Nghiên cứu quy trình xác định nhanh vi khuẩn lao và lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Đề tài này được đặt ra nhằm vào các mục tiêu sau: 1. Đặc điểm dịch tễhọc phân tửcủa vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng đa thuốc. 2. Xây dựng qui trình xác định nhanh các chủng vi khuẩn lao và lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử. 3. Xây dựng qui trình chế tạo các bộ kit xác định nhanh các chủng vi khuẩn lao và lao kháng thuốc ởViệt Nam. 3 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. VI KHUẨN LAO VÀ BỆNH LAO Bệnh lao là bệnh truyền nhiễm đã xuất hiện h

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ QUỐC PHÒNG

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.10

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

TÊN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH NHANH VI

KHUẨN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC

BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ QUỐC PHÒNG

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.10

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

TÊN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH NHANH

VI KHUẨN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

TS Nguyễn Thái Sơn PGS.TS Hoàng Văn Lương

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ

Hà Nội – 2010

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 VI KHUẨN LAO VÀ BỆNH LAO 3

1.1.1 Vi khuẩn lao 3

1.1.2 Bệnh lao 9

1.2 DỊCH TỄ PHÂN TỬ CỦA VI KHUẨN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC 21

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO 26

1.3.1 Các phương pháp truyền thống 26

1.3.2 Các phương pháp miễn dịch 28

1.3.3 Các phương pháp sinh học phân tử 29

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC 35

1.4.1 Phương pháp xác định kiểu hình .35

1.4.2 Phương pháp xác định kiểu gen 38

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 47

2.1 VẬT LIỆU 47

2.1.1 Các chủng vi khuẩn lao, mẫu bệnh phẩm và vector .47

2.1.2 Các primer và probe 48

2.1.3 Các hóa chất, nguyên liệu khác .49

2.1.4 Các môi trường, hoá chất sử dụng trong nuôi cấy và xác định vi khuẩn lao 50

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng thuốc 51

2.2.1.1 Thu thập, bảo quản các chủng vi khuẩn lao và mẫu bệnh phẩm 51

2.2.1.2 Phương pháp thuần nhất mẫu bệnh phẩm đờm 53

2.2.1.3 Nuôi cấy vi khuẩn lao .53

2.2.1.4 Phương pháp kháng sinh đồ xác định tính kháng thuốc 55

2.2.1.5 Tách chiết ADN vi khuẩn lao .56

2.2.1.6 Khuếch đại các đoạn gen đích bằng PCR 57

2.2.1.7 Phương pháp spoligotyping .59

2.2.1.8 Tách dòng gen rpoB và katG phục vụ cho giải trình tự 60

2.2.1.9 Phát hiện đột biến liên quan kháng đa thuốc bằng các phương pháp sinh

học phân tử 61

2.2.2 Xây dựng quy trình chẩn đoán phát hiện nhanh vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử 62

2.2.2.1 Tạo panel mẫu chuẩn 63

2.2.2.2 Thiết kế các primer nhân các đoạn gen đích 63

2.2.2.3 Thiết kế probe phát hiện tính kháng thuốc 66

2.2.3 Tạo các bộ kit xác định nhanh các chủng vi khuẩn lao và lao kháng thuốc ở Việt Nam 66

2.2.3.1 Tạo bộ kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao .66

2.2.3.2 Tạo bộ kit multiplex realtime PCR phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng đa thuốc 69

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 71

3.1 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ PHÂN TỬ VI KHUẨN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC 71

3.1.1 Thu thập các chủng vi khuẩn lao trên toàn quốc 71

3.1.2 Đặc điểm phân tử vi khuẩn lao ở Việt Nam .72

3.1.3 Đặc điểm phân typ vi khuẩn lao ở Việt Nam .76

3.1.3.1 Mô hình phân tử chủng lao khu vực miền Bắc (spoligotype) 77

3.1.3.2 Mô hình phân tử chủng lao khu vực miền Trung .79

3.1.3.3 Mô hình phân tử chủng lao khu vực miền Nam .81

3.1.4 Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng thuốc ở Việt Nam 83

3.1.4.1 Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao nhạy cảm thuốc 83

3.1.4.2 Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng đơn thuốc 86

3.1.4.3 Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng đa thuốc 89

3.1.4.4 Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao siêu kháng thuốc 91

3.1.5 Dịch tễ học phân tử của vi khuẩn lao Việt Nam 92

3.1.5.1 Phân bố dòng theo khu vực nghiên cứu của vi khuẩn lao Việt Nam .92

3.1.5.2 Phân bố dòng theo đặc điểm kháng thuốc của vi khuẩn lao Việt Nam .95

3.1.5.3 Phân bố dòng theo đặc điểm kháng thuốc và theo khu vực của vi khuẩn lao Việt Nam 97

3.1.5.4 Phân bố chủng lao Việt Nam theo tuổi và giới tính bệnh nhân và theo khu vực 100

3.1.5.5 Phân bố chủng lao Việt Nam theo tuổi bệnh nhân và mức độ kháng thuốc 103

3.1.5.6 Mối liên quan giữa phân bố dòng vi khuẩn lao Việt Nam và tuổi bệnh

nhân 105

3.1.5.7 Mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao Việt Nam theo dòng .108

3.1.5.8 Mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao Việt Nam theo dòng và theo khu vực 110

3.1.6 Đặc điểm đột biến ở các gen liên quan kháng thuốc của vi khuẩn lao ở Việt Nam 111

3.1.6.1 Phát hiện đột biến trên gen katG 112

3.1.6.2 Phát hiện đột biến trên gen rpoB 117

3.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN NHANH VI KHUẨN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 124

3.2.1 Xây dựng quy trình chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao 124

3.2.1.1 Xây dựng quy trình tách chiết ADN của vi khuẩn lao .124

3.2.1.2 Tạo panel mẫu chuẩn 127

3.2.1.3 Quy trình multiplexPCR chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao .129

3.2.2 Xây dựng quy trình chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc 141

3.2.2.1 Quy trình chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc bằng giải trình tự ADN 141

3.2.2.2 Quy trình chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc bằng realtime PCR 150

3.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẾ TẠO CÁC BỘ KIT XÁC ĐỊNH NHANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC Ở VIỆT NAM .163

3.3.1 Xây dựng quy trình chế tạo bộ kit xác định nhanh vi khuẩn lao 163

3.3.1.1 Tạo master mix .163

3.3.1.2 Nghiên cứu thử nghiệm độ nhạy, độ đặc hiệu và ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR trên panel mẫu 163

3.3.1.3 Đánh giá hiệu quả chẩn đoán của kit mPCR trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng 166

3.3.2 Kết quả chế tạo thử nghiệm kit multiplex PCR 171

3.3.3 Kiểm tra tính ổn định của kit multiplex PCR .172

3.3.4 Chứng nhận bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ 175

3.3.5 Xây dựng quy trình và sản xuất kit chẩn đoán phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng đa thuốc 176

3.3.5.1 Chế tạo thử nghiệm kit realtime PCR 176

3.3.5.2.Nghiên cứu thử nghiệm, đánh giá kit realtime PCR trên panel mẫu chuẩn 178

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN 183

4.1 Dịch tễ học phân tử vi khuẩn lao và lao kháng thuốc 183

4.2 Xây dựng được một số quy trình chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng thuốc 183

4.3 Chế tạo được một số bộ kit chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng thuốc 184

CÁC KẾT QUẢ KHÁC 184

KIẾN NGHỊ 184

TÀI LIỆU THAM KHẢO 185

MỞ ĐẦU

Lao là một bệnh truyền nhiễm và đã từng được Tổ chức y tế thế giới (WHO) khuyến cáo về tình trạng khẩn cấp toàn cầu Vi khuẩn lao

(Mycobacterium tuberculosis) hiện đang gây nhiễm cho khoảng 1/3 dân số thế

giới (hơn 2 tỷ người) và ước tính mỗi năm có khoảng 8 triệu trường hợp nhiễm mới và 2 triệu người chết [70]

Việt Nam đứng thứ 12 trong số 22 quốc gia có gánh nặng bệnh nhân lao cao trên thế giới Một trong những nhân tố góp phần gia tăng bệnh lao là những khó khăn trong quá trình chẩn đoán Phát hiện nhanh vi khuẩn lao dựa vào phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen các mẫu bệnh phẩm nghi lao, nhiều trường hợp cho âm tính giả khi số lượng vi khuẩn lao ≤ 104 vi khuẩn/ml Nuôi cấy vi khuẩn lao được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán nhưng trên môi trường Lowenstein phải mất khoảng 4-8 tuần mới cho kết quả Trên hệ thống nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC mất khoảng 2 tuần, nếu làm kháng sinh đồ mất thêm ít nhất 2 tuần nữa, do vậy khó đáp ứng yêu cầu giám sát và thanh toán bệnh lao [62] Hiện nay, nhờ áp dụng các phương pháp sinh học phân tử vào chẩn đoán vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng thuốc, khắc phục được đặc điểm mọc rất chậm của vi khuẩn lao, rút ngắn thời gian chẩn đoán lao từ 4-8 tuần theo cách nuôi cấy tự nhiên xuống còn 2-4 ngày Kỹ thuật sinh học phân

tử được sử dụng rộng rãi nhất là phản ứng PCR khuếch đại gen đích IS6110, đây là một trình tự chèn (IS - Insertion Sequence) có nhiều bản copy (khoảng

4-20 bản copy) đặc hiệu cho chủng Mycobacterium tuberculosis complex

Việt Nam hiện có một vài công ty xây dựng kít thương phẩm chẩn đoán vi khuẩn lao sử dụng gen đích là IS 6110 như công ty Nam Khoa, Việt Á Tuy nhiên, một số nghiên cứu gần đây cho thấy có khoảng 5-8% chủng lao tại Đông Nam châu Á, Việt Nam và Ấn Độ khuyết đoạn gen này trong bộ gen [24] [27] [63] [37] [68], vì vậy một số xét nghiệm cho kết quả âm tính giả Nhằm khắc phục tình trạng trên, một số tác giả trên thế giới đề xuất sử dụng một số gen đích khác trong PCR chẩn đoán vi khuẩn lao như IS1081; 23S rDNA [24] [68] [62] Nhưng cho đến nay chưa có tác giả nào trong nước đề xuất hoặc công bố quy trình PCR mới cho chẩn đoán vi khuẩn lao ở Việt Nam

Đặc biệt, tình hình kháng thuốc của vi khuẩn lao tại Việt Nam đang là

tỷ lệ kháng thuốc tiên phát là 32,5% vào loại cao trên thế giới Tỷ lệ kháng đa thuốc chung là 4%, trong đó tỷ lệ đa kháng thuốc thứ phát là 19,3%, tỷ lệ đa kháng thuốc tiên phát là 2,7% Ước tính đến 2015, số ca tử vong do lao khoảng 14.000 người Trong đó kháng với rifampicin và isoniazid được quan tâm nhất, vì đây là những kháng sinh chủ lực trong phác đồ điều trị lao Việc chẩn đoán và điều trị lao kháng thuốc gặp rất nhiều khó khăn, tốn kém cả về vật chất, công sức và thời gian Trên thế giới, một số kít thương phẩm chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc như INNO-LIPA RMP TB kit (Bỉ); Geno type MTB assay kit (Đức)… Tuy nhiên hiện nay chưa có dữ liệu đầy đủ

về đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở Việt Nam nên không

có cơ sở để sử dụng kit này, hơn nữa giá thành các bộ kít thương mại này không phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam Hiện trong nước chưa có kit thương phẩm chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc, do vậy việc nghiên cứu và phát triển kit chẩn đoán lao và lao kháng thuốc ở Việt Nam là cần thiết

Vì vậy, đề tài này được đặt ra nhằm vào các mục tiêu sau:

1 Đặc điểm dịch tễ học phân tử của vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VI KHUẨN LAO VÀ BỆNH LAO

Bệnh lao là bệnh truyền nhiễm đã xuất hiện hàng nghìn năm nay, nhưng phải đến ngày 24/3/1882 nhà bác học người Đức- Robert Koch lần đầu tiên

phát hiện ra vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) (vì vậy còn được gọi

là Bacilie de Kock- BK) Đây là một mốc quan trọng trong lịch sử y học bởi

đã tìm ra nguyên nhân của căn bệnh vô cùng nguy hiểm cho cả thế giới vào thời điểm đó Sau này, ngày 24/3 hàng năm được lấy làm ngày phòng chống lao trên toàn thế giới

1.1.1 Vi khuẩn lao

1.1.1.1 Giới thiệu vi khuẩn lao

Vi khuẩn lao có tên khoa học là Mycobacterium tuberculosis Thực chất

tác nhân gây bệnh lao là một phức hợp gồm nhiều loài được gọi chung là

Mycobacterium tuberculosis complex Các loài trong phức hợp này là tác nhân

gây nên bệnh lao trên các vật chủ khác nhau Khả năng gây bệnh của các loài

là khác nhau, trong đó loài gây bệnh thường xuyên trên người là

như cành cây Tuy nhiên cũng tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và thời gian nuôi cấy mà vi khuẩn có kích thước và hình dạng thay đổi, từ cầu trực khuẩn đến trực khuẩn dài [67]

Vi khuẩn không di động, không sinh bào tử, khó bắt màu các thuốc

nhuộm thông thường do có lớp sáp ở thành tế bào Mycobacterium

tuberculosis được xếp vào nhóm vi khuẩn Gram dương, tuy nhiên khi nhuộm

Gram vi khuẩn bắt màu rất yếu hoặc không giữ được màu thuốc nhuộm Thường nhuộm theo phương pháp Ziehl - Neelsen, trực khuẩn lao không bị cồn và acid làm mất màu của carbonfuchsin, bắt màu đỏ

Trực khuẩn lao có cấu trúc rất phức tạp, hoàn hảo, ít vi sinh vật nào có được Dưới kính hiển vi điện tử trực khuẩn lao có cấu trúc như sau:

- Cấu trúc vách tế bào

Lớp vách của trực khuẩn có vai trò rất quan trọng Cấu trúc của lớp này ngoài đảm bảo cho sự tồn tại của trực khuẩn, làm cho trực khuẩn bền vững đối với hiện tượng thực bào, khi xâm nhập vào cơ thể trực khuẩn lao khó bị tiêu diệt, ảnh hưởng rất lớn đến khả năng gây bệnh của trực khuẩn [38]

Mycobacterium tuberculosis có cấu trúc vách tế bào phức tạp, chia thành

4 lớp, lớp trong cùng là cấu trúc màng có thành phần chủ yếu là các phospholipid Các phân tử phospholipid lại bao gồm hai nhóm, nhóm ưa nước hướng về bên trong và nhóm kị nước hướng về bên ngoài, quay ra phía vỏ Lớp tiếp theo là peptidoglican liên kết với đường arabinose và các phân tử mycolic acid tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vỏ vi khuẩn có độ cứng nhất định Lớp ngoài là lớp được tạo nên bởi sự liên kết giữa các mycolic acid và các chất lipid phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấu trúc làm tăng khả năng chống thấm nước của thành

vi khuẩn giúp trực khuẩn tồn tại lâu với môi trường bên ngoài, chống khả năng

bị huỷ diệt bởi đại thực bào và các tế bào miễn dịch Lớp ngoài cùng có cấu trúc peptidoglycolipid, đây là lớp chỉ thấy ở vi khuẩn lao phát triển bên trong

tế bào, nó có tác dụng tăng cường như một lớp áo giáp cho các vi khuẩn nằm

trong tế bào chống được các enzyme phân giải từ các lysozyme của tế bào

Hình 1.2 Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn lao

Cấu trúc khá hoàn hảo trên đây của lớp vỏ giúp cho trực khuẩn lao chống lại được mọi yếu tố tác động của môi trường bên ngoài, chống lại được tác động của acid và các chất kiềm ở một nồng độ nhất định

- Hạt nhân

Hạt nhân chứa các acid nucleic, ở vi khuẩn lao việc thông tin di truyền ngoài vai trò của thể nhiễm sắc (chromosom) còn có vai trò của plasmid nằm ngoài nhiễm sắc thể Có thể, thể nhiễm sắc của trực khuẩn đã chuyển một số thông tin di truyền nào đó cho plasmid vì plasmid có kích thước phân tử nhỏ hơn nó nên dễ truyền thông tin từ tế bào này sang tế bào khác Như vậy, trong

cơ chế kháng thuốc của trực khuẩn lao ngoài nhiễm sắc thể, plasmid cũng đóng vai trò quan trọng

Ngoài thể siêu lọc như trên, trực khuẩn lao còn tồn tại dưới thể L Đó là các trực khuẩn lao mất một phần hoặc toàn bộ cấu trúc vỏ vi khuẩn, hạt nhân biến đổi nhìn không rõ, bào tương thuần nhất, ít các hạt hơn trực khuẩn lao thông thường, nhìn bề ngoài trên kính hiển vi điện tử thể L có dạng hình cầu, sinh sản theo kiểu nẩy chồi, không thể nuôi cấy ở môi trường thông thường

Về mặt sinh học thể L chuyển hóa rất ít, hầu như không chịu tác dụng của các thuốc chống lao Thể L thực chất có thể là hình thức tồn tại của loại trực khuẩn lao nằm vùng dai dẳng trong cơ thể, có vai trò quan trọng trong việc tái phát bệnh lao Theo dõi hình thể L có thể sẽ giúp cho công tác điều trị, có thể

dự đoán khả năng tái phát của bệnh

* Đặc điểm nuôi cấy

Trực khuẩn lao là vi khuẩn ưa khí bắt buộc, không mọc được ở điều kiện kị khí Nhiệt độ thích hợp để mọc là 37oC Hầu như không mọc ở nhiệt

độ dưới 37oC hoặc trên 42oC

Trực khuẩn lao rất hiếu khí, phát triển tốt nhất khi pO2 là 100 mmHg và pCO2 là 40 mmHg Đỉnh phổi và vùng phổi dưới xương đòn hay mắc lao nhất (pO2 120-130 mmHg khi đứng) rồi đến thân xương và đầu xương (pO2 là 100 mmHg) Gan lách, dạ dày, thực quản ít mắc lao hơn vì pO2 thấp

Không nuôi được vi khuẩn lao ở môi trường thông thường, phải nuôi ở môi trường đặc biệt, giàu chất dinh dưỡng, chứa trứng, khoai tây, xitrat, glixerol, asparagin, xanh malachit Môi trường thường dùng là môi trường đặc Loewenstein được cải tiến bởi Jensen, hoặc môi trường lỏng Sauton

Trực khuẩn lao là vi khuẩn mọc chậm, thời gian một thế hệ của

Mycobacterium tuberculosis khoảng 18 giờ, phải 4-6 tuần sau mới hình thành

khuẩn lạc điển hình, dạng R Trong điều kiện tự nhiên vi khuẩn lao có thể tồn tại 3 đến 4 tháng nơi tối ẩm, trong điều kiện phòng thí nghiệm người ta có thể giữ và bảo quản chúng trong nhiều năm Tuy nhiên dưới ánh sáng mặt trời

trực tiếp thì sau 30 phút vi khuẩn lao sẽ bị tiêu diệt Dưới ánh sáng của tia cực tím, vi khuẩn lao chỉ tồn tại được 2 đến 3 phút ở nhiệt độ 42o C vi khuẩn lao ngừng phát triển, ở nhiệt độ 80oC vi khuẩn lao chết sau 10 phút

1.1.1.2 Đặc điểm hệ gen của vi khuẩn lao

Bộ gen hoàn chỉnh của Mycobacterium tuberculosis chủng H37Rv có

chiều dài 4.411.532 bp - bao gồm 3794 gen, trong đó có 3924 gen mã hóa cho protein và 50 gen mã hóa cho các RNA chức năng; đây là genome có kích thước rất lớn, đặc tính là chứa nhiều Guanine và Cystosine (G + C khoảng 65%) và không thay đổi hầu như trên toàn bộ genome (điều này khẳng định cho giả thuyết rằng hầu như không có sự chuyển gen theo chiều ngang giữa các vi khuẩn) Chỉ một số rất ít các vùng có sự chênh lệch trong tỷ lệ G+C Một nhóm các gen đáng chú ý với tỷ lệ G+C cao (>80%) duy nhất trong vi khuẩn và thuộc

về họ protein PE và PPE Những nhóm có G+C thấp (<50%) là các nhóm mã hóa cho các protein xuyên màng hoặc mã hóa sự tổng hợp polypeptide Sự khác biệt này đối với tỷ lệ G+C thấp được giải thích là hậu quả của tính kỵ nước bắt buộc của các acid amine - là điều cần thiết đối với mọi protein xuyên màng nào được mã hóa bằng các đơn vị mã hóa có tỷ lệ G+C Bộ gen của vi khuẩn lao có chứa tới 90,8 % trình tự được dự đoán là có mã hóa cho protein và chỉ có 8 gen giả (pseudogene - gen không mang thông tin di truyền mã hóa cho protein) [43] Trong hệ gen của phần lớn các vi khuẩn thường có nhiều operon rRNA (operon

rrn) nằm gần vị trí khởi đầu tái bản Tuy nhiên hệ gen của vi khuẩn lao chỉ có

duy nhất 1 operon rrn cách vị trí khởi đầu tái bản 1,5Mb Điều này góp phần lý

giải về tốc độ sinh trưởng rất chậm của vi khuẩn đặc biệt này [17]

Một trong những đặc tính được quan tâm nhiều nhất của Mycobacterium

tuberculosis là nghiên cứu sự có mặt và phân bố của các trình tự chèn (IS),

trong đó đặc biệt là đoạn IS6110 Thể gen của M tuberculosis H37Rv có 16

bản sao IS6110 và 6 bản sao IS1081; tuy nhiên chỉ có 95% số chủng vi khuẩn

lao có chứa 4-20 bản sao IS6110 Bộ gen của Mycobacterium tuberculosis

thiếu hệ thống MutS có tác dụng sửa chữa các lỗi trong bắt cặp nucleotide Tuy

nhiên sự tái bản ở vi khuẩn lao lại rất chính xác do sự có mặt của gần 45 gen

liên quan đến cơ chế sửa chữa DNA bao gồm cả 3 bản sao của gen mutT mã

hóa cho loại enzyme chịu trách nhiệm cho việc loại bỏ các Guanin bị oxy hóa trong quá trình tái bản- nguyên nhân gây ra sự bắt cặp sai [32, 34]

1.1.1.3 Phân loại vi khuẩn lao

Trong hệ thống sinh giới, vi khuẩn lao được phân loại như sau:

Loài: Mycobacterium tuberculosis

Các chủng vi khuẩn lao được chia làm 2 nhóm:

M tuberculosis complex (MTBC) gồm 4 loài có khả năng gây bệnh lao:

- M tuberculosis

- M bovis

- M africanum

- M microti

Trong đó M tuberculosis gây bệnh phổ biến nhất

Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm nhiều loài không

gây bệnh lao ở người:

- M avium

- M ortuitum

- M govdovac

- M kansisii

1.1.2 Bệnh lao

Bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay Trên thế giới, chưa bao giờ và không có một quốc gia nào, một khu vực nào, một dân tộc nào không có người mắc bệnh lao và chết do lao Bệnh lao được phát hiện từ trước công nguyên ở Ấn Độ, Ai Cập, Hy Lạp và các nước vùng Trung Á Năm 1908, Mantoux dùng phương pháp tiêm tuberculin trong

da để phát hiện dị ứng lao Cũng trong năm đó, Calmette và Guérin nghiên cứu vaccine phòng lao và đã thành công vào năm 1921 (vaccine BCG- Bacillus Calmette-Guérin) Đến năm 1944, Waksmann tìm ra kháng sinh chữa lao đầu tiên là streptomycine, năm 1952, thuốc isoniazid được đưa vào điều trị lao Năm 1965, thuốc rifampicin được nghiên cứu thành công và năm 1978, cơ chế và tác dụng của pyrazynamide được xác định Những thuốc này cùng với việc tiêm chủng phòng lao bằng vaccine BCG đã làm thay đổi được tình hình lao trên thế giới

Do sự phát minh các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa lao đơn giản hơn và hiệu quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng lạc quan của y giới, đã làm lãng quên căn bệnh nguy hiểm này Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại và cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát triển

Năm 1993, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó trong tương lai là bệnh lao kháng thuốc

1.1.2.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3 dân số thế giới) Theo số liệu công bố của WHO [73], ước tính trong năm

2006 có thêm khoảng 9,3 triệu người mắc lao mới và 2,4 triệu người chết do lao Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động

Trong đó, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao [6]

Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 85%, nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 44% số bệnh nhân ước tính Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo ước tính của WHO, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người) [73] Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực Đông - Nam châu Á

Cuối thập niên 70 đầu thập niên 80 ở một số nước phát triển đã tưởng như chế ngự được hoàn toàn bệnh lao, do đó bệnh lao đã đi vào quá khứ bởi sự lãng quên của các nhà y học và khoa học Tuy nhiên thực tế lại không như vậy bởi sự xuất hiện của cơ chế kháng lại thuốc kháng sinh của khuẩn lao, khiến cho việc phát hiện và điều trị ngày càng trở nên khó khăn và tốn kém

Vì vậy bệnh lao vẫn tiếp tục là một trong ba căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới cùng với hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) và sốt rét Điều này đã một lần nữa khơi dậy các nghiên cứu sâu hơn trong phương pháp phát hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh lao Bệnh lao là kết quả của nghèo đói và nghèo đói lại là nguyên nhân làm cho bệnh lao phát triển

1.1.2.2 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam

Việt nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu Trong khu vực Tây - Thái Bình Dương, Việt nam đứng thứ ba sau Trung quốc và Philippin về số lượng bệnh nhân lao lưu hành cũng như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm [49] Theo chương trình Chống lao Quốc gia, mỗi ngày có gần 400 người mắc bệnh lao, trong đó hơn 75% thuộc lứa tuổi lao động, tỷ lệ tử vong do lao là 26/100.000 dân [10] Chỉ số nguy cơ nhiễm lao ước tính chung cả nước là 1,7%, miền Bắc 1,2%, miền Nam 2,2% Tổng số nhiễm lao ước tính khoảng 44% dân số Số liệu điều tra dịch tễ học của Chương trình chống lao quốc gia năm 2006 cho thấy tỉ lệ mắc lao mới các thể

là 173/100.000 dân, tỉ lệ lao AFB (+) là 77/100.000 dân, tỉ lệ hiện mắc lao các

thể là 225/100.000 dân, tỉ lệ tử vong do lao là 23/100.000 dân

Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt nam

đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một trong những Chương trình y tế Quốc gia trọng điểm (Chương trình chống lao quốc gia - CTCLQG) [7]

Năm 1996, Chương trình chống lao quốc gia với sự hỗ trợ về kỹ thuật

và tài chính của Chính phủ Hà Lan, Hiệp hội chống lao Hoàng gia Hà Lan, Uỷ ban hợp tác y tế Hà Lan - Việt nam, CTCLQG đã hình thành và xây dựng kế hoạch phòng chống lao giai đoạn 1996-2000 Đến năm 1999, chiến lược DOTS (điều trị bằng hoá trị liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp) đã được bao phủ 100% số huyện trên cả nước

Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục tiêu của WHO là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi AFB(+) với tỷ lệ khỏi là 92%

Năm 2002, khu vực Tây-Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới Trong đó, số bệnh nhân

do CTCLQG Việt nam phát hiện chiếm 12% bệnh nhân các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới

Với những kết quả đạt được trong chỉ tiêu phát hiện và điều trị bệnh nhân, năm 1996, Việt nam là nước đầu tiên ở Châu Á đã đạt được mục tiêu của WHO Việt nam đã được WHO và Ngân hàng thế giới đánh giá cao thành tích đạt được trong mọi hoạt động chống lao Từ năm 1997, WHO và Hiệp hội Bài lao và Bệnh phổi Quốc tế cùng phối hợp với CTCLQG Việt Nam tổ chức

8 khoá học về quản lý Chương trình chống lao cho các học viên quốc tế tại Việt Nam Mô hình hoạt động chống lao ở Việt nam được xem là mô hình để học viên các nước học tập

Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở các tỉnh phía Nam là 2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%)

Trên thực tế có thể chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5% như vậy các con số nêu trên có thể còn lớn hơn Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác chống lao không những trong những năm tới mà có thể còn trong thời gian khá dài, ngay cả khi đã bước sang thiên niên kỷ mới

1.1.2.3 Bệnh lao kháng thuốc và cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao

* Bệnh lao kháng thuốc

Vi khuẩn lao kháng thuốc đang là một trở ngại lớn đối với công tác phòng chống lao toàn cầu Theo thông báo của WHO năm 2007 [71, 73], tỷ lệ lao kháng đa thuốc là 4,8% Tỷ lệ lao kháng thuốc tiên phát với ít nhất 1 loại thuốc là 17% (từ 0% đến 56,3%), kháng isoniazid là 10,3%, kháng đa thuốc thay đổi từ 0% đến 22,3% Trường hợp kháng thuốc thứ phát: kháng ít nhất 1 loại thuốc là 35%, kháng isoniazid là 27,7%, tỷ lệ kháng đa thuốc là 15,3%, tỷ

lệ kháng đa thuốc mở rộng là 7,0% Tại Uzbekistan tỷ lệ đa kháng thuốc lên đến 60,0%, Azerbaijan là 55,8% Trung Quốc, Ấn Độ, Liên bang Nga là những nước có tỷ lệ lao kháng thuốc lớn nhất Hiện nay 69 nước và vùng lãnh thổ được xác định là xảy ra lao kháng đa thuốc, và 45 nước xuất hiện lao kháng đa thuốc mở rộng Theo ước tính của WHO, tỷ lệ lao kháng đa thuốc

mở rộng tăng từ 1 triệu ca đến 1,5 triệu ca trong khoảng thời gian từ 2-3 năm

Vi khuẩn lao kháng đa thuốc đang là một thách thức lớn cho toàn cầu Trong khi thuốc chống lao hàng đầu chỉ có 5 thuốc, thì thuốc chống lao loại hai thường có độc tính cao và giá thành rất đắt Những người mắc bệnh lao với chủng vi khuẩn kháng đa thuốc mở rộng cần phải điều trị trên 2 năm so với từ 6-8 tháng trước đây và chi phí điều trị cũng tăng lên gấp 100 lần

Tại Việt Nam, theo CTCLQG năm 2006, tình hình kháng thuốc của vi khuẩn lao tại Việt Nam đang là một vấn đề đáng lo ngại, tỷ lệ kháng thuốc tiên phát là 30,7% vào loại cao trên thế giới Tỷ lệ kháng đa thuốc chung là 4%,

trong đó tỷ lệ đa kháng thuốc thứ phát là 19.3%, tỷ lệ đa kháng thuốc tiên phát

là 2,7% Ước tính đến 2015, số ca tử vong do lao khoảng 14.000 [73]

Thuốc kháng sinh đầu tiên dùng để điều trị lao là streptomycin, nhưng sau vài năm sau khi kháng sinh này được sử dụng thì người ta đã nhận thấy hiện tượng đề kháng lại streptomycin của vi khuẩn lao Sau đó các kháng sinh chống lao khác tiếp tục ra đời: para - aminosalysilic, isoniazid, rifampicin,… nhưng đều không mang lại hiệu quả sau một thời gian điều trị nhất định Khả năng điều trị thành công có thể đạt 95 - 100 % đối với những bệnh nhân mắc lao thông thường, trong khi tỷ lệ thành công với bệnh nhân mắc lao kháng thuốc là 20 - 30 %, thậm chí còn không điều trị được khi mắc lao kháng đa thuốc và kháng thuốc phổ rộng mặc dù đã dùng kết hợp đến năm loại kháng sinh điều trị lao Vì vậy, việc phát hiện và ngăn chặn sự lan truyền các chủng lao đa kháng thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong điều trị lao hiện nay

Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao được định nghĩa là sự giảm mức

mẫn cảm của Mycobacterium tuberculosis trong in vitro làm cho chúng có sự

khác biệt với các chủng dại chưa bao giờ tiếp xúc với thuốc kháng sinh Trong các trường hợp lao kháng thuốc cần phải phân biệt:

Lao kháng thuốc là những trường hợp vi khuẩn lao kháng với một

trong những thuốc chống lao dòng thứ nhất: isoniazid, rifampin, pyrazinamide, ethambutol hoặc streptomycin

- Lao kháng đa thuốc (MDR-TB): là vi khuẩn lao kháng ít nhất với cả 2

loại thuốc là isoniazid và rifampicin, đây là 2 loại thuốc chống lao dòng thứ nhất thường được sử dụng đầu tay để điều trị cho tất cả các bệnh nhân, và có thể kháng thêm một số tác nhân hoá trị liệu khác

- Lao đa kháng thuốc phổ rộng (XDR-TB): là sự đề kháng với isoniazid

và rifampin cộng với fluoroquinolone và ít nhất 1 trong số 3 thuốc chống lao dòng thứ hai dùng đường tiêm (amikacin, kanamycin hoặc capreomycin)

Kháng thuốc tiên phát là kháng thuốc xẩy ra ở một bệnh nhân trước đó chưa sử dụng một liệu pháp điều trị chống lao nào, còn kháng thuốc thứ phát

là sự phát triển của kháng thuốc trong hoặc sau liệu pháp điều trị bằng hoá chất Kháng thuốc tự nhiên là tính kháng thuốc của các chủng kiểu dại với các

thuốc đặc hiệu Ví dụ: tất cả các chủng M bovis kiểu dại đều có tính kháng thuốc tự nhiên với pyrazinamide, Mycobacterium tuberculosis có tính kháng

tự nhiên với penicillin

* Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao

Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao là một sự khuếch đại nhân tạo của một hiện tượng tự nhiên liên quan đến sự phát sinh các đột biến một cách ngẫu nhiên ở các gen nằm trong vùng nhân của tế bào vi khuẩn Không giống với nhiều vi khuẩn khác, vi khuẩn lao không có sự chuyển gen kháng thuốc giữa các vi khuẩn thông qua các gen nhảy hoặc plasmid, Các chủng vi khuẩn lao kiểu dại không tiếp xúc với các thuốc chống lao sẽ không bao giờ xuất hiện tính kháng thuốc ngoại trừ tính kháng thuốc tự nhiên của các loài vi khuẩn với

một số thuốc như M bovis kháng pyrazinamide, M tuberculosis kháng

penicillin,

Trong quá trình nhân lên của trực khuẩn lao, tính kháng thuốc được phát triển theo những trật tự xác định Trong mỗi ổ lao thường có khoảng 107 tế bào trở lên trong khi đó tần số xuất hiện đột biến liên quan đến tính kháng isoniazid của vi khuẩn lao khoảng 10-7 đến 10-9 còn tần số đột biến kháng rifampicin là khoảng 10-10 Tính kháng thuốc do sự phát sinh ngẫu nhiên các đột biến liên quan này được gọi là tính kháng di truyền Khi không có mặt của thuốc kháng sinh, các chủng vi khuẩn lao mẫn cảm thuốc phát triển lấn át các chủng kháng thuốc Sự có mặt của thuốc kháng sinh trong điều trị đã cung cấp một áp lực chọn lọc cho các chủng vi khuẩn lao Các chủng mẫn cảm bị ức chế sinh trưởng, thậm chí bị tiêu diệt, các chủng kháng thuốc trở thành ưu thế hình thành tính kháng thuốc thu được, đặc biệt là trong các bệnh nhân có chứa một lượng lớn trực khuẩn lao Sự lây lan của các chủng kháng thuốc này sang những người khác làm cho những người này bị nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc ngay từ đầu (tính kháng thuốc sơ cấp)

Tính kháng nhiều loại thuốc khác nhau của vi khuẩn liên quan đến sự có mặt đồng thời các đột biến ở các gen đặc hiệu Ví dụ, tính kháng isoniazid của

vi khuẩn lao có tần số là từ 10-7 đến 10-9, sự xuất hiện các đột biến liên quan đến tính kháng rifampicin có tần số khoảng 10-10, và sự xuất hiện các đồng thời các đột biến liên quan đến tính kháng cả 2 loại thuốc này có tần số khoảng 10-14 Tuy nhiên, trong một quần thể vi khuẩn chỉ kháng isoniazid, các đột biến ngẫu nhiên phát sinh có thể dẫn đến tính kháng rifampcin ở một vài cá thể Khi bệnh nhân được điều trị bằng tổ hợp isoniazid và rifampicin, các chủng kháng cả 2 loại thuốc này sẽ được chọn lọc phát triển ưu thế Tương tự như vậy,

sự xuất hiện của các đột biến có thể dẫn đến tính kháng tổ hợp các loại thuốc kháng sinh khác ở vi khuẩn lao

Hình 1.3 Cơ chế phát triển tính kháng thuốc ở vi khuẩn lao (WHO, 1996)

Bảng 1.1 Vị trí các gen liên quan đến kháng thuốc ở MTB (Multidrug-resistance)

60

<10

- Kháng rifampicin: Rifampicin (RIF) được đưa vào sử dụng trong điều

trị chống lao vào đầu những năm 1970 và là một thành phần rất quan trọng

trong điều trị Cơ chế tác động của RIF liên quan đến ức chế enzyme RNA

polymerase phụ thuộc DNA, enzyme này là một phức oligomer bao gồm 4

tiểu đơn vị khác nhau (a, b, b9), và được mã hoá bởi các gen rpoA, rpoB,

rpoC, rpoD) có thể xẩy ra một trong hai dạng là core enzyme (a2bb9) và

holoenzyme (a2bb9 plus s)

RIF gắn với tiểu đơn vị b của RNA polymerase (rpoB), enzyme chịu

trách nhiệm cho sao chép và biểu hiện của các gen ở mycobacteria, kết quả là

ức chế hoạt động sao chép của vi khuẩn

Chẩn đoán phân tử của tính kháng rifampin là phù hợp nhất vì các

nghiên cứu chỉ ra rằng tính kháng thuốc là do đột biến ở vùng lõi của gen

rpoB Các phương pháp phân tử đã được tận dụng bao gồm đọc trình tự tự

động trực tiếp vùng đích đã được khuếch đại của gen rpoB Khuếch đại vùng

đích bằng PCR tiếp đó là bằng phân tích tính đa hình các sợi đơn (SSCP) và

thử nghiệm có thể thương mại hoá dựa trên khuếch đại vùng đích bằng PCR

sau đó lai mẫu dò thẳng với các đầu dò oligonucleotide (INNO-LiPA Rif TB

kit, Innogenetics, Zwijnaarde, Belgium) Dữ liệu từ một số nghiên cứu chỉ ra

rằng khoảng 95% chủng M tuberculosis lâm sàng kháng rifampin mang các

đột biến điểm riêng biệt hoặc các đột biến thêm đoạn, mất đoạn định vị trong

vùng lõi 81 bp (vùng xác định tính kháng rifampin) của rpoB (các codon 507

đến 533) mã hoá cho 27 acid amin Đây là mối tương quan chặt chẽ của sự thay thế acid amin đặc biệt và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Các đột biến mất nghĩa tiêu biểu ở codon 516/ 526/531 cho kết quả kháng rifampin

ở mức cao trong khi đó những sự thay đổi acid amin ở vị trí 514 hoặc 533 thường cho kết quả kháng rifampin ở mức thấp Các nghiên cứu trước đó chỉ

ra rằng 45% các chủng có các đột biến mất nghĩa ở codon 531 (S531) trong khi 35% các chủng kháng thuốc có sự thay đổi codon 526 (H526) dẫn đến thay thế acid amin Các đột biến này không có trong các sinh vật mẫn cảm Tuy nhiên, các nghiên cứu cụ thể hơn được tiến hành từ các vùng khác nhau trên thế giới đã chỉ ra rằng tần số của các đột biến đặc biệt thay đổi đáng kể giữa các cộng đồng dân tộc và các vùng địa lý Tuy nhiên cơ chế kháng thuốc chưa được xác định ở gần 5% các chủng lâm sàng kháng rifampin khi không

có đột biến nào được phát hiện ở vùng lõi 81 bp hoặc ở đâu đó trong gen rpoB khi những chủng này được xác nhận tính kháng rifampin bởi xét nghiệm tính mẫn cảm chuẩn, điều này cho thấy một phần nhỏ của các chủng kháng rifampin sẽ không được phát hiện bởi các phương pháp phân tử so với thử nghiệm tính mẫn cảm thuốc kiểu hình thông thường

- Kháng isoniazid: Isoniazid là một thuốc tổng hợp, cơ bản được sử dụng

chủ yếu để điều trị nhiễm các thành viên M tuberculosis complex (M

tuberculosis, M bovis, M africanum và M microti) như là tất cả mycobacteria

khác và các prokaryote khác kháng với isoniazide Các chủng mẫn cảm của M

tuberculosis có MIC nhỏ hơn 0.05 mg/ml Cơ sở phân tử của tính kháng với

isoniazid phức tạp hơn và được gây ra bởi đa dạng đột biến trong 4 gen khác

nhau của M tuberculosis, katG mã hoá catalase peroxidase, inhA mã hoá

enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase, kasA mã hoá cho b-ketoacyl A C

P synthase và ahpC mã hoá cho alkylhydroperoxide reductase Mặc dù thế,

gần 5-10% các chủng M tuberculosis kháng isoniazid không có một đột biến

có thể xác định Tính kháng isoniazid ở mức cao có liên quan đến lâm sàng chủ yếu là do các đột biến thêm đoạn/ mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/

vô nghĩa bên trong gen katG Đối với sự đề kháng INH, đột biến trên gen katG

hay gặp nhất ở vị trí 315 [12, 64] Sự thay thế Ser315Thr xảy ra ở khoảng 60% chủng kháng sự thay thế này trong gen katG đã chỉ ra trực tiếp là dẫn tới tính kháng cao với isoniazid Đột biến S315T được đi kèm bởi sự mất đi vị trí enzyme giới hạn ở vị trí này Do đó đột biến nhầm nghĩa có thể được phát hiện

30-dễ dàng bằng phân tích giới hạn các đoạn được khuếch đại (PCR-RFLP) Sự

kiện và tính lan truyền của đột biến này trong các chủng M tuberculosis lâm

sàng kháng isoniazid thay đổi đáng kể phụ thuộc vào vùng địa lý và thành phần dân tộc của những cá nhân bị nhiễm Do đó sàng lọc sự thay đổi di

truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc nhanh cho việc phát hiện các chủng lao M tuberculosis kháng isoniazid, cung cấp

tính lan rộng cao của đột biến đặc biệt có thể được thiết lập từ một vùng địa lý xác định

Đột biến thay thế S315T trên gen katG cũng thường đi kèm với biểu hiện của protein alkyl hydroperoxide reductase (ahpC) Sự biến đổi của 5 nucleotide khác đã được xác định ở vùng promoter của gen ahpC, dẫn tới bieur hiện quá mức của ahpC và đề kháng INH

Đột biến xảy ra trên gen inhA sẽ dẫn tới kháng ngay từ đầu với INH và ethionamide (ETH) [13] Sáu vị trí đột biến trong cấu trúc của gen inhA liên

quan đến kháng INH đã được xác định là Ile16Thr, Ile21Thr, Ile21Val, Ile47Thr, Val78Ala and Ile95Pro) [14, 52] Tuy nhiên các đột biến này ít gặp Các nghiên cứu cũng cho thấy khoảng 70-80% các chủng lâm sàng kháng INH

có sự đột biến ở gen katG và inhA [51]

Đột biến xảy ra trên gen kasA dẫn tới sự đề kháng yếu với INH, mà

thường gặp ở các vị trí codon 66 (GAT-AAT), codon 269 (GGT-AGT), codon

312 (GGC-AGC) and codon 413 (TTC-TTA) [51] [46] Tuy nhiên các đột biến này cũng được tìm thấy trên các chủng nhạy cảm với INH [40]

- Kháng Pyrazinamide: Pyrazinamide là một chất cấu trúc tương tự

nicotinamide được sử dụng như một thuốc chống lao cơ bản Thuốc này được đòi hỏi để giết chết những mycobacteria nửa tiềm tàng trong môi trường acid cũng như trong phagolysosomes Pyrazinamide được chuyển thành acid pyrazinoic là dạng thuốc hoạt động, bởi enzym của mycobactera là

pyrazinamidase được mã hoá bởi gen pncA và các chủng M tuberculosis

kháng pyrazinamide thiếu hoạt tính của enzyme

Sự đề kháng với kháng sinh này được cho là có đột biến trên gen pncA Các chủng M tuberculosis lâm sàng mẫn cảm được tìm ra để có trình tự kiểu

dại xác định trong khi 75 -95% các chủng kháng pyrazinamide có một đột biến điểm (nhầm nghĩa/ vô nghĩa hoặc đột biến mất đoạn hoặc thêm đoạn) trải

ra toàn bộ chiều dài của gen pncA Sự đa dạng của các đột biến làm cho nó

không chắc chắn là một phương pháp phân tử phù hợp có thể được đặt ra cho

việc phát hiện nhanh tính kháng pyrazinamide ở các chủng M tuberculosis lâm sàng Thiếu các đột biến pncA lên đến 25% các chủng lâm sàng trong một

số nghiên cứu chỉ ra sự tồn tại ít nhất một gen thêm vào tham gia vào tính kháng pyrazinamide Người ta cũng thấy rằng không phải tất cả các chủng có đột biến đều liên quan đến kháng PZA và các chủng kháng PZA còn liên quan đến các cơ chế khác

- Streptomycin: Streptomycin là một kháng sinh aminoglycoside được sử

dụng như một thuốc cơ bản để điều trị lao Thuốc gắn với 16S rRNA ức chế khởi đầu dịch mã và ảnh hưởng đến tính chính xác của dịch mã trong quá trình

tổng hợp protein Đột biến liên quan đến tính kháng streptomycin ở M

tuberculosis đã được xác định trong gen 16S rRNA (rrs) và gen rpsL mã hoá

cho protein S12 của ribosome Từ đó genom của M tuberculosis có một bản copy gen đơn bản của gen rrn, những thay đổi nucleotide đơn lẻ có thể tiềm ẩn

sinh ra tính kháng với kháng sinh Các đột biến điểm xảy ra ở 65–67% các

chủng kháng STR nằm trên gen rrs and rpsL [51] Các đột biến điểm trong gen rrn được định vị ở hai vòng trung tâm xung quanh nucleotide 530 (C-T ở

vị trí 491, 512 and 516) và 915 (903 (C-A/G) and 904 (A-G)) tác dộng với protein S12 của ribosome Các đột biến điểm sinh ra tính kháng streptomycin

ở mức cao xẩy ra trong gen rpsL, đa số bao gồm codon 43 (AAG-AGG/ACG)

Arg/Thr) và ít thường xuyên hơn trong codon 88(AAGAGG/CAG) Arg/Gln) Tính kháng ở mức thấp đối với streptomycin có thể xẩy ra vì tế bào thay đổi tính thấm nước, sự sinh ra các enzyme sửa đổi aminoglycoside hoặc

(Lys-sự thay đổi các phân tử ribosome khác như một số chủng kháng với MIC

10mg/ml có gen kiểu dại rrs và rpsL Từ đó chỉ khoảng 65-75% các chủng kháng streptomycin mang đột biến trong gen rrs hoặc rpsL, các cơ chế phân tử

khác của sự tồn tại tính kháng với streptomycin, do chẩn đoán phân tử có hiệu

quả tính kháng streptomycin ở các chủng M tuberculosis dường như không

chắc chắn ở giai đoạn này

- Ethambutol: Ethambutol (EMB) (một chất có cấu trúc tương tự

arabinose) là một thuốc chống lao cơ bản cũng ức chế sự kết hợp của acid mycolic với thành tế bào mycobacteria Các nghiên cứu di truyền và hoá sinh chỉ ra rằng tính kháng với ethambutol làm trung gian với đột biến trong gen

embB [58], một trong 3 gen được mã hoá bởi operon embCAB Gen embB mã

hoá một arabinosyl transferase, một protein màng trọn vẹn với 12 domain

xuyên màng bị ức chế bởi thuốc Phân tích trình tự DNA của gen embB từ các

chủng kháng ethambutol chỉ ra rằng vùng xác định kháng EMB (ERDR) ở

embB được định vị trong vòng tế bào chất của domain xuyên màng Gần 50

đến 70% các chủng kháng ethambutol chứa các đột biến mất nghĩa bên trong

ERDR của gen embB với phần lớn chủng mang các thay đổi ở codon 306 [33]

Các nghiên cứu khác nhau dã xác định được 5 vị trí đột biến ở codon 306 (ATG ÆGTG/CTG/ATA/ATC/ATT)) dẫn tới sự thay thế 3 axit amin (Val, Leu and Ile) của các chủng kháng EMB [48] [41] Các đột biến này chiếm 70- 90% of ở các chủng kháng EMB [51] Đột biến mất nghĩa được xác định ở 3

codon thêm vào: Phe285leu, Phe330Val và Thr630Ile Tuy nhiên cũng có khoảng 30% số chủng có kiểu hình đề kháng EMB mà vẫn không xác định

được đột biến trên gen embB

- Với các thuốc chống lao dòng 2, có rất ít các nghiên cứu nhưng cũng

đã chỉ ra được các vị trí đột biến trên các gen chịu trách nhiệm tham gia vào

tác động của thuốc trên M tuberculosis

Thuốc dòng 2 Gen Sản phẩm gen Vị trí đột biến thường

Enoyl-ACP reductase Flavinmonooxygenase Transcriptional repressor

Dịch tễ học phân tử cho phép lần theo dấu vết phân tử để tháo gỡ những vấn đề quan trọng như nguồn lây, tình trạng lan truyền, phân bố các type phân

tử của vi khuẩn lao [11, 25] Bằng cách này, các nhà dịch tễ học có thể xác định type phân tử điển hình của vi khuẩn tại một khu vực, phân biệt các type phân tử lưu hành tại các quốc gia và khu vực khác nhau, tìm hiểu mức độ phát sinh loài, phân biệt được bệnh nội sinh hay ngoại sinh, tái phát hay nhiễm

mới, bệnh do chủng đang lưu hành hay chủng mới xâm nhập [19] Họ có thể điều tra các vụ dịch, các trường hợp nhiễm trùng bệnh viện, nhiễm chéo phòng thí nghiệm nhờ vào việc nghiên cứu và phân tích đặc điểm phân tử của chủng lao phân lập, từ đó hỗ trợ đánh giá hiệu quả của chương trình chống lao, giúp thiết lập các biện pháp phòng chống cần thiết và hiệu quả [25, 28, 42, 65]

Hiện nay, có nhiều phương pháp sinh học phân tử được sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ phân tử vi khuẩn lao và lao kháng thuốc, trong đó các phương pháp như RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), Spoligotyping, MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspered Repetitive Units of Variable Number of Tandem Repead) hiện là các phương pháp đang được sử dụng rộng rãi nhất cho phân loại vi khuẩn lao trong các nghiên cứu dịch tễ học phân tử

và người ta cần phải dựa trên những yếu tố thay đổi nhiều nhất trong loài ấy

Sự đa dạng trong một quần thể nhất định là do các ký hiệu thay đổi mà mỗi ký hiệu đặc biệt cho phép xác định mỗi cá thể một cách riêng biệt Lấy ví dụ trong loài người, khi quan sát nhanh ta rất dễ nhầm lẫn giữa hai người khác nhau Khi muốn phân biệt hai người một cách chắc chắn thì phải dựa trên vân tay của

họ Vân tay có một độ đa dạng tuyệt đối cao vì mỗi người có một vân tay nhất định riêng biệt Phương pháp RFLP cho khả năng tiến hành quan sát độ đa

dạng ở mức độ cao vì nó dựa vào việc phân tích trực tiếp ADN genom mà chính là yếu tố thay đổi nhiều nhất trong tế bào sống Với phương pháp này có thể phân biệt được rõ ràng hai cá thể trong cùng một loài Phương pháp đo đa dạng độ dài đoạn cắt giới hạn được triển khai để phân biệt các cá thể giữa chúng với nhau dựa vào sự đa dạng ở mức độ ADN [1] [66] Những biến đổi giữa các cá thể sẽ thể hiện bằng những hình vạch ADN có chiều dài khác nhau được để lại sau khi ADN genom bị cắt với một enzym giới hạn nhất định Như vậy, mỗi một cá thể đều được nhận ra bởi một hình vạch ADN đặc hiệu

Phương pháp RFLP rất có ích trong việc chẩn đoán bệnh di truyền hoặc các bệnh lây nhiễm Hơn nữa, khả năng phân biệt từng cá thể các chủng vi sinh vật cho phép theo dõi các loại chủng gây bệnh lưu hành ở một vùng nào đấy,

và có thể giúp cho việc cung cấp các số liệu chính xác về cách lây nhiễm và lan truyền của các chủng gây dịch Việc này sẽ đóng góp hiệu quả cho nghiên cứu dịch tễ học để đề ra các chiến lược phòng bệnh Để thực hiện phương pháp này, trước tiên DNA genom của vi khuẩn được cắt bằng enzyme giới hạn để tạo ra các đoạn cắt giới hạn Các đoạn cắt giới hạn được phân tách bằng điện di trên gel agarose Sau khi phân tách người ta lai chúng với một probe có đánh dấu, nhằm phát hiện số lượng và vị trí phân bố của một trình tự đặc hiệu nào

đó có trong nhiễm sắc thể vi khuẩn Trình tự đặc hiệu được lựa chọn để phân tích thường là các trình tự có độ ổn định, độ đặc hiệu và tần xuất lặp lại cao [50, 75] Do probe đã được đánh dấu, tất cả các đoạn giới hạn có mang trình tự

bổ sung với đoạn mồi sẽ được hiển thị sau khi lai với probe, từ đó khi quan sát trên màng lai, mỗi chủng vi khuẩn sẽ tạo nên một hình vạch (fingerprinting) đặc trưng cho từng chủng Các hình vạch này được sử dụng để phân loại vi khuẩn [22] Trình tự được sử dụng phổ biến là trình tự chèn IS6110 đặc hiệu cho vi khuẩn lao Trình tự chèn này có thể có mặt ở các vị trí khác nhau trên genome vi khuẩn sẽ cho kết quả kiểu gen duy nhất rất hữu ích cho việc xác

định đặc điểm các chủng M tuberculosis

1.2.2 Phương pháp MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspered Repetitive Units of Variable Number of Tandem Repead)

Cho tới gần đây, 41 locus chứa các đoạn lặp lại liên tiếp với tần suất lặp lại khác nhau (variable number of tandem repead - VNTR) của đơn vị lặp lại

nằm rải rác trong bộ gen của M tuberculosis (mycobacterial interspered

repetitive units - MIRUs) đã được xác định Trong số 41 cụm nói trên, 12 cụm được xác định là có tần xuất lặp lại đa dạng nhất và mang tính đặc hiệu cao nhất Phương pháp MIRU – VNTR là phương pháp dựa trên việc xác định tần

xuất lặp lại của đơn vị lặp lại trên từng loci bằng kỹ thuật PCR để phân loại M

tuberculosis MIRU-VNTR có độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định cao, rất phù

hợp cho các giám sát dịch tễ học ở qui mô lớn MIRU-VNTR còn được sử

dụng trong phân tích tích đa dạng di truyền của M tuberculosis ở các cấp độ

khác nhau trong nghiên cứu phân nhánh tiến hóa [56]

Tác giả Sonal S Munsiff và cộng sự (2002) đã nghiên cứu tình hình dịch

tễ học phân tử của lao kháng đa thuốc ở thành phố New York từ năm 1995 đến năm 1997, tác giả cũng sử dụng kỹ thuật DNA genotyping dựa trên IS6110 và

kỹ thuật xác định kiểu gen thứ yếu bằng spoligotyping và đọc trình tự DNA các vùng gen đích liên quan đến kháng thuốc [54] Tác giả Francis Drobniewski và cộng sự (2002) đã nghiên cứu các chủng lao kháng thuốc trong các nhà tù ở Nga và nghiên cứu tính ưu thế của các chủng thuộc họ Bắc Kinh, tác giả sử dụng kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn dựa trên IS6110, kỹ thuật PCR, kỹ thuật spoligotyping và variable number tandem repeat (VNTR), epidemological typing (RAPET) để xác định vai trò của các chủng Bắc Kinh và các phương pháp xác định kiểu gen kháng với rifampin, isoniazid và kháng đa thuốc Kết quả cho thấy tỷ lệ kháng với rifampin, isoniazid và kháng đa thuốc xẩy ra lần lượt là 58,2%; 51,6% và 44,7% Phương pháp spoligotyping chứng minh rằng tỷ lệ cao bệnh nhân bị nhiễm với các chủng thuộc họ Bắc Kinh và đa số là kháng với rifampin trong đó tỷ lệ cao nhất xẩy ra ở các nhà tù Các chủng Bắc Kinh kháng rifampin là ưu thế đặc

biệt ở tù nhân [56] Ở Đông Nam Châu Á, tác giả Jeremy W Dale (1999) đã nghiên cứu tình hình dịch tễ học vi khuẩn lao ở Malaysia bằng các phương pháp sinh học phân tử, theo tác giả các chủng liên quan đến họ Bắc Kinh rất phổ biến Những chủng đơn copy phổ biến ở Nam và Đông Nam Châu Á hình thành nên 20% số chủng phân lập từ Peninsula nhưng hầu như không có ở miềm Đông Malaysia Sự khác nhau rõ rệt về địa lý ở các chủng đang thịnh hành không chỉ cho thấy sự phổ biến bị giới hạn của vi khuẩn lao mà còn ở

mức độ ổn định trong mô hình phân định Trong khi đó ở Việt Nam chưa có

một nghiên cứu nào về tình hình dịch tễ học phân tử vi khuẩn lao và lao kháng

thuốc

1.2.3 Phương pháp Spoligotyping

Spoligotyping là phương pháp định týp dựa trên sự đa dạng ADN của những vùng lặp lại trực tiếp (direct repeat - DR) chỉ tìm thấy trên nhiễm sắc

thể của vi khuẩn lao, lần đầu tiên được Hermans phát hiện ở Mycobacterium

bovis BCG Vùng DR bao gồm chuỗi các DR có độ dài 36 bp và giữa các DR

là các đoạn đệm có trình tự ngắn từ 35 đến 41 bp, được gọi là những spacer Đến nay, có 93 những đoạn spacer nằm giữa các DR được xác định, nhưng chỉ

sử dụng 43 đoạn spacer được phát hiện ban đầu trong kỹ thuật Spoligotyping Các chủng lao khác nhau có số lượng DR khác nhau

Bước đầu tiên của phương pháp này là quá trình khuyếch đại ADN, sử dụng cặp mồi gắn sẵn biotin dựa trên ADN đích là trình tự DR và độ dài khác nhau của các spacer giữa các DR sẽ được khuyếch đại Những sản phẩm PCR chứa những spacer đã được khuyếch đại sẽ được lai vuông góc với các probe spacer khác nhau đó được phủ sẵn trên màng Sau khi lai, màng được ủ với Steptavidin peroxidase và chất này được gắn với biotin của sản phẩm PCR Những spacer này biểu hiện như mã nhị phân, kết quả dương tính sẽ xuất hiện spacer và ngược lai kết quả âm tính sẽ không xuất hiện spacer Dựa vào kết quả này có thể định týp vi khuẩn lao Mỗi chủng vi khuẩn lao riêng biệt sẽ có một kiểu hình vạch Spoligonucleotid đặc trưng

Hình 1.4 Nguyên tắc của PCR trong phương pháp spoligotyping

(Dra và Drb: cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR)

Hiện nay, phân tích kết quả phim thu được sau khi tiến hành Spoligotyping, người ta thường biểu thị mô hình spoligo dưới dạng một dãy các con số nhị phân (binary pattern), hoặc mã 8 số (octal code) cho tất cả các

thành viên của Mycobacterium tuberculosis complex Trước tiên mô hình

spoligo được so sánh với cơ sở dữ liệu spolDB4 để quy các mẫu phân tích về

các họ (family) các phân họ (subfamily) Website:

www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVITDemo/ Sau đó, nếu mô hình spoligo này không

tìm thấy tên trên dữ liệu spolDB4, thì chúng được phân tích tiếp với Spotclust,

mô hình này là một thuật toán được xây dựng trên dữ liệu cơ sở của spolDB3

và có thể phân tích sự biến đổi trong vùng DR của mẫu phân tích để đưa các mẫu về các họ và các phân họ Do đó, kết quả của tất cả các nghiên cứu dịch

tễ phân tử M tuberculosis dựa trên kỹ thuật spoligotyping có thể được phân

tích và so sánh trên phạm vi toàn cầu [23] [69] [36] [15] [16]

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO

1.3.1 Các phương pháp truyền thống

Các phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn lao trước đây thường dựa vào phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen sau đó soi trực tiếp trên kính hiển vi Đây

là một phương pháp phát hiện nhanh chỉ trong 3 đến 4 giờ, khá đơn giản và có chi phí rẻ nhưng do đòi hỏi nồng độ của mẫu bệnh phẩm cao (104 vi khuẩn/ml) nên độ nhạy của phản ứng thấp hơn so với các phương pháp nuôi cấy truyền thống Đã có một vài cải tiến được đưa ra chủ yếu dựa trên kỹ thuật ly tâm và

cô đặc để cải thiện độ nhạy phương pháp và đã đạt được nhiều kết quả rất khác nhau, trong đó cho thấy không có sự khác biệt căn bản nào giữa các phương pháp cải tiến nhưng độ nhạy của phản ứng đã được nâng cao Khi so sánh các phương pháp cải tiến này đã thấy được tính nhạy hơn so với các phương pháp hóa học thường dùng trước kia ví dụ như phương pháp tẩy trắng Kính hiển vi huỳnh quang được sử dụng nhằm nâng cao độ nhạy và rút ngắn thời gian chẩn đoán so với các phương pháp truyền thống dựa trên cơ sở của phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen Đây là một trong những phương pháp được dùng trong chẩn đoán tại các nước phát triển, với ưu điểm là cho kết quả nhanh và không đòi hỏi quá khắt khe về kỹ thuật do đó làm giảm những lỗi nhỏ trong quá trình làm thí nghiệm Nhược điểm của phương pháp là giá thành của các hóa chất, thiết bị dùng cho thí nghiệm rất đắt, đó là vấn đề lớn đối với các nước nghèo và có thu nhập thấp

Phương pháp nhuộm diacetate đánh dấu huỳnh quang được sử dụng gần đây nhằm đánh giá sự có mặt cũng như khả năng tồn tại của vi khuẩn trong các mẫu đờm Phương pháp này được đề xuất để phát hiện sớm và chính xác

vi khuẩn lao đã qua điều trị nhưng chưa thành công do giá thành còn cao

Nuôi cấy vi khuẩn lao trước đây được xem là phương pháp tiêu chuẩn trong chẩn đoán phát hiện trong phòng thí nghiệm Đây là phương pháp được thực hiện trong môi trường Lowenstein Nhược điểm của nó là chậm và mất nhiều thời gian (4-8 tuần) Đã có những phương pháp cải tiến trên môi trường nuôi cấy lỏng chẳng hạn như phương pháp BACTEC đánh dấu phóng xạ hay

hệ thống phát hiện tự động mycobacteria MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) sử dụng huỳnh quang và đã làm tăng được tốc độ chẩn đoán Mặc dù vậy thời gian chẩn đoán vẫn chậm (1-3 tuần đối với hệ thống

BACTEC, 7-12 ngày với hệ thống MGIT), do vậy khó đáp ứng được yêu cầu giám sát và theo dõi bệnh lao

Hình 1.5 Mô tả hệ thống phát hiện tự động mycobacteria MGIT trên 2 ống thí nghiệm

(một ống có kết quả dương tính và một ống âm tính)

1.3.2 Các phương pháp miễn dịch

Trong nhiều thập kỷ nay, phản ứng tuberculin skin test (TST) vẫn được

sử dụng để chẩn đoán nhiễm lao Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây đã chỉ

ra TST có độ đặc hiệu thấp đặc biệt trên các đối tượng có chủng ngừa BCG Hơn nữa do kháng nguyên được sử dụng trong test thử này có phản ứng chéo

với non-tuberculous mycobacteria, nên TST không phân biệt được giữa nhiễm

Mycobacterium tuberculosis và nhiễm non-tuberculous mycobacteria

Trong những năm gần đây, một phương pháp mới dựa trên đáp ứng miễn dịch tế bào của hai kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao ESAT6/CFP10

là Quantiferon TB gold test (Celletist Limitted, Carnegie Victoria Australia)

và T SPOT-TB assay (Oxford Immunotec, Oxford UK) đã được đánh giá là có

độ đặc hiệu cao hơn TST trong chẩn đoán nhiễm lao Cả hai bộ sinh phẩm thương phẩm này đều được xây dựng dựa trên đáp ứng miễn dịch tế bào của vi khuẩn lao thông qua việc xác định interferon gamma được tiết ra bới T cells khi được kích thích với kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao ESAT6/CFP10

Độ nhạy và độ đặc hiệu của hai bộ kít trên cao nhưng không phù hợp với điều kiện kinh tế của cộng đồng dân cư Việt Nam, đặc biệt các đối tượng nhiễm lao thường là nghèo, không có khả năng sử dụng được các sản phẩm thương mại với giá thành khá cao trên thế giới (QuantiFERON - TB kit_Australia; T

SPOT-TB kit _ Oxford, UK) Do vậy chúng không được phổ biến trong chẩn đoán lao

1.3.3 Các phương pháp sinh học phân tử

Ngày nay, dưới sự phát triển của sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật

PCR cho phép phát hiện nhanh, xác định chính xác M tuberculosis complex

trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng, nhờ đó đã khắc phục được những nhược điểm trong các phương pháp chẩn đoán lao truyền thống Kỹ thuật PCR khuyếch đại gen đích IS6110, là một trình tự chèn (IS – Insertion Sequence),

có nhiều bản copy (khoảng 8-16) trong bộ gen của M tuberculosis complex,

IS6110 có trình tự rất bảo thủ do đó nó được chọn làm gen đích trong phản

ứng multiplex PCR nhằm phát hiện M tuberculosis Tuy nhiên, một số nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng các chủng M tuberculosis được phân lập từ Đông

Nam Á và Ấn Độ không chứa trình tự IS6110, nên để loại bỏ khả năng phản ứng PCR cho kết quả âm tính giả người ta đã dùng cả IS1081 thông qua multiplex PCR Ngoài ra gen 23S rDNA có mặt ở tất cả các chủng lao gây bệnh cũng được sử dụng trong việc phát hiện và xác định sự có mặt của vi khuẩn lao

Ngoài ra, trên thế giới đã có một số kit xét nghiệm phát hiện M

tuberculosis đã được thương mại hóa Chẳng hạn như, Amplified M tuberculosis Direct Test (AMTD) được phát triển bởi Gen-Probe, có ưu điểm

là phát hiện rRNA, rRNA theo lý thuyết là tồn tại nhiều hơn hàng nghìn lần so với DNA trong hệ gen của vi sinh vật, do đó độ nhạy cao hơn Thực chất nó là một hệ thống khuếch đại gián tiếp vùng đặc hiệu của RNA ribosome 16S thông qua sự sao chép của vùng gen đó ở một điểm đẳng nhiệt 42oC Tuy nhiên do sản phẩm khuếch đại là RNA nên dễ bị phân huỷ hơn so với DNA Kit PCR chẩn đoán vi khuẩn lao của Roche Amplicor bằng cách khuếch đại gen đích là IS6110 Như vậy mặc dù ứng dụng sinh học phân tử chẩn đoán vi khuẩn lao đã có những thành tựu quan trọng nhưng nếu chỉ dựa vào các kit

thương mại của nước ngoài thì vẫn không thể phát hiện hết các chủng lao ở khu vực Đông Nam Á, Ấn Độ và Việt Nam

* Các gen đích (23S rRNA, IS6110 và IS1081)

- IS6110 là một trình tự chèn (IS - Insertion Sequence) có nhiều bản copy

trong số 95% các chủng M tuberculosis complex IS6110 được rải rác nhiều

nơi trong bộ gen Số lượng bản copy IS6110 có trong hệ gen thay đổi và phụ thuộc vào loài và chủng IS6110 có thể định vị ở các vị trí khác nhau trong nhiễm sắc thể và có chiều dài 1355 bp, và chỉ khác nhau ở một vài nucleotide giữa các bản copy với nhau, nó không có chức năng mã hóa mà chỉ liên quan tới tính biến đổi và di chuyển do đó nó được chọn làm gen đích trong phản

ứng multiplex PCR nhằm phát hiện M tuberculosis [8]

Hiện nay IS 6110 typing là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất cho

các nghiên cứu dịch tễ học phân tử bởi vì có độ phân biệt cao Ở một số vùng

số lượng bản copy IS 6110 thấp (<5 copy) chiếm 25% số chủng, thậm chí có một số chủng không có IS 6110 [9] [60] Sự thay đổi này là nền tảng của tính

đa hình và thường được sử dụng trong fingerprinting M tuberculosis Các

trình tự chèn có các vị trí ưu tiên đã được xác định cho sự hợp nhất vào hệ gen

của Mycobacteria, gọi là các “điểm nóng” Các nghiên cứu gần đây cho thấy quá trình chuyển vị trí của IS 6110 là không ngẫu nhiên và cũng có các điểm

nóng nhất định cho quá trình hợp nhất với hệ gen Một số ít điểm nóng đã được xác định, 3 nghiên cứu đã cho thấy các vùng DR là một trong số các

điểm nóng đó Ba vùng ưu tiên khác cho sự hợp nhất của IS 6110 với hệ gen cũng đã được mô tả là locus ipl, vùng hợp nhất dnaA - dnaN và vùng nằm giữa Rv1754c và Rv1762c Bằng phân tích sự phân bố của các đoạn RFLP - IS

6110, McHugh và cộng sự đã cho thấy rằng có bằng chứng về các yếu tố IS

6110 có thể có nhiều hơn các điểm nóng Warren và cộng sự đã xác nhận điều

này và cũng cho thấy mô hình RFLP có thể thay đổi mặc dù yếu tố IS 6110

vẫn được xác định vị trí là ở trong các điểm nóng, có nghĩa là vùng gần điểm nóng có tần số đột biến cao tạo nên những vị trí giới hạn mới cho enzyme giới

hạn Những chủng chứa ít bản copy IS 6110 hơn thì giống nhau hơn trong các

mô hình fingerprint so với các chủng chứa nhiều bản copy Oligonucleotide có

nguồn gốc từ trình tự này được sử dụng cho phát hiện M tuberculosis trong

các bệnh phẩm lâm sàng bằng kỹ thuật PCR [59] [35]

Hình 1.6 Hệ gen của M tuberculosis với 6 bản copy IS6110

- IS1081 có độ đa hình thấp hơn so với IS6110, theo Collins và Stephens

năm 1991, IS 1081 là một trình tự chèn có độ dài 1324 bp có ở M

tuberculosis complex, và có từ 5 đến 6 bản copy trong hệ gen IS 1081 có các

tận cùng lặp lại ngược chiều và chứa khung đọc mở lớn (ORF) [20] IS 1081

có độ đa hình thấp hơn so với IS 6110 bởi IS 1081 có hoạt tính di chuyển yếu

Số lượng bản copy cũng thấp hơn IS 6110, do đó có những hạn chế trong việc

sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học Nó cũng không được sử dụng thường

xuyên để phân biệt B bovis - BCG với các thành viên khác thuộc M

tuberculosis complex [9] IS 1081 không liên quan mật thiết với các yếu tố

DNA khác nhưng transposase của IS 1081 giống với IS 256 của

Staphylococcuc aureus Tuy nhiên, IS1081 cũng rất hữu ích cho các thao tác

di truyền và phát triển các xét nghiệm chẩn đoán phát hiện M tuberculosis

dựa trên phản ứng PCR và multiplex PCR Một trong những ưu điểm mà IS1081 được chọn là để nhằm khắc phục hiện trượng khuyết gen IS 6110 ở các chủng lao tại Đông Nam châu Á, Việt Nam và Ấn Độ và qua đó khắc phục được hiện tượng phản ứng PCR cho kết quả âm tính giả, nâng cao được hiệu quả chẩn đoán vi khuẩn lao

- Gen 23S rRNA là đoạn gen mã hóa cho tiểu phần 23S của ribosome,

23S rRNA có mặt ở tất cả các chủng lao gây bệnh, do đó sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuyếch đại vùng gen đích 23S rDNA là một thuận lợi cho việc phát hiện

M tuberculosis complex Trong nghiên cứu gần đây chỉ có đoạn trong vùng

5V của 23S được giải trình tự để phân tích so sánh Trên Genbank không có

các thông tin trình tự thích hợp về vùng này của các loài khác trong M

tuberculosis complex Do đó vùng 5V của 23S rDNA có thể dùng làm gen

đích để phát hiện mycobacteria ít nhất ở mức độ loài Vì vậy có thể sử dụng cặp mồi đặc hiệu của vùng 5V này để khuyếch đại vùng gen đích 23S rDNA

là một thuận lợi cho việc phát hiện M tuberculosis complex trong trường hợp không có trình tự IS6110 ở một số chủng M tuberculosis complex Sự khác nhau đáng kể giữa các loài không phải Mycobacteria và Mycobacteria có ý

nghĩa trong lâm sàng cho thấy giá trị tiềm năng của vùng này trong chẩn đoán Tuy nhiên sự đa hình ở vùng này không liên quan đến tính mẫn cảm thuốc và

số lượng ít các vị trí đa hình không đủ cho việc phân biệt các chủng trong loài

[39] 23S rDNA và oxyR cũng có thể sử dụng để phân biệt M tuberculosis và

M bovis và cũng được sử dụng để phân biệt các chủng lao gây bệnh trong các Mycobacteria [39] [30]

* Chứng nội tại trong chẩn đoán

Chứng nội tại là một đoạn DNA được khuếch đại song song với đoạn DNA đích (thực hiện trong phản ứng mPCR) nhưng cho sản phẩm khuếch đại

có đặc điểm như sau:

• Kích thước (trong PCR kinh điển) sản phẩm khuếch đại khác với kích thước của DNA đích nhờ vậy có thể phân biệt được khi điện di

• Trình tự khác hoàn toàn hay khác một phần (trong PCR-ELISA hay trong real-time PCR) nhờ vậy có thể phân biệt được khi sử dụng đầu dò đặc hiệu (specific probe)

Vai trò của chứng nội tại

• Kiểm soát được quá trình tách chiết DNA trên mẫu bệnh phẩm tốt hay không nếu được cho vào bệnh phẩm ở lượng tối thiểu vừa đủ hay có sẵn trong bệnh phẩm

• Kiểm soát được sự ức chế để xác định được kết quả chẩn đoán là âm tính thật hay âm tính giả do có chất ức chế còn hiện diện trong các mẫu DNA đã được tách chiết

• Kiểm soát được hệ thống khuếch đại DNA đích có đạt được độ nhạy hay không nếu chứng nội tại dùng chung mồi với DNA đích và hiện diện trong mẫu thử hay trong PCR mix với lượng tối thiểu vừa đủ

• Kiểm soát được phương pháp tách chiết DNA đang dùng có tốt hay không và thao tác có ngoại nhiễm không nếu có sẵn trong mẫu chứng

âm hay được cho vào mẫu chứng âm để được tham gia tách chiết cùng với mẫu bệnh phẩm

Hiện nay có nhiều phương pháp để thiết kế chứng nội tại, trong đó chứng nội tại có nguồn gốc từ DNA của vật chủ, sản phẩm khuếch đại của chứng nội tại được sử dụng một cặp mồi riêng rẽ khác với cặp mồi nhân đoạn gen đích là một trong những phương pháp thường được sử dụng nhằm kiểm soát quá trình tách chiết DNA và kiểm soát được sự ức chế trong phản ứng PCR chẩn đoán

1.3.3.1 Phương pháp PCR

Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh ra năm 1985 và được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại Đây là kỹ thuật cho phép nhân bản một đoạn AND mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vật bằng một cặp mồi đặc hiệu Dựa vào trình tự đoạn gen được công bố trên ngân hàng quốc tế ta thiết kế được các mồi bổ sung đặc hiệu gồm mồi xuôi và mồi ngược so với chiều phiên mã của gen [2] [3] [4]

Nguyên lý cơ bản của PCR

PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài ADN mồi nhờ enzyme Taq DNA

polymerase để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc hiệu trong hệ thống

luân nhiệt PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200 - 3.000 bp Sản phẩm PCR thu được dựa trên AND khuôn được nhận dạng nhờ cặp primer đặc hiệu thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide, dưới tác dụng của Taq ADN polymerase

Phương pháp PCR là một chuỗi các chu kỳ nối tiếp nhau gồm ba bước chính sau:

+ Bước 1: Biến tính ADN, là giai đoạn hình thành AND sợi đơn để làm khuôn Giai đoạn này cần nhiệt độ ở 94-96oC, thời gian kéo dài từ 30 giây đến

5 phút

+ Bước 2: Giai đoạn gắn mồi để đoạn mồi bắt cặp với khuôn Giai đoạn này cần nhiệt độ từ 40-70oC Tại nhiệt độ này hai đoạn mồi sẽ gắn vào AND khuôn ở vị trí có mã tương đồng theo nguyên tắc bổ sung Thời gian kéo dài từ

30 giây đến 1 phút

+ Bước 3: Giai đoạn kéo dài, ở nhiệt độ 72 oC DNA Taq polymerase hoạt động tổng hợp, kéo dài các mạch theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu của phân tử khuôn ban đầu

Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì 72 oC khoảng từ 5 đến 10 phút sao cho tất cả các sợi đơn xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR, sau đó hạ nhiệt độ xuống còn 4 oC để bảo quản sản phẩm

Mỗi chu kỳ gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần Sau mỗi chu kỳ,

từ một sợi DNA ta có được hai sợi mới Các đoạn DNA vừa nhân bản trong mỗi chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo Do đó sau mỗi chu

kỳ tổng hợp được lượng DNA gấp đôi, như vậy sau n chu kỳ sẽ tạo ra 2n bản DNA khuôn ban đầu

1.3.3.2 Phương pháp multiplex PCR

Kỹ thuật multiplex PCR là một dạng thay đổi của phản ứng PCR thông thường, ở đó trong cùng một lúc hai hay nhiều gen đích được khuếch đại bằng cách sử dụng đồng thời các cặp mồi khác nhau trong cùng một phản ứng Kỹ thuật multiplex PCR được mô tả và phát triển vào năm 1988 bởi Chamberlain