trong phòng và điều trị bệnh kết quả đề tài khoa học công nghệ BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DAIDZEIN, GENISTEIN VÀ 17 ACID AMIN TRONG ĐẬU TƯƠNG VÀ SẢN PHẨM CHẾ BIẾN Chủ nhiệm đề tài: ThS. Lê Hồng Dũng