Xác định tạp nhiễm salmonella trong thịt lợn tại thành phố thái nguyên bằng kĩ thuật sinh học phân tử

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - HÀ THỊ UYÊN XÁC ĐỊNH TẠP NHIỄM Salmonella TRONG THỊT LỢN TẠI THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 - 2015 Giảng viên hƣớng dẫn : TS Dƣơng Văn Cƣờng ThS Ma Thị Trang Thái Nguyên – năm 2015 ii LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp với nỗ lực cá nhân, nhận hướng dẫn, giúp đỡ, bảo động viên thầy cô, bạn bè gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn: Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo: TS Dƣơng Văn Cƣờng giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, ThS Ma Thị Trang cán Bộ môn Sinh học Phân tử Công nghệ Gen - Viện Khoa học Sự sống Đại học Thái Nguyên người tận tình bảo, trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống Đại Học Thái Nguyên, ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, cán bộ, anh chị làm việc Bộ môn Sinh học Phân tử Công nghệ Gen- Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè động viên, chia sẻ giúp đỡ vượt qua khó khăn trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, Ngày 02 tháng năm 2015 Sinh viên Hà Thị Uyên iii DANH MỤC CÁC TỪ, CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ, thuật ngữ đầy đủ BPW : Buffered Peptone Water CIAA : 24 Chloroform : Isoamylacohol CDC : Centers for Disease Control and Prevention Cs : Cộng DNA : Deoxynucleotideacid dNTP : Deoxyribonucleic Acid DCA : Deoxycholate citrate agar E.coli : Escherichia coli ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme EU : European Union - Liên minh châu Âu FAO : Food and Agriculture Organization - Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc PCR : Polymerase Chain Rection - Phản ứng chuỗi trùng hợp TE : Tris EDTA TCVN : Tiêu Chuẩn Việt Nam TT : Tetrathionate Mueler Kauffman Broth v/p : Vòng/ phút XLD : Xylose Lysine Desoxycholate Agar WHO : Word Health Organization – Tổ chức Y tế Thế giới ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Bảng phân loại Salmonella vật chủ theo phân loại KauffmannWhite Bảng 2.2: Các tính chất sinh hóa Salmonella Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 3.2: Danh mục thiết bị 29 Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR 33 Bảng 3.4: Thành phần phản ứng PCR đa mồi 34 Bảng 4.1: So sánh hai quy trình phát salmonella thịt lợn 36 Bảng 4.2: Kết Sự diện vi khuẩn Salmonella spp, S enterica thịt lợn địa bàn thành phố Thái Nguyên 43 iii DANH MỤC HÌNH Hình 3.1: Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi 34 Hình 3.2: Chu trình nhiệt phản ứng PCR đa mồi 35 Hình 4.1: Kết thử nghiệm hai quy trình phát Salmonella thịt lợn 37 Hình 4.2: Phát Salmonella spp S enterica PCR đa mồi 39 Hình 4.3a: Kết phát Salmonella thịt lợn chợ Sư phạm 40 Hình 4.3b: Kết phát Salmonella thịt lợn chợ Túc Duyên 41 Hình 4.3c Kết phát Salmonella thịt lợn chợ Trung tâm 42 v MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2.Mục đích nghiên cứu 1.3.Mục tiêu nghiên cứu 1.4.Ý nghĩa khoa học, thực tiễn đề tài 1.4.1.Ý nghĩa khoa học 1.4.2.Ý nghĩa thực tiễn Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm nhiễm Salmonella 2.1.1 Trên giới 2.1.2 Ở Việt nam 2.2 Tổng quan Salmonella 2.2.1 Lịch sử phát 2.2.2 Phân loại 2.2.3 Đặc điểm hình thái 2.2.4 Đặc điểm nuôi cấy đặc điểm sinh hóa 2.2.5 Sức đề kháng vi khuẩn 2.2.6.Cấu trúc kháng nguyên yếu tố độc lực 10 2.2.7 Đặc điểm gây bệnh Salmonella 12 2.3 Các phương pháp phát Salmonella 15 2.3.1 Phát Salmonella phương pháp nuôi cấy truyền thống 15 2.3.2 Phát Salmonella phương pháp đại 18 2.3.3 Tổng quan phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 21 vi PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 26 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 26 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 26 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 26 3.2.2 Thời gian thực nghiên cứu 26 3.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 26 3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 26 3.3.2 Hóa chất 27 3.3.3 Thiết bị 29 3.4 Nội dung nghiên cứu 29 3.5 Phương pháp nghiên cứu 30 3.5.1 Phương pháp thu mẫu 30 3.5.2 So sánh hai quy trình phát Salmonella thịt lợn 30 3.5.3 Phản ứng PCR 33 3.5.4 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR 35 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36 4.1 Kết thử nghiệm hai quy trình phát Salmonella thịt lợn 36 4.2 Sử dụng phối hợp hai cặp mồi invA spvC PCR đa mồi 38 4.3 Kết phát Salmonella nhiễm thịt lợn khu vực Thành Phố Thái Nguyên 40 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm mối quan tâm lớn nhiều quốc gia Thực phẩm không đảm bảo yêu cầu ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ tính mạng người tiêu dùng chất lượng sống nhân dân với phát triển kinh tế xã hội [4] Theo số liệu thống kê cục an toàn vệ sinh thực phẩm năm nước ta có khoảng 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân 100 - 200 ca tử vong Riêng tỉnh Thái nguyên, năm 2014 tỷ lệ mắc 4,7/100.000 dân, tháng 4/2014 có 04 vụ ngộ độc thực phẩm Phần lớn vụ ngộ độc xảy với quy mô nhiều người mắc, nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật, chiếm tỷ lệ 43,2% [18] Đặc biệt vi khuẩn Salmonella thủ phạm gây vụ ngộ độc thực phẩm Theo thống kê Cục vệ sinh an toàn thực phẩm vụ ngộ độc xảy vào ngày 4/10/2013 công ty MTV Wondo Vina (xã Long Bình Điền, huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang) thịt viên bị nhiễm Salmonella làm 400 công nhân mắc phải nhập viện Một vụ ngộ độc tập thể khác xảy ngày 10/7/2013 khiến 232 công nhân công ty Foremart Việt Nam thuộc tỉnh Hưng Yên bị ngộ độc Theo WHO/ FAO ngộ độc thực phẩm xảy nhiều nơi ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người kinh tế Quy trình phân tích Salmonella thực phẩm chủ yếu sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống Phương pháp bao gồm nhiều công đoạn nuôi cấy kết hợp với bước kiểm tra hoá sinh tốn nhiều thời gian đến ngày (ISO 6579: 2003), tốn nhiều công sức, gây khó khăn việc phân tích nhanh mẫu thực phẩm nhiễm mầm bệnh chẩn đoán nguyên nhân gây ngộ độc nghi ngờ Salmonella gây Mặt khác quy trình phân tích không cho phép phân biệt loài hay phân loài Salmonella với Sự phát chậm vi khuẩn gây bệnh mẫu thực phẩm nguyên nhân làm tác nhân gây bệnh có hội lây lan cộng đồng, ảnh hưởng đến sức khoẻ, tính mạng người, gây thiệt hại kinh tế Những tiến khoa học kỹ thuật, kỹ thuật sinh học phân tử cho phép phát triển phương pháp kiểm tra nhạy nhanh diện dòng vi khuẩn mà không cần đến giai đoạn nuôi cấy dài [5] Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase chain reaction (PCR) kỹ thuật đơn giản, có độ nhạy độ đặc hiệu cao, thời gian chẩn đoán ngắn không yêu cầu thiết bị phức tạp Dựa vào viêc sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu cho chủng, kỹ thuật PCR cho phép phát đến mức độ chủng vi khuẩn gây bệnh [11] Do đó, việc ứng dụng kỹ thuật PCR phát nhanh Salmonella đề tài có ý nghĩa thiết thực, góp phần vào việc kiểm soát mức độ an toàn thực phẩm Salmonella gây nên, đảm bảo sức khỏe cộng đồng Xuất phát từ thực tiễn đời sống, để đánh giá tình trạng nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt lợn khu chợ xung quanh Thành Phố Thái Nguyên tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Xác định tạp nhiễm Salmonella thịt lợn Thành phố Thái Nguyên kĩ thuật sinh học phân tử” 1.2.Mục đích nghiên cứu Xác định tạp nhiễm Salmonella thịt lợn Thành phố Thái Nguyên kỹ thuật PCR 1.3.Mục tiêu nghiên cứu Hoàn thiện quy trình phát nhanh Salmonella mẫu thịt kỹ thuật PCR Xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella spp S.enterica thịt lợn khu vực thành phố Thái Nguyên 1.4.Ý nghĩa khoa học, thực tiễn đề tài 1.4.1.Ý nghĩa khoa học Hoàn thiện quy trình phát nhanh Salmonella thịt lợn Giúp sinh viên rèn luyện kỹ thí nghiệm, nghiên cứu, tác phong làm việc 1.4.2.Ý nghĩa thực tiễn Kết nghiên cứu góp phần bổ sung phương pháp chẩn đoán nhanh Salmonella tạp nhiễm thịt lợn 39 cho biết mẫu có chứa chủng S enterica (S typhimurium S enteritidis) Ngược lại sử dụng cặp mồi spvC để kiểm tra diện chung vi khuẩn Salmonella phần lớn kết cho âm tính Salmonella spp thường chiếm đa số môi trường chủng S enterica diện môi trường với mật độ thấp [7] Để khắc phục nhược điểm này, phối hợp hai cặp mồi invA spvC phản ứng PCR Hình 4.2: Phát Salmonella spp S enterica PCR đa mồi Đường chạy L: Thang DNA chuẩn GeneRulerTM 100 bp (Thermo Scientific); Đường chạy -: Đối chứng âm ; Đường chạy 1- 2: Salmonella spp; Đường chạy 3: S typhimurium; Đường chạy 4: S enteritidis; Đường chạy - 6: E coli; Đường chạy 7- 8: Bacillus Sản phẩm phản ứng phân tích điện di gel agarose 1,5% Kết thể hình 4.1 cho thấy phân tích sản phẩm PCR mẫu xuất hai băng 521 bp 400 bp chứng tỏ mẫu có chứa vi khuẩn S enterica, mẫu xuất băng 521 bp 40 chứng tỏ mẫu chứa vi khuẩn Salmonella spp không chứa chủng S enterica Kết nghiên cứu chứng tỏ ưu điểm kỹ thuật PCR đa mồi vừa nhạy bén để phát lúc hai dòng vi khuẩn Salmonella spp S enterica kinh tế, tiết kiệm thời gian 4.3 Kết phát Salmonella nhiễm thịt lợn khu vực Thành Phố Thái Nguyên * Kết đại diện phát Salmonella thịt lợn chợ Sư phạm Hình 4.3a: Kết phát Salmonella thịt lợn chợ Sƣ phạm Đường chạy L: Thang DNA chuẩn GeneRulerTM 100 bp (Thermo Scientific); Đường chạy -: Đối chứng âm; Đường chạy +: Đối chứng dương; Đường chạy 1-5: Mẫu thịt lợn chợ buổi sáng; Đường chạy - 10: Mẫu thịt lợn chợ buổi chiều Từ hình thấy mẫu đường chạy số 3,7 xuất băng sáng 521 bp phù hợp với kích thước sản phẩm PCR theo lý thuyết, mẫu đường số 3, nhiễm Salmonella spp Mẫu đường chạy số xuất băng với kích 41 thước 521 bp 400 bp với kích thước sản phẩm PCR theo lý thuyết, mẫu đường chạy số nhiễm S enterica *Kết đại diện phát Salmonella thịt lợn chợ Túc Duyên Hình 4.3b: Kết phát Salmonella thịt lợn chợ Túc Duyên Đường chạy L: Thang DNA chuẩn GeneRulerTM 100 bp (Thermo Scientific); Đường chạy -: Đối chứng âm; Đường chạy +: Đối chứng dương; Đường chạy 15: Mẫu thịt lợn chợ buổi sáng; Đường chạy - 10: Mẫu thịt lợn chợ buổi chiều Từ hình thấy mẫu thịt lợn đường chạy số 4,10 xuất băng sáng 521 bp phù hợp với kích thước sản phẩm PCR theo lý thuyết chứng tỏ mẫu thịt lợn đường chạy số 4, 10 nhiễm Salmonella spp Mẫu đường chạy số xuất băng với kích thước 521 bp 400 bp với kích thước sản phẩm PCR theo lý thuyết, mẫu đường chạy số nhiễm S enterica 42 * Kết đại diện phát Salmonella thịt lợn chợ Trung tâm Hình 4.3c Kết phát Salmonella thịt lợn chợ Trung tâm Đường chạy L: Thang DNA chuẩn GeneRulerTM 100 bp (Thermo Scientific); Đường chạy - : Đối chứng âm; Đường chạy +: Đối chứng dương; Đường chạy - 5: Mẫu thịt lợn chợ buổi sáng; Đường chạy - 10: Mẫu thịt lợn chợ buổi chiều Từ hình thấy mẫu đường chạy số 3,7,9 xuất băng sáng 521 bp phù hợp với kích thước sản phẩm PCR theo lý thuyết chứng tỏ mẫu thịt lợn đường chạy số 3,7,9 nhiễm Salmonella spp mẫu nhiễm vi khuẩn S enterica Đối với thực phẩm tươi sống, đặc biệt thực phẩm có nguồn gốc động vật, việc kiểm tra tiêu Salmonella yêu cầu bắt buộc Nó tiêu chuẩn cần thiết để đánh giá tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm Ở Việt Nam, theo tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm y tế (TCVN 7064 : 2002 quy định tiêu vi sinh vật thịt) yêu cầu lượng Salmonella 25 g thực phẩm Vì tiến hành kiểm tra 60 mẫu thịt 43 lợn chợ: Sư phạm, Túc Duyên, Trung tâm để kiểm tra diện vi khuẩn Salmonella kỹ thuật PCR đa mồi Bảng 4.2: Kết Sự diện vi khuẩn Salmonella spp, S enterica thịt lợn địa bàn thành phố Thái Nguyên Chợ Số mẫu Salmonella spp Sáng 10 Chiều 10 Túc Sáng 10 Duyên Chiều 10 Sáng 10 Chiều 10 Sư phạm Trung tâm S typhimurium S enteritidis 1 Kết từ bảng 4.2 cho thấy 60 mẫu thịt lợn kiểm tra có 12 mẫu nhiễm Salmonella chiếm tỷ lệ 20% Trong tổng số mẫu thịt kiểm tra vào buổi sáng 30 mẫu chợ phát thấy có mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella chiếm tỷ lệ 10 % (3 mẫu nhiễm Salmonella spp chiếm tỷ lệ nhiễm 10 % mẫu nhiễm S enterica) Trong tổng số mẫu thịt kiểm tra vào buổi chiều 30 mẫu phát mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella chiếm tỷ lệ 30 % (7 mẫu nhiễm Salmonella spp chiếm tỷ lệ nhiễm 23,33 % mẫu nhiễm vi khuẩn S enterica chiếm chiếm tỷ lệ nhiễm 6,67 %) Từ kết phần lớn thịt lợn bị nhiễm Salmonella spp, tỷ lệ thịt lợn nhiễm S enterica có mang gen spvC thấp S enterica diện môi trường với mật độ thấp [7] Theo nghiên cứu Trần Thị Xuân Mai cs (2011) 40 mẫu thịt lợn kiểm tra có 19 mẫu nhiễm Salmonella spp chiếm tỷ lệ 47,5% mẫu nhiễm S enterica chiếm 2,5% [14] 44 Thịt lợn mua buổi chợ chiều có tỷ lệ nhiễm Salmonella cao chợ buổi sáng Theo có chênh lệch tỷ lệ nhiễm do: Tại chợ tiến hành điều tra, người ta thường thịt lợn vào hai thời điểm - sáng 13 - 14 chiều nên thời điểm lấy mẫu cách lúc giết mổ khoảng - tiếng mức độ nhiễm chênh lệch không đáng kể Tuy nhiên, mức độ nhiễm khuẩn chênh lệch chủ yếu số lượng thịt bán vào buổi sáng tồn dư bán vào buổi chiều Vào buổi chiều, thịt để kéo dài mà không che đậy, bảo quản tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhiễm vào, sinh trưởng phát triển Ngoài độ nhiễm khuẩn phụ thuộc vào thời điểm, vào ngày nhiệt độ không khí cao lên vi khuẩn có điều kiện phát triển mạnh Trong ngày mức độ nhiễm khuẩn khác nhau, tùy thuộc vào môi trường, điều kiện khu vực Kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu Trần Thị Hạnh (2006) Mức độ biến đổi tỷ lệ nhiễm Salmonella thịt lợn thành phố Thái Nguyên theo thời gian lấy mẫu minh họa qua hình 4.4 Hình 4.4: Biểu đồ mức độ biến đổi tỷ lệ nhiễm Salmonella thịt lợn thành phố Thái Nguyên theo thời gian lấy mẫu 45 Trong 60 mẫu thịt lợn mua chợ Sư phạm, Túc Duyên, Trung tâm kiểm tra tỷ lệ nhiễm chợ khác nhau, tóm tắt bảng 4.2 Chúng nhận thấy mức độ nhiễm Salmonella thịt lợn chợ Sư phạm 20%, chợ Túc Duyên 25%, chợ Trung tâm 15% Chợ Túc Duyên có tỷ lệ nhiễm cao nhất, chợ Trung tâm tỷ lệ nhiễm thấp Nguyên nhân làm cho thịt lợn bán chợ: Sư phạm, Túc Duyên, Trung tâm bị nhiễm Salmonella việc giết mổ phần lớn tư nhân đảm nhiệm, gia đình tự giết mổ đem chợ bán, địa điểm giết mổ mang tính chất tạm bợ, dụng cụ giết mổ thô sơ, không đảm bảo vệ sinh Nguồn nước sử dụng trình giết mổ bị ô nhiễm Sau giết mổ vận phương tiện thô sơ xe máy, ô tô không che đậy, thịt không bao gói bảo quản Theo Lê Minh Sơn (2003) cho rằng: Thịt bị nhiễm khuẩn chủ yếu đất, nước, dụng cụ giết mổ, trình vận chuyển không đảm bảo vệ sinh Bên cạnh đó, tỷ lệ nhiễm Salmonella thịt ba chợ có chênh lệch: Chợ Túc Duyên tình trạng vệ sinh kém, thịt bày bán xen kẽ với mặt hàng khác, nội tạng thịt bày bán cạnh bàn mà ngăn cách Đó nguyên nhân vi khuẩn Salmonella xâm nhập vào thịt cách như: Vi khuẩn Salmonella từ phân lợn làm ô nhiễm gián tiếp môi trường giết mổ, nước, dụng cụ từ nhiễm vào thịt vi khuẩn có mặt chất chứa (dạ dày, ruột) ô nhiễm trực tiếp vào thịt giết mổ không đảm bảo vệ sinh Chợ Sư phạm tỷ lệ nhiễm cao thứ sau chợ Túc Duyên nguyên nhân do: Thịt bày bán bàn gỗ, đặt vỉa hè nơi có đông người qua lại, nơi có vị trí thấp trời mưa thường để lại vũng nước đọng tạo điều kiện cho ruồi nhặng phát triển,với môi trường ô nhiễm chắn tác động đến nhiễm khuẩn thịt 46 Chợ Trung tâm có tỷ lệ nhiễm thấp do: Các loại hàng hóa quản lý quy hoạch hầu hết mặt hàng bày bán khu vực riêng rẽ, có khu vực riêng để bán thịt, chợ thường xuyên vệ sinh, quầy bán thịt ốp gạch men việc vệ sinh sau buổi bán hàng dễ dàng, hơn, vi khuẩn không bị lưu mặt bàn thịt Kết số nghiên cứu phát Salmonella thịt Việt Nam: Theo báo cáo Thi Thu Hao Van (2007) cho biết tỉ lệ thịt lợn bị nhiễm Salmonella spp chợ siêu thị thành phố Hồ Chí Minh: Tổng 50 mẫu thịt lợn kiểm tra có 32 mẫu nhiễm Salmonella spp chiếm tỷ lệ 64% [41] Phan TT cs (2005) Đồng song cửu long tỉ lệ nhiễm Salmonella thịt lợn 69,9% [32] Theo Nguyễn Ngọc Tuân cs (2006) cho thấy tỉ lệ thịt lợn nhiễm Salmonella spp tỉnh miền Tây Nam từ năm 2004 - 2005 59,7%, biến thiên từ 20% đến 90% Theo Huong cs (2006) số kiểu huyết phân lập từ thịt gà Hà Nội, S typhimurium chiếm tỉ lệ 7,75 % Phần lớn kết nghiên cứu báo cáo vừa nêu dùng phương pháp nuôi cấy truyền thống để phát Salmonella Kết nghiên cứu cho thấy quy trình PCR mang lại kết xác, lại nhanh độ nhạy cao Từ kết cho thấy trạng ô nhiễm thịt lợn cao, tỷ lệ nhiễm chợ khác nhau, thịt mua buổi chợ chiều có tỷ lệ nhiễm Salmonella cao chợ buổi sáng Phần lớn thịt bị nhiễm Salmonella spp, tỷ lệ thịt nhiễm S enterica có mang gen spvC thấp 47 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu thảo luận đưa số kết luận sau: - Đã thử nghiệm so sánh quy trình phát Salmonella mẫu thịt phản ứng PCR Kết hai quy trình phát Salmonella thịt lợn, quy trình phát 12 tối ưu hơn: xác, giúp tiết kiện thời gian, công sức, kinh tế - Sử dụng phối hợp cặp mồi PCR đa mồi: Cặp mồi invA chuyên biệt để phát dòng vi khuẩn Salmonella spp cặp mồi spvC chuyên biệt để phát dòng vi khuẩn S enterica (S enteritidis S typhimurium) Phối hợp hai cặp mồi phản ứng PCR giúp phát lúc hai dòng vi khuẩn Salmonella spp S enterica giúp tiết kiệm thời gian kinh phí - Kết phát Salmonella nhiễm thịt lợn khu vực Thành Phố Thái Nguyên: + Trong 60 mẫu thịt lợn chợ xung quanh thành phố Thái Nguyên kiểm tra có 12 mẫu nhiễm Salmonella chiếm tỷ lệ 20% + Chợ Sư phạm có tỷ lệ nhiễm Salmonella 20%, chợ Túc Duyên 25%, chợ Trung tâm 15% 5.2 Kiến nghị - Tiến hành thử nghiệm với số lượng mẫu lớn thêm chợ khác - Ngoài ra, cần tiến hành nhiều thử nghiệm kiểm tra tiêu Salmonella loại thực phẩm khác thịt đông lạnh, nem, giò, chả, trứng tươi, cá thủy sản tươi sống… TÀI LIỆU THAM KHẢO I.Tài liệu tiếng việt Bùi Minh Đức, Nguyễn Công Khẩn, Trần Đáy, Nguyễn PhùngTiến, Phan Thị Kim, Nguyễn Văn Dịp (2005) "Các bệnh ô nhiễm - Lây nhiễm thực phẩm." Nxb Y học Lê Huy Chính (2007) "Vi sinh vật y học." NXB Y học Nguyễn Ngọc Tuân, L H N., Huỳnh Văn Điểm "Tình hình nhiễm Salmonella phân thịt bò, heo số tỉnh miền Tây Nam " Tạp chí KHKT Nông Lâm Nghiệp’’: 90- 95 Nguyễn Lân Dũng (2005), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học – tập 2, Nxb khoa học kỹ thuật, trang 103-132 Nguyễn Thị Kê, Cao Minh Nga (2007) "Phát số vi khuẩn gây ô nhiễm thực phẩm phương pháp PCR." Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh’’ Phụ số Nguyễn Thu Trang (2005) "Khảo sát thành phần loài phụ thành phần kiểu huyết chủng Salmonella nhiễm thực phẩm." Trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Tiến Dũng (2002) "Phát phân biệt Salmonella spp, Salmonella enterica phương pháp PCR khảo sát tần số xuất tương đối Salmonella enterica I thủy sản, nước tự nhiên." Trường ĐH Khoa học Tự nhiên TPHCM Nguyễn Trí Nhân, Nguyễn Hồng Nhã Trân, Đặng Thị Phương Thảo, Trần Linh Thước (2005) "Tạo dòng biểu gene mã hóa kháng nguyên H,g:m Salmonella enteritidis tế bào Ecoli." Hội nghị khoa học toàn quốc Công nghệ sinh học Nguyễn Vũ Trung (2009) "Độ nhạy độ đặc hiệu PCR đa mồi xác định trực tiếp Salmonnella từ bệnh phẩm phân." Đại học Y Hà Nội 10 Phẩm Minh Thu, Phan Thu Dòng, Trương Xuân Liên (2007) "Phát salmonella spp thực phẩm phương pháp PCR." Viện Pasteur TP Hồ Chi Minh 11 Quyền Đình Thi, N V H (2006) "Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích DNA." Nxb khoa học tự nhiên công nghệ tập 12 Trần Linh Thước (2002) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm, mỹ phẩm NXb Giáo dục 13 Trần Thị Phi La (2011) " Thương hàn vấn đề nan giải." Hội thảo khoa học bệnh thương hàn phía nam 14 Trần Thị Xuân Mai, Võ Thị Thanh Phương, Trần Thị hoàng Yến, Nguyễn Văn Bé (2011) " Phát nhanh salmonella spp, salmonella enterica diện thực phẩm kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR)." Tạp chí Khoa học 20: 198-208 15 Vương Thị Việt Hoa (2002) "Giáo trình tực tập vi sinh thực phẩm." Trường đại học Nông Lâm TP HCM: 74 II.Tài liệu tiếng Anh 16 A thena w Lin, Miguel A Usera, Richard A Goldsby.,(1996) "Application of Random Amplified Polymorphic DNA Analysis To Differentiate Strains of Salmonella enteritidis." Journal of clinical Microbiology 34:870–876 17.Andréa dos Santos Schneid,Kelly Lameiro Rodrigues,DaviChemel, Eduardo Cesar Tondo, Marco Antônio Zacchia,AyubJosé Antonio Gui marães Aleixo., (2006) "Evaluation of an indirect ELISA for the detection of Salmonella in chicken meat." Braz J Microbiol 37 18 Arunava D., Hari S S., Shalini U., Ganeshkumar A., Karthikeyan M., (2012) "Molecular Characterisation of Salmonella enterica Serovar typhi Isolated from Typhoidial Humans." Malaysian Journal of Microbiology 8: 148- 155 19 Baay, M F and J H Huis in 't Veld., (1993) "Alternative antigens reduce cross-reactions in an ELISA for the detection of Salmonella enteritidis in poultry." J Appl Bacteriol 74(3): 243-247 20 Babalola O O., (2003) "Molecular techniques: An overview of methods for the dection of bacteria." African Journal of Biotechnology 12: 710- 713 21 Bernner H W F and Stubbs D A., (1991) "Phage typing of Salmonella enterica in the United State." Journal Clincal Microbiology 29: 20 22 Bianca Ramalho Quintaes, Nilma Cintra Lea, Eliane Moura Falavina Reis, Ernesto Hofer.,(2004) "Optimization of randomly amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction for molecular typing of Salmonella enterica serovar typhi " Revista da sociedade Brasileira de Medicina Tropical 37 23 D L Baggesen, G Sorensen, E M Nielsen, H C Wegener (2010) " Phage Typing of Salmonella typhimurium - is it still a useful tool for surveil lance and outbreak investiga tion." Eurosurveillance 15 24 F.W Brenner, R.G Villar, F.J Angulo, R.Tauxe, (2003) "Salmonella Nomenclature." Microbiology 38: p 2465–2467 Journal B.Swamina., of clinical 25 Galan, J and R Curtiss., (1991) " Distribution of the invA -B -C and D genes of Salmonella typhimurium among other Salmonella serovars: invA mutants of Salmonella typhi are deficient for entry into mammalian cells." Infect Immun 59: 2901-2908 26 Herikstad, H., H.Motarjemi, Y.Tauxe, R V., (2002) "Salmonella surveillance: a global survey of public health serotyping." Epidemiol Infect 129(1): 1-8 27 Luciana Ruschel, Vladimir Pinheiro, Sílvia Dias, Maristela Lovato, Alexandre Pontes, Aldemir Reginato, Carlos Tadeu Pippi, Rui Fernando Félix., (2001) " Polymerase chain reaction ( PCR) for the detection of salmonella in artificially inoculated chicken meat." 43: 247- 250 28 N De Lappe, G Doran, J O'Connor, C O'Hare, M Cormican., (2009) "Characterization of bacteriophages used in the Salmonella enterica serovar enteritidis phage-typing scheme." J Med Microbiol 58: 86-93 29 Nakano S., ( 2007) "Development of a PCR assay for detection of Enterobacteriaceae in foods." Journal Food Protein 66: 1798– 1804 30 Omar B Ahmed, Atif H Asghar, Ibrahim HA Abd El-Rahim, Hegazy AI., (2014) "Detection of Salmonella in Food Samples by Culture and Polymerase Chain Reaction Methods." Bacteriology & Parasitology 31 Paiao, F G., Arisitides, L G Murate, L S Vilas-Boas, G T.VilasBoas, L A Shimokomaki., (2013) "Detection of Salmonella spp, Salmonella enteritidis and typhimurium in naturally infected broiler chickens by a multiplex PCR-based assay." Braz J Microbiol 44(1): 37-41 32 Phan TT, K L., Ogasawara N, Tam NT, Okatani AT, Akiba M and Hayashidani H (2005) "Contamination of Salmonella in retail meats and shrimps in the Mekong Delta, Vietnam." J Food Prot 68: 1077-1080 33 Putturu Ramya, Thirtham Madhavarao, Lakkineni Venkateswara Rao., ( 2012) "Study on the incidence of Salmonella enteritidi in poultry and meat samples by cultural and PCR methods." Vet World 5: 541-545 34 Quintaes B R., (2002) "Conventional and molecular typing of Salmonella typhi strains from Brazil." Review Insitu Medical Tropical SaoPaulo 44: 315-319 35 R Ferretti, et al (2001) "Twelve - Hour PCR - Based Method for Detection of Salmonella spp in Food " American Society for Microbiology 67: 977–978 36 Rabsch W (2007) "Salmonella typhimurium phage typing for pathogens." Methods Mol Biol 37 Ruschel L., Pinheiro V., Dias S., (2007) "Polymerase chain rection for the dection of Salmonella in artificially inoculated chicken meat." Review Insitu Medical Tropical SaoPaulo 43: 247- 250 38 S m Soto, B Guera, M A Gonza lez- hevia, M C Mendoza., (1999) "Potential of Three-Way Randomly Amplified Polymorphic DNA Analysis as a Typing Method for Twelve Salmonella Serotypes." American Society for Microbiology 65: 4830–4836 39 Suzuki S., (1994) "Virulencen region of plasmid pNL 2001 of Salmonella enteritidis." Microbiology 140: 1307- 1318 40 Tan W and L A Shelef (1999) "Automated detection of Salmonella spp in foods." J Microbiol Methods 37(1): 87-91 41 Thi Thu Hao Van, G M., Taghrid Istivan, Linh Thuoc Tran and Peter J Coloe (2007) "Detection of Salmonella spp in Retail Raw Food Samples fromVietnam and Characterization of Their Antibiotic Resistance." American Society for Microbiology 73(21): 6885–6890