Xác định tạp nhiễm salmonella trong thịt lợn tại thành phố thái nguyên bằng kĩ thuật sinh học phân tử

Phương pháp này bao gồm nhiều công đoạn nuôi cấy kết hợp với các bước kiểm tra hoá sinh tốn nhiều thời gian 5 đến 7 ngày ISO 6579: 2003, tốn nhiều công sức, gây khó khăn trong việc phân

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-

HÀ THỊ UYÊN

XÁC ĐỊNH TẠP NHIỄM Salmonella TRONG THỊT LỢN TẠI THÀNH

PHỐ THÁI NGUYÊN BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này với sự nỗ lực của cá nhân, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn:

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo: TS Dương Văn Cường giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, ThS Ma Thị Trang cán bộ tại

Bộ môn Sinh học Phân tử và Công nghệ Gen - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên người đã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống - Đại Học Thái Nguyên, ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, các cán bộ, anh chị làm việc tại Bộ môn Sinh học Phân tử và Công nghệ Gen- Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi học tập

và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, Ngày 02 tháng 6 năm 2015

Sinh viên

Hà Thị Uyên

DANH MỤC CÁC TỪ, CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Từ, thuật ngữ đầy đủ

BPW : Buffered Peptone Water

CIAA : 24 Chloroform : 1 Isoamylacohol

CDC : Centers for Disease Control and Prevention

DNA : Deoxynucleotideacid

dNTP : Deoxyribonucleic Acid

DCA : Deoxycholate citrate agar

E.coli : Escherichia coli

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Xét

nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme

EU : European Union - Liên minh châu Âu

FAO : Food and Agriculture Organization - Tổ chức

Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc PCR : Polymerase Chain Rection - Phản ứng chuỗi trùng

hợp

TCVN : Tiêu Chuẩn Việt Nam

TT : Tetrathionate Mueler Kauffman Broth

XLD : Xylose Lysine Desoxycholate Agar

WHO : Word Health Organization – Tổ chức Y tế Thế giới

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo phân loại Kauffmann-

White 7

Bảng 2.2: Các tính chất sinh hóa cơ bản của Salmonella 9

Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 27

Bảng 3.2: Danh mục các thiết bị 29

Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR 33

Bảng 3.4: Thành phần phản ứng PCR đa mồi 34

Bảng 4.1: So sánh hai quy trình phát hiện salmonella trong thịt lợn 36

Bảng 4.2: Kết quả Sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella spp, S enterica trong thịt lợn ở địa bàn thành phố Thái Nguyên 43

MỤC LỤC

Trang

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2.Mục đích nghiên cứu 2

1.3.Mục tiêu nghiên cứu 2

1.4.Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài 3

1.4.1.Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2.Ý nghĩa thực tiễn 3

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm Salmonella 4

2.1.1 Trên thế giới 4

2.1.2 Ở Việt nam 4

2.2 Tổng quan về Salmonella 5

2.2.1 Lịch sử phát hiện 5

2.2.2 Phân loại 6

2.2.3 Đặc điểm hình thái 7

2.2.4 Đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa 8

2.2.5 Sức đề kháng của vi khuẩn 9

2.2.6.Cấu trúc kháng nguyên và yếu tố độc lực 10

2.2.7 Đặc điểm gây bệnh Salmonella 12

2.3 Các phương pháp phát hiện Salmonella 15

2.3.1 Phát hiện Salmonella bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống 15

2.3.2 Phát hiện Salmonella bằng phương pháp hiện đại 18

2.3.3 Tổng quan phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 21

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 26

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 26

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 26

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 26

3.2.2 Thời gian thực hiện nghiên cứu 26

3.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 26

3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 26

3.3.2 Hóa chất 27

3.3.3 Thiết bị 29

3.4 Nội dung nghiên cứu 29

3.5 Phương pháp nghiên cứu 30

3.5.1 Phương pháp thu mẫu 30

3.5.2 So sánh hai quy trình phát hiện Salmonella trên thịt lợn 30

3.5.3 Phản ứng PCR 33

3.5.4 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR 35

Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36

4.1 Kết quả thử nghiệm hai quy trình phát hiện Salmonella trên thịt lợn 36

4.2 Sử dụng phối hợp hai cặp mồi invA và spvC trong PCR đa mồi 38

4.3 Kết quả phát hiện Salmonella nhiễm trên thịt lợn tại khu vực Thành Phố Thái Nguyên 40

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm đang là mối quan tâm lớn của nhiều quốc gia Thực phẩm không đảm bảo yêu cầu sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ và tính mạng của người tiêu dùng và chất lượng cuộc sống của nhân dân cùng với sự phát triển kinh tế xã hội [4]

Theo số liệu thống kê của cục an toàn vệ sinh thực phẩm mỗi năm nước ta có khoảng 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong Riêng tỉnh Thái nguyên, năm 2014 tỷ lệ mắc 4,7/100.000 dân, tháng 4/2014 có 04 vụ ngộ độc thực phẩm Phần lớn các

vụ ngộ độc xảy ra với quy mô nhiều người mắc, nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc là do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật, chiếm tỷ lệ 43,2% [18] Đặc

biệt vi khuẩn Salmonella là thủ phạm gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm

Theo thống kê của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm vụ ngộ độc xảy ra vào ngày 4/10/2013 tại công ty MTV Wondo Vina (xã Long Bình Điền, huyện

Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang) do thịt viên bị nhiễm Salmonella làm hơn 400

công nhân mắc và phải nhập viện Một vụ ngộ độc tập thể khác xảy ra ngày 10/7/2013 khiến 232 công nhân của công ty Foremart Việt Nam thuộc tỉnh Hưng Yên bị ngộ độc Theo WHO/ FAO ngộ độc thực phẩm xảy ra ở nhiều nơi ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người và kinh tế

Quy trình phân tích Salmonella trong thực phẩm vẫn chủ yếu sử dụng

phương pháp nuôi cấy truyền thống Phương pháp này bao gồm nhiều công đoạn nuôi cấy kết hợp với các bước kiểm tra hoá sinh tốn nhiều thời gian 5 đến 7 ngày (ISO 6579: 2003), tốn nhiều công sức, gây khó khăn trong việc phân tích nhanh các mẫu thực phẩm nhiễm mầm bệnh và chẩn đoán nguyên

nhân gây ngộ độc được nghi ngờ do Salmonella gây ra Mặt khác quy trình

phân tích này không cho phép phân biệt các loài hay phân loài Salmonella

với nhau Sự phát hiện chậm các vi khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm là một trong những nguyên nhân làm tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lan trong cộng đồng, ảnh hưởng đến sức khoẻ, tính mạng con người, gây thiệt hại về kinh tế

Những tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các kỹ thuật sinh học phân tử đã cho phép phát triển phương pháp kiểm tra rất nhạy và nhanh sự hiện diện của các dòng vi khuẩn mà không cần đến giai đoạn nuôi cấy dài [5] Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase chain reaction (PCR) là một kỹ thuật đơn giản, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian chẩn đoán ngắn và không yêu cầu thiết bị phức tạp Dựa vào viêc sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại các đoạn DNA đặc hiệu cho từng chủng, kỹ thuật PCR cho phép phát hiện đến mức độ chủng vi khuẩn gây bệnh [11] Do đó, việc ứng dụng kỹ thuật

PCR trong phát hiện nhanh Salmonella là một đề tài có ý nghĩa thiết thực, góp phần vào việc kiểm soát mức độ an toàn thực phẩm do Salmonella gây

nên, đảm bảo sức khỏe cộng đồng

Xuất phát từ thực tiễn đời sống, để đánh giá tình trạng nhiễm vi

khuẩn Salmonella trong thịt lợn tại các khu chợ xung quanh Thành Phố

Thái Nguyên tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Xác định tạp nhiễm Salmonella trong thịt lợn tại Thành phố Thái Nguyên bằng kĩ thuật sinh học phân tử”

1.2.Mục đích nghiên cứu

Xác định tạp nhiễm Salmonella trong thịt lợn tại Thành phố Thái

Nguyên bằng kỹ thuật PCR

1.3.Mục tiêu nghiên cứu

Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh Salmonella trong mẫu thịt bằng kỹ

thuật PCR

Xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella spp và S.enterica trong thịt lợn ở khu

vực thành phố Thái Nguyên

1.4.Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài

1.4.1.Ý nghĩa khoa học

Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh Salmonella trong thịt lợn

Giúp sinh viên rèn luyện các kỹ năng thí nghiệm, nghiên cứu, tác phong làm việc

1.4.2.Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung các phương pháp chẩn đoán nhanh

Salmonella tạp nhiễm trong thịt lợn

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm Salmonella

2.1.1 Trên thế giới

Ngộ độc thực phẩm là mối quan tâm đặc biệt ở mỗi quốc gia và là mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng Mỗi năm thế giới đã ghi nhận hàng triệu ca bệnh trên người và bệnh đã gây ra hàng nghìn ca tử vong

Ngộ độc do nhiễm vi khuẩn Salmonella lần đầu tiên được phát hiện cách đây hơn 100 năm, Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh cho

người và súc vật truyền từ thực phẩm, chủ yếu do thịt (lợn, bò, gia cầm…)

và các sản phẩm của thịt, trứng và các sản phẩm của trứng [21]

Ở Mỹ theo thống kê của trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh CDC (Centers for Disease Control and Prevention) năm 2007 cả nước

Mỹ có 17,883 ca ngộ độc thực phẩm, trong số đó có 38% bệnh nhân nhiễm

Salmonella nhưng thực tế chỉ có khoảng 1 - 5% là được thống kê và có khoảng 400 trường hợp tử vong do Salmonella, làm thiệt hại hơn 50 triệu

USD nên vi khuẩn này được liệt vào loại gây ngộ độc nguy hiểm nhất tại

Mỹ Trong số ca nhiễm khuẩn Salmonella, phần lớn bệnh nhân bị nhiễm S enteritidis (24,7%) và S typhimurium (23,5%) Cơ quan An toàn Thực phẩm

Châu Âu và Trung tâm phòng chống kiểm soát bệnh dịch Châu Âu đã thống

kê năm 2009 khu vực EU có tổng 108.614 người bị nhiễm Salmonella

2.1.2 Ở Việt nam

Tại Việt Nam trong những năm gần đây tình hình ngộ độc thực phẩm cũng gia tăng trở thành vấn đề nghiêm trọng về sức khỏe cộng đồng và là mối quan tâm hàng đầu hiện nay của các nhà dịch tễ, vi sinh và lâm sàng trong cả nước Theo thống kê ở Việt Nam mỗi năm có hàng trăm vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó số vụ do nhiễm vi sinh vật chiếm 33 - 49% và chủ yếu

là Salmonella chiếm 70% các vụ ngộ độc [1] Theo báo cáo của Bộ Nông

nghiệp và phát triển nông thôn năm 2009 tại Hà Nội trong số 72 mẫu thịt lợn

được kiểm tra có 3 mẫu nhiễm Salmonella (chiếm 4,1%) và tại TP Hồ Chí Minh, trong số 69 mẫu thịt lợn được kiểm tra có 4 mẫu nhiễm Salmonella

(chiếm 5,8%)

Tại Thành phố Hồ Chí Minh, Cục Quản lý chất lượng nông lâm sản

và thủy sản (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) thực hiện kiểm tra

213 mẫu thịt lợn, 213 mẫu thịt gà và 213 mẫu cá biển vào tháng 5/2013 – 4/2014 tại chợ đầu mối Bình Điền, Hóc Môn,Thủ Đức trong đó thịt lợn có

71/213 mẫu kiểm nghiệm phát hiện nhiễm Salmonella (chiếm 30,74%) , thịt gà phát hiện Salmonella trong 105/231 mẫu kiểm nghiệm (chiếm 45,45%) và cá biển 13/ 213 mẫu kiểm nghiệm có nhiễm Salmonella (chiếm

6,103%) [18]

Thống kê của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm vụ ngộ độc xảy ra vào ngày 4/10/2013 tại công ty MTV Wondo Vina (xã Long Bình Điền, huyện

Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang) do thịt viên bị nhiễm Salmonella làm hơn 400

công nhân mắc và phải nhập viện Một vụ ngộ độc tập thể khác xảy ra ngày 10/7/2013 khiến 232 công nhân của công ty Foremart Việt Nam

thuộc tỉnh Hưng Yên bị ngộ độc Nhìn chung tỷ lệ nhiễm Salmonella cao,

các vụ ngộ độc với quy mô nhiều người mắc thường xảy ra ở các bếp ăn tập thể, các xí nghiệp [18]

do một loại virus gây nên và đã xác định S choleraesui là vi khuẩn gây bệnh

thương hàn [13]

Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách

người bệnh, ông gọi vi khuẩn này là S enteritidis Vi khuẩn này được gọi nhiều tên khác như: Bacterium enteritidis, Bacillus gartner [2]

Năm 1889 Klein phân lập được S gallinarum và Rettger cũng đã phân lập được S pullorum năm 1990 Trước đây người ta cho rằng đây là hai

loại vi khuẩn gây ra hai bệnh khác nhau nên đã gọi chung là bệnh phó

thương hàn gà (typhus avium) và căn bệnh có tên chung là S gallinarum – pullorum [1]

Năm 1896 C Archard và Rbensauded đã phân lập được vi khuẩn S

paratyphi equi và S paratyphi bacillus Ngày nay vi khuẩn này được gọi tên

là S paratyphi B và đến năm 1898, S paratyphi A đã tìm được do N Guyn

và H Keyser [13]

2.2.2 Phân loại

Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae Họ vi

khuẩn này có đặc điểm chung là gram âm, hình que và có thể di động được

[6] Có nhiều phương pháp khác nhau để phân loại Salmonella trong đó

Kauffmann - White là phương pháp định danh được công nhận và sử dụng rộng rãi từ năm 2003 [24] Phương pháp này dựa vào sự ngưng kết của huyết

thanh với 2 kháng nguyên bề mặt của Salmonella là kháng nguyên O và

kháng nguyên H và kháng nguyên bề mặt Vi

Theo phương pháp định danh Kauffmann – White Salmonella được chia thành hai loài: Salmonella enterica và Salmonella bongori (trước đây được xếp vào Salmonella enterica phân loài V) Salmonella enterica được

chia thành 6 phân loài qui định bằng tên hoặc số La Mã

Bảng 2.1: Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo phân loại

Kauffmann- White

Động vật máu lạnh và môi trường

Động vật máu lạnh và môi trường

Động vật máu lạnh và môi trường

Samonella enterica phân loài I chiếm 59% (1454/2463) trong tổng

số kiểu huyết thanh của Salmonella Phân loài này gây ra khoảng 99%

sự nhiễm trùng do Salmonella ở người và động vật máu nóng, trong đó

S typhimurium và S enteritidis là có hai kiểu huyết thanh quan trọng gây bệnh cho người [19, 40] Thống kê từ 1990 đến 1995, S enteritidis,

S typhimurium chiếm khoảng 70% tổng số Salmonella được phân lập

trên toàn thế giới [26]

2.2.3 Đặc điểm hình thái

Salmonella là trực khuẩn Gram âm, có kích thước 0,7 - 1,5 x 2-5µm,

sống kị khí tùy nghi, không có nha bào, có khả năng di động nhờ lông mao,

có khoảng 7 đến 12 lông mao xung quanh thân (trừ S gallinarum và S

pullorum gây bệnh cho gia cầm) Salmonella dễ dàng nuôi cấy ở 370 C trên môi trường nuôi cấy bình thường, chúng phát triển thành các khuẩn lạc có đường kính 2 - 4 mm, trơn, sáng và đồng nhất [2]

2.2.4 Đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa

Salmonella phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường

Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ Có thể mọc trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate) trong đó môi trường XLD

ít chất ức chế hơn nên thường được dùng để phân lập Salmonella Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD là tròn, lồi, trong suốt, có

tâm đen, đôi khi tâm đen lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh

chuyển sang màu đỏ Salmonella không lên men lactose, lên men đường

glucose và sinh hơi Thường không lên men sucrose, salicin và inositol, sử dụng được citrate ở môi trường simmons [6] Các tính chất hóa sinh cơ bản

của Salmonella được thể hiện ở bảng 2.2

Bảng 2.2: Các tính chất sinh hóa cơ bản của Salmonella

Lên men Glucid (+) Kèm theo sự tổng hợp acid

Lên men Glucose sinh khí (+) Trừ một số chủng thuộc loài

S.typhi A và S gallinarum

Sử dụng Citrate (+) Trừ S typhi và S paratyphi A

+ Decarboxylase Lysine (LDC) (+) Trừ S.paratyphi A

+ Arginine dihydrolase (ADH) (-)

Với pH lớn hơn 9 hoặc nhỏ hơn 4,5 vi khuẩn có thể bị tiêu diệt, khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn kém: Ở 500C trong 1 giờ, ở 700C trong 15 phút và

1000C trong 5 phút Ở nồng độ muối 6 - 8% vi khuẩn phát triển chậm và ở nồng độ muối 8 - 19% thì sự phát triển của vi khuẩn bị ngừng lại [6]

Trong xác động vật chết, đất bùn, cát khô, trong nước đóng băng

Salmonella tồn tại khoảng 2 - 3 tháng, trong nước tự nhiên Salmonella có thể sống 1 - 2 tháng Salmonella bị tiêu diệt bởi thủy ngân 1%, fromol

0,5%, acid fenic 3 % trong 15 - 20 phút [1]

2.2.6.Cấu trúc kháng nguyên và yếu tố độc lực

*Cấu trúc kháng nguyên [3] : Salmonella có ba loại kháng nguyên,

đó là những chất khi xuất hiện trong cơ thể thì tạo ra kích thích miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với những sản phẩm của kích thích đó, gồm: Kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và kháng nguyên vỏ K Vi khuẩn thương hàn

(S typhi) có kháng nguyên V (Virulence) là yếu tố chống thực bào giúp cho

vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu

Kháng nguyên vách tế bào ( kháng nguyên thân O):

+ Thành phần cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp Trong cùng là lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide

+ Bao bên trong lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B (quyết định độc tố của nội độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide (LPS) Tính đặc hiệu của kháng nguyên O và LPS là một, nhưng tính miễn dịch thì khác nhau: kháng nguyên O ngoài LPS bao gồm cả lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch nó mạnh hơn LPS Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolusaccharide dày khoảng 8 - 10 nm gồm 3 thành phần: Lipid A, polysaccharide lõi, kháng

nguyên O Màng ngoài có thêm các protein: Protein cơ chất: Porin ở vi khuẩn còn gọi protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ Protein màng ngoài: Chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua màng ngoài Lipoprotein: Đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài [3]

Kháng nguyên lông (kháng nguyên H):

+ Kháng nguyên H (KN - H): Chỉ có ở Salmonella có lông Hầu hết Salmonella đều có lông chỉ trừ S galilarum, S pulorum gây bệnh cho gia

cầm KN- H là một loại kháng nguyên có bản chất là protein, kém bề hơn kháng nguyên O KN - H rất dễ bị phá hủy ở nhiệt độ cao hoặc xử lý bằng cồn, acid yếu

+ Kháng nguyên H chia làm 2 phase:

Phase 1: Có tính chất đặc hiệu gồm 28 loại kháng nguyên lông được biểu thị bằng chữ số latinh thường a, b, c…

Phase 2: Không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với

các loại khác đôi khi thành phần này có thể gặp ở E coli Pha 2 gồm có 6

loại được biểu thị bằng chữ số Ả Rập 1 - 6 hay chữ số La Tinh e, n, x [3]

Kháng nguyên Vi:

Có ở 2 type huyết thanh S typhi và S paratyphi Kháng nguyên Vi-

angtigen được Felix và các cộng sự phát hiện năm 1935 Kháng nguyên Vi gây hiện tượng ngưng kết chậm và xuất hiện các hạt vỏ, kháng nguyên Vi là kháng nguyên vỏ bao bọc bên ngoài kháng nguyên O, kháng nguyên Vi không tham gia vào quá trình gây bệnh [2]

* Yếu tố độc lực

Salmonella sản sinh hai loại độc tố : Ngoại độc tố và ngoại độc tố [2]

Nội độc Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn

loét, độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật

Ngoại độc tố: Chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng của chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lại cấy truyền như vậy từ 5 - 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có khả năng gây bệnh cho động vật thí nghiệm Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện nuôi cấy kỵ khí Ngoại độc tố tác dụng vào thần kinh và ruột [3]

2.2.7 Đặc điểm gây bệnh Salmonella

2.2.7.1 Điều kiện gây bệnh

Salmonella gây ngộ độc cho người phải có các điều kiện:

Thức ăn phải nhiễm một lượng lớn vi khuẩn sống, khoảng 106 – 107

Chủng Salmonella: Không phải mọi chủng Salmonella nhiễm vào đều

có biểu hiện bệnh mà chỉ một số chủng như: S typhi, S paratyphi, S enteritidis… Mới gây bệnh cho người, biểu hiện của bệnh cũng khác nhau

tùy từng kiểu huyết thanh

2.2.7.2 Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn vào ruột rồi phát triển tại đó, sau đó theo hệ thống bạch huyết và tuần hoàn gây nên tình trạng nhiễm trùng huyết Do đó trong thời

kỳ đầu lấy máu người bệnh truyền cấy sẽ phát hiện vi khuẩn Vi khuẩn gây viêm ruột, phá hỏng tế bào niêm mạc ruột, tiết ra độc tố Độc tố này thấm qua thành ruột vào máu [4]

Ngoài ra vi khuẩn trong hệ tuần hoàn cũng tiết ra độc tố Nội độc tố chủ yếu tác động lên hệ thần kinh vận động của huyết quản, làm giảm độ bền của thành mao quản và làm giảm chứng năng điều tiết thân nhiệt của cơ thể [15]

2.2.7.3 Các kiểu bệnh chính do vi khuẩn Salmonella

Các kiểu huyết thanh Salmonella gây ra bệnh với những triệu chứng

lâm sàng không giống nhau:

* Bệnh thương hàn: S typhi gây ra bệnh sốt thương hàn, S paratyphi

A, S paratyphi B gây bệnh phó thương hàn triệu chứng bệnh giống bệnh sốt

thương hàn

Triệu chứng: Sốt cao, đau đầu, mệt mỏi, chán ăn, nhịp tim chậm,

khoảng 26% có nốt hồng ban trên cơ thể Người bệnh đau bụng, nôn, táo bón hoặc tiêu chảy phân đen hoặc có máu Nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời sẽ gây ra những biến chứng nguy hiểm như chảy máu ruột, thủng ruột hoặc bị rối loạn chức năng não và dễ gây tử vong

Điều trị: Thương hàn không gây tử vong ở hầu hết các ca bệnh

Kháng sinh như Ampicilin, Chloramphenicol, Amoxicillin và Ciprofloxacin Trimethoprum - sulfamethoxazole, được sử dụng phổ biến điều trị bệnh thương hàn ở các nước phát triển Điều trị kịp thời và kháng sinh giảm tỉ lệ từ vong xuống xấp xỉ 1% Nếu không được đều trị, thương hàn tồn tại trong ba tuần đến một tháng [13]

* Bệnh nhiễm trùng máu: Do S choleraesuis gây ra

Triệu chứng: Buồn ngủ hoặc sốt li bì, sốt cao trên 380C hoặc hạ nhiệt

độ dưới 350

C Vàng da, tím tái hoặc xám, da xanh (do thiếu máu), suy hô

hấp làm cho trẻ thở nhanh hoặc chậm, rối loạn tiêu hóa (tiêu chảy, nôn, bụng trướng căng) gan, lá lách to Trong trường hợp nặng, bệnh nhân có thể suy thận cấp

Điều trị: Bao gồm các công tác chẩn đoán sớm, loại bỏ nguồn gốc

nhiễm trùng từ ổ nguyên phát, hỗ trợ tuần hoàn và hô hấp, điều trị thăng bằng kiềm toan, chống rối loạn đông máu và kháng sinh Trước khi sủ dụng kháng sinh nên cấy máu vào bệnh phẩm khác để làm kháng sinh đồ chọn ra kháng sinh phù hợp [6]

*Bệnh về tiêu hóa: Do S typhimurium và S enteritidis gây bệnh viêm

ruột, viêm dạ dày

Triệu chứng: Hiện tượng ăn không tiêu, đầy hơi chướng bụng, buồn

nôn, đi lỏng hoặc táo bón, đau bụng âm ỉ hoặc từng cơn…

Điều trị: Trước hết vẫn phải tránh uống rượu, cà phê, thuốc lá (nếu

có dùng) vì những thứ này thường làm giảm trương lực co thắt dưới thực quản Hạn chế ăn các loại thức ăn nhiều mỡ, không ăn cay, chua, ăn chậm, nhai kỹ [1]

2.2.7.4 Nguồn lây nhiễm

Các thực phẩm dễ nhiễm Salmonella gồm sản phẩm thịt gia cầm và

thịt lợn, trứng và các sản phẩm từ trứng, sữa và các sản phẩm từ sữa, nước bị nhiễm phân, hoa quả và rau xanh, sản phẩm ngũ cốc, các thực phẩm ăn nhanh [4]

Các sản phẩm thịt nói chung, nhất là thịt gia cầm và thịt lợn do vi khuẩn này sống tự do trong ruột động vật và có ở trên lông

Trứng và các sản phẩm từ trứng: Do gia cầm là nguồn mang

Salmonella nên vi khuẩn có thể xuyên qua vỏ và sinh sản trong lòng đỏ

trứng [3]

Nước bị nhiễm phân gia súc, hoa quả và rau xanh có thể bị nhiễm khi rửa bằng nước đã bị nhiễm khuẩn hoặc bởi người mang vi khuẩn

2.3 Các phương pháp phát hiện Salmonella

2.3.1 Phát hiện Salmonella bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống

Đây là phương pháp định tính và kết quả là có hay không phát hiện

Salmonella trên lượng mẫu được kiểm nghiệm Do quy định không cho phép

có mặt trong thực phẩm nhưng lại khó phát hiện nên mẫu lấy tối thiểu phải

25 g và quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải có thêm giai đoạn tiền tăng sinh để đạt hiệu quả cao Điều này cần thiết vì Salmonella thường có mặt trong

mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương nặng trong quá trình bảo quản chế biến và

sự tồn tại một số lượng lớn các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae, những vi khuẩn này sẽ cạnh tranh hay ức chế sự phát triển của Salmonella Để phát hiện Salmonella cần tiến hành bốn giai đoạn: Tiền tăng sinh, tăng sinh

chọn lọc, phân lập và khẳng định Việc khẳng định dựa trên các kết quả thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh phù hợp [7]

Giai đoạn tiền tăng sinh (pre – enrichment): Đây là khâu quan

trọng không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm đối với mẫu kiểm nghiệm không phải là mẫu bệnh phẩm Người ta thường sử dụng môi trường tiền tăng sinh không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế đặc hiệu tạo điều kiện cho sự phục hồi sức sống và tăng trưởng của nhiều vi sinh vật hiện diện trong mẫu đã bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm Ví dụ: Nước peptone đệm Buffered Peptone Water (BPW) là môi trường tiền tăng sinh được khuyến khích sử dụng trong môi

trường kiểm tra nhiều loại vi sinh vật gây bệnh thuộc họ Enterobacteriaceae

[12] Tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tiền tăng sinh phù hợp, thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường tiền tăng sinh

là 1:9 tuy nhiên tùy trường hợp cụ thể tỉ lệ này có thể thay đổi [34]

Giai đoạn tăng sinh chọn lọc (selective enrichment): Giai đoạn này

làm tăng mật độ Salmonella so với các vi sinh vật khác bằng cách ức chế

hoặc ngăn chặn sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật khác, tạo thuận lợi cho việc phát hiện vi khuẩn này trong bước phân lập

Các môi trường tăng sinh chọn lọc cho Salmonella thường được dùng

là Rappaport Vassiliadis (RV), Tetrathionate Mueler Kauffman Broth (TT), Selenite Cystein Broth (SC) [37]… Thông thường môi trường TT được dùng

để phân tích các loại mẫu có thành phần chính là những loại thịt tươi sống, các mẫu có mật độ nhiễm vi sinh vật cao, các loại thức ăn gia súc hay các loại thực phẩm khác Cần lưu ý là không môi trường tăng sinh chọn lọc nào là môi

trường tối ưu chung cho tất cả các dòng Salmonella Mỗi loại môi trường tăng

sinh chọn lọc được thiết lập dựa trên một số đặc điểm phát triển khác nhau

của Salmonella, một số dòng Salmonella tăng trưởng được trong môi

trường này nhưng lại không tăng trưởng được trong môi trường khác Ví

dụ: Salmonella typhi không phát triển được trong môi trường RV và TT, Salmonella dublin không phát triển được trong môi trường RV Ngoài ra,

mỗi môi trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt nuôi cấy khác nhau như môi trường RV được ủ ở 42oC, môi trường TT và SC được ủ ở 37o

C trong 22 - 24 giờ [18]

Giai đoạn phân lập và nhận diện: Đây là bước tách biệt Salmonella

trong canh khuẩn ra khỏi quần thể của chúng Một số môi trường phân lập như Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD), Bismuth Suffite Agar (BSA), Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose Agar (BGLS), Hektoen Entric Agar (HEP) Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình

thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau [12]

Trên các môi trường phân lập khác nhau Salmonella sẽ cho các kiểu

khuẩn lạc đặc trưng khác nhau Trên môi trường XLD: Khuẩn lạc màu hồng

tròn, trong suốt, có hay không có tâm đen Trên môi trường BSA: Khuẩn lạc

Salmonella có màu nâu xám hay đen, có hay không có ánh kim tím trên bề

mặt khuẩn lạc, môi trường xung quanh có màu nâu chuyển sang đen khi tăng thời gian ủ ấm, gây khó khăn cho việc nhận biết khuẩn lạc vi khuẩn

Salmonella Trên môi trường BPLS: Khuẩn lạc Salmonella điển hình trong

suốt và hơi đỏ trong môi trường, có màu đỏ hồng xung quanh khuẩn lạc

Trên môi trường HE: Khuẩn lạc Salmonella có màu xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen Một số loài Salmonella có thể phát triển

thành khuẩn lạc có các chấm màu đen bóng, lớn hay phần lớn các khuẩn lạc

hoàn toàn có màu đen Có một số ít loài Salmonella sinh ra khuẩn lạc màu

vàng có hoặc không có tâm đen [12]

Khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa: Đây là bước xác nhận các

dòng vi khuẩn nghi ngờ Salmonella trên môi trường phân lập bằng các thử

nghiệm sinh hóa và huyết thanh đặc trưng Các biểu hiện sinh hóa của

Salmonella như sau: glucose (+), lactose (-), indol (+), lysine decarboxylase

(+), ornithine decarboxylase (+), urea (-), mannitol (+), sorbitol (+) Nếu các biểu hiện sinh hóa phù hợp, chủng phân lập được khẳng định lại bằng các thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá và H đa giá Vi khuẩn sau khi phục hồi được cấy chuyển sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa

nhằm xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella [6]

- Phương pháp nuôi cấy truyền thống vẫn đang được áp dụng tại Việt

Nam cũng như các nước khác trên thế giới để phát hiện Salmonella trong

thực phẩm, đây được coi là phương pháp tiêu chuẩn được chấp nhận rộng rãi Tuy nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và công sức lao động cho các công việc như: chuẩn bị môi trường, dụng cụ, thực hiện quy trình, thời gian để có kết quả phân tích phải mất từ 5 đến 7 ngày (ISO 6579: 2003) Với thời gian này đã không đáp ứng được các yêu cầu kiểm nghiệm nhanh

trong việc phục vụ các chương trình giám sát chất lượng thực phẩm trên dây chuyền sản xuất như hiện nay gây thiệt hại cho các nhà quản lí doanh nghiệp

vì các chi phí lưu kho để chờ kết quả phân tích

2.3.2 Phát hiện Salmonella bằng phương pháp hiện đại

* Phương pháp Phage Typing

Phage typing là phương pháp nhằm phân biệt Salmonella trong các

nghiên cứu về dịch tễ học cho hiệu quả khá tốt [23]

Nguyên tắc của phương pháp này là mỗi loại phage chỉ ly giải một chủng vi khuẩn mà không thể ly giải chủng vi khuẩn khác trong cùng một loài Do đó các chủng của một loài vi khuẩn có thể được phân biệt dựa trên tính nhạy khác nhau của chúng với một hỗn hợp nhiều loại phage khác nhau [36]

Ưu điểm của phương pháp này là so với phương pháp kiểu gen, phương pháp huyết thanh là có giá thành rẻ hơn, không tốn công lao động Nhược điểm là nặng về kỹ thuật và chỉ được thực hiện ở một số phòng thí nghiệm chuẩn Hiệu quả phân biệt của phương pháp còn hạn chế do độ đa dạng của hỗn hợp phage không cao, đặc biệt khi chủng phân lập trong một vùng địa phương [23]

Trong nhiều năm qua phương pháp Phage typing đã được sử dụng như

một công cụ hữu hiệu cho việc nghiên cứu sự bùng phát của Salmonella

Điển hình như: Ward L R et al (1987) đã mô tả phương pháp Phage typing

nhằm phát hiện ra vi khuẩn Salmonella enterica, Rabsch W (2007) [36], N

De Lappe và cs (2009) [28]

* Phương pháp ELISA

Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng

nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Nguyên tắc đó là sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng, nếu có

sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ giữ lại trên bề mặt giếng Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng các loại kháng thể thứ cấp có gắn enzyme alkaline phosphate Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng

Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện [29] Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu thực hiện qua hai bước:

- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm

Phương pháp này có ưu điểm là có thể sử dụng cho hầu hết các loại kháng nguyên với độ nhạy và độ đặc hiệu cao Kĩ thuật khá đơn giản và có hiệu quả, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml [29]

Kỹ thuật ELISA đã được nghiên cứu ứng dụng nhằm phát hiện Salmonella

ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới phần lớn sử dụng các kháng thể kháng nguyên roi hay còn gọi là kháng nguyên H như Brigmon R L và cs (1995), Andréa dos Santos Schneid và cs (2006) [17] Còn ở Việt Nam hiện nay cũng

có các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật ELISA để phát hiện nhanh Salmonella

như công trình của Nguyễn Trí Nhân và cs (2005) tạo dòng và biểu hiện gen mã

hóa kháng nguyên H:g,m của Salmonella enterica trong tế bào E coli [8]

* Phương pháp RAPD (Random amplified polymorphic DNA)

Là phương pháp phân tích đa dạng DNA khuyếch đại ngẫu nhiên, kỹ thuật này được phát hiện vào năm 1990 bởi Welsh và MClelland, được sử dụng lần đầu tiên bởi Williams và cs (1990) để kiểm tra mẫu ADN của con người chưa rõ danh tính [20] Random amplified polymorphic DNA (tính đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên) là phương pháp phân biệt dựa trên sự khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA trên nhiễm sắc thể, dùng nghiên cứu

sự khác biệt di truyền của những loài khác nhau Mồi được sử dụng trong kỹ thuật RAPD là những sợi oligonucleotide có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên, các sản phẩm RAPD được phân tích bằng cách điện di trên gel agarose Hệ gen của hai loài khác nhau sẽ cho những đoạn băng trên gel khác nhau, từ đó có thể so sánh sự đa dạng sinh học của các giống cây

Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình

tự của các primer Các đoạn mồi oligonucleotide nếu bắt cặp ngẫu nhiên với

cả hai mạch đối diện của mạch khuôn DNA trong khoảng cách có thể khuếch đại được (dưới 3000bp) sẽ cho ra những đoạn DNA có kích thước khác nhau sau khi khuếch đại Sự có mặt của các sản phẩm DNA khác nhau chứng tỏ đã có một sự tương đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA bộ gen và mồi Các mồi dùng trong RAPD thường ngắn vì vậy dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch đơn DNA bộ gen Do đó tính đa dạng thu được nhờ RAPD là đáng tin cậy, vì khi có sự thay đổi một base nitơ nào

đó thì nó sẽ ngăn cản việc tiếp hợp giữa mồi và DNA mạch khuôn Sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng như sự xen vào của một gen nào đó sẽ làm thay đổi kích thước đoạn DNA được khuếch đại [38]

Dùng nhiều primer khác nhau sẽ khuếch đại nhiều đoạn gen với kích thước khác nhau, kết quả này được thể hiện trên gel với nhiều băng ở những

vị trí khác nhau, các băng đa hình được ghi nhận và từ đó có thể vẽ được bản

đồ trên một quần thể đang phân ly [20]

Sinh vật cùng loài sẽ có kiểu gen hoàn toàn giống nhau, khuyếch đại các đoạn DNA có kích thước giống nhau khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào để chạy PCR Sinh vật khác nhau ít nhiều sẽ khác nhau về kiểu gen thì một số mồi ngẫu nhiên nào đó các đoạn DNA được khuyếch đại sẽ có kích thước khác nhau [16]

Phương pháp này có ưu điểm là phát hiện nhanh tính đa dạng di truyền, thao tác đơn giản không đòi hỏi kỹ thuật cao, tương đối rẻ tiền hơn so với các phương pháp RFLP, SSR, không dùng đồng vị phóng xạ nên tránh được độc hại cho người thao tác

Các công trình nghiên cứu trên thế giới ứng dụng kỹ thuật RAPD phát

hiện Salmonella đã được công bố như Athenaw Lin và cs (1996) [16], S

PCR đa mồi ( Multiplex PCR) là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà

trong đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách

sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng [9]

2.3.3.2 Nguyên lý của PCR

Phản ứng PCR cần có hai đoạn oligonucleotide, thường có chiều dài nằm trong khoảng 17 - 30 nucleotide, nằm ở hai đầu của trình tự DNA đích cần khuyếch đại số lượng Đoạn thứ nhất có trình tự giống với trình tự ở đầu

3’ của mạch đơn đối nghĩa được gọi là mồi xuôi Đoạn thứ hai có trình tự giống với trình tự ở đầu 3’ của mạch đơn có nghĩa và được gọi là mồi ngược Mồi xuôi sẽ bám vào đầu 5’ của mạch đơn có nghĩa theo nguyên lý liên kết

bổ sung và kích hoạt phản ứng tổng hợp mạch đơn đối nghĩa Tương tự mồi ngược sẽ bám vào đầu 5’ của mạch đơn đối nghĩa và kích hoạt phản ứng tổng hợp sợi có nghĩa mới Phản ứng PCR được chia làm 3 giai đoạn với 3 nhiệt độ khác nhau Chu kỳ biến tính – gắn mồi – kéo dài được lặp lại 20 -

35 lần nhằm mục đích đạt được lượng sản phẩm mong muốn [11] Ba giai đoạn của phản ứng PCR như sau

+ Biến tính: Hai mạch đơn của phân tử DNA được tách đôi dưới tách động của nhiệt độ do DNA có thể biến tính - hồi tính theo chu kỳ tăng giảm nhiệt độ Bước này thường được tiến hành ở 94oC

+ Gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng được hạ thấp từ từ Trong hỗn hợp phản ứng lúc này có mặt hỗn hợp 2 mạch đơn DNA vừa tách khỏi nhau và hai mồi Mỗi đoạn mồi sẽ nhận biết và bám vào DNA mạch đơn theo nguyên tắc bổ sung Cặp mồi được thiết kế ở đầu của trình tự đích và do đó sự tổng hợp DNA mới chỉ xảy ra với đoạn DNA đích nằm giữa hai mồi Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào độ dài và trình tự mồi, thông thường nằm trong khoảng 45 - 60oC

+ Kéo dài: Enzyme DNA Polymerase sẽ bám vào đầu 3’ OH tự do của các mồi bám trên sợi khuôn và sử dụng nguyên liệu là bốn loại dNTP để tổng hợp sợi DNA theo chiều 5’– 3’ Thí nghiệm PCR đầu tiên sử dụng đoạn Klenow của DNA Polymerase I làm enzyme tổng hợp, tuy nhiên cứ sau mỗi một chu kỳ lại phải bổ sung enzyme mới vì enzyme cũ đã bị biến tính ở nhiệt độ cao ngay bước ban đầu Sự bất tiện này được giải quyết bằng Taq

DNA Polymerase tách chiết từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus apuaticus

Taq polymerase bền vững với nhiệt, ở nhiệt độ 94oC enzyme này vẫn giữ nguyên khả năng hoạt động Điều đó có nghĩa là enzyme này không cần bổ

sung mới sau mỗi chu kỳ và do đó toàn bộ quá trình PCR có thể được thiết lập hoàn toàn tự động và diễn ra liên tục hơn Hơn nữa nhiệt độ tối ưu để Taq polymarse bắt đầu tổng hợp là 72oC, nhiệt độ của bước kéo dài cao như vậy càng đảm bảo tính đặc hiệu của mồi [7]

2.3.3.3 Ưu và nhược điểm của PCR

* Ƣu điểm

- Thời gian cho kết quả nhanh

- Có thể nhận diện những sinh vật khó nuôi cấy Việc nuôi cấy tăng sinh có khi đơn giản hơn

- Hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ tồn trữ hơn so với huyết thanh học, không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện tại hiện trường

- Ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể tự động hóa để giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm

* Nhƣợc điểm

- Sự ức chế của Taq polymerase bởi thành phần của mẫu vật, mẫu thực phẩm thường có những thành phần phức tạp Việc tách chiết và tinh sạch DNA từ thực phẩm và môi trường trước khi thực hiện phản ứng PCR cho phép loại bỏ những hợp chất ức chế Tuy nhiên một vài quy trình phát hiện sinh vật gây bệnh thực phẩm bằng PCR không cần tách chiết, tinh sạch DNA

- Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp nên trong đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy tăng sinh để có đủ mật độ cho phát hiện bằng PCR

- Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết

Do vậy có thể dẫn tới trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết

- Đòi hỏi người thực hiện phải thành thạo về thao tác