Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phát hiện sớm và dự báo tiên lượng của ung thư thế bào gan nguyên phát trên bệnh nhân nhiễm virut viêm gan b (HBV)

Cơ chế thâm nhập của HBV vào trong tế bào gan cho tới nay vẫn chưa được làm rõ mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu công bố về phương thức gắn kết của đoạn Pre-S1 trên protein bề mặt của HB

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỆNH VIỆN TƯQĐ 108

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC 10-06

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

TRONG PHÁT HIỆN SỚM VÀ DỰ BÁO TIÊN LƯỢNG

CỦA UNG THƯ TẾ BÀO GAN NGUYÊN PHÁT TRÊN BỆNH NHÂN

NHIỄM VIRUT VIÊM GAN B (HBV)

Mã số KC.10.21 /06-10

Cơ quan chủ trì đề tài: BỆNH VIỆN TƯQĐ 108

Chủ nhiệm đề tài: TS Lê Hữu Song

8708

Hà nội - 2010

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư tế bào gan nguyên phát (viết tắt là UTG) hay là ung thư biểu mô

tế bào gan (Hepatocellular Carcinoma, HCC) là bệnh lý thường gặp đứng hàng thứ 5 trên thế giới, có tỷ lệ tử vong đứng hàng thứ 3 trong các tử vong liên quan đến ung thư [1], [2]

UTG thường được chẩn đoán xác định ở giai đoạn muộn khi có triệu chứng như biểu hiện mệt mỏi, đau bụng, gầy sút cân, thậm chí khi đã có khối khu trú sờ được trên thành bụng, khi có tổn thương tế bào gan hoặc muộn hơn khi không còn khả năng can thiệp phẫu thuật cũng như sử dụng các phương pháp trị liệu khác [3] Nguyên nhân chẩn đoán UTG muộn là do sự hạn chế về các phương pháp phát hiện hiện nay Các phương pháp chẩn đoán UTG đang được sử dụng tại các cơ sở y tế bao gồm: khám xét lâm sàng phát hiện thấy gan

to, đau, gầy sút cân nhanh…, các xét nghiệm máu phát hiện dấu ấn ung thư AFP, siêu âm, X quang, nội soi, chụp cắt lớp vi tính (CT scanner), cộng hưởng

từ (Magnetic Resonany Imaging, MRI), sinh thiết gan chẩn đoán mô bệnh học Tuy nhiên, tất cả các phương pháp trên thường phát hiện được UTG ở giai đoạn muộn của bệnh Khi đó các biện pháp can thiệp điều trị ít mang lại hiệu quả, thời gian sống của bệnh nhân sau khi chẩn đoán UTG chỉ kéo dài từ 6 tháng đến 1 năm Vì vậy, nghiên cứu tìm hiểu các dấu ấn sinh học, các biện pháp chẩn đoán mới để phát hiện sớm và tiên lượng UTG là nhu cầu cần thiết hiện nay

Kết quả các nghiên cứu trước đây đã chứng minh nhiễm virut viêm gan B (HBV) là nguyên nhân chủ yếu gây UTG Tuy nhiên không phải tất cả các bệnh nhân nhiễm HBV đều tiến triển thành UTG Nhiễm HBV có thể gây viêm gan cấp tính tự hồi phục, hoặc tiến triển thành viêm gan mạn tính, xơ gan, viêm gan

ác tính, hoặc trở thành người mang HBV mạn tính không triệu chứng [4] Nguyên nhân nào dẫn đến sự khác biệt đó vẫn còn nhiều tranh luận Liên quan đến UTG người ta thấy rất nhiều các bệnh nhân được phát hiện bệnh một cách

tình cờ, nghĩa là UTG thường xuất hiện trên các bệnh nhân trước đây hoàn toàn khỏe mạnh nhưng mang HBV mạn tính không triệu chứng

UTG cũng như tất cả các bệnh ung thư khác nói chung là hậu quả của biến đổi nhiều gene, tương tác qua lại của nhiều protein, DNA trong các tế bào

Do đặc điểm bộ gene và vòng đời của HBV có liên quan chặt chẽ đến sự hình thành UTG nên việc tìm ra các dấu ấn phân tử của HBV như đột biến gene, mức

độ biểu hiện gene HBV và gene người là một trong những hướng nghiên cứu đang rất được quan tâm [4]

Việt Nam là nước có người nhiễm HBV đứng hàng cao nhất thế giới, tỷ lệ HBsAg (+) ở người lớn khoẻ mạnh từ 10 – 20% có nơi lên tới 26% [5] Như vậy, ước tính có hơn 10 triệu người đang mang HBV mạn tính ở nước ta và nguy cơ phát sinh UTG ở những người này là rất lớn

Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm các mục tiêu sau:

1 Xác định tỷ lệ và mối liên quan giữa đột biến gene của HBV và bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát

2 Xác định các phương pháp phát hiện sớm ung thư tế bào gan nguyên phát trên bệnh nhân nhiễm HBV

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình dịch tễ bệnh ung thư gan trên thế giới

Ung thư gan nguyên phát là ung thư phổ biến, đứng hàng thứ 5 trong số các bệnh ác tính và là nguyên nhân thứ 3 gây tử vong, chỉ sau ung thư phổi và

dạ dày Hàng năm có khoảng 500 000 - 1000 000 ca bệnh mới phát hiện, và tử vong khoảng 600 000 người [2] Mặc dù hiện nay tỷ lệ mắc ung thư gan còn tương đối thấp, tuy nhiên số liệu có xu hướng tăng dần trên các nước phát triển [6]

Ung thư gan là nguyên nhân thứ tư gây tử vong trong số các ung thư, sau ung thư phổi, dạ dày và đại trực tràng Nhưng đối với nam giới ung thư gan là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 3, còn nữ giới đứng hàng thứ

và châu Phi thì ung thư gan gặp nhiều hơn trên các bệnh nhân không có xơ gan [9]

1.2 Tình hình dịch tể ung thư gan tại Việt nam

Ung thư gan là một trong 5 loại ung thư thường gặp và Việt Nam là quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan đứng hàng thứ 3 trên thế giới Đặc biệt, tỉ lệ nam mắc bệnh nhiều hơn nữ Theo “Ghi nhận ung thư quần thể” tại Tp.HCM 2006, ung thư gan đứng hàng thứ 1 ở nam giới với tần suất là

24,2/100.000 dân và đứng hàng thứ 5 ở nữ giới với tần suất là 6,2 / 100.000 dân

Tại Bệnh viện Ung Bướu Tp.HCM, mỗi năm tiếp nhận khoảng 500 ca ung thư gan mới Trong những năm gần đây, mỗi năm, Việt Nam có đến 10.000 ca mắc bệnh mới, và trở thành quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan hàng đầu thế giới Phần lớn các bệnh nhân lại phát hiện bệnh trong giai đoạn muộn nên việc chữa trị không còn hiệu quả [10], [11]

Do ung thư gan thường đa ổ và đa vị trí nên ngay trong những trường hợp ung thư gan khu trú có phẫu thuật, chỉ khoảng 30-40% bệnh nhân sống được thêm 5 năm, còn trung bình là khoảng 3 năm

Một nghiên cứu gần đây dựa trên các số liệu hiện có và sử dụng các thuật toán để tính toán tiên lượng cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính tăng từ 6.4 triệu người năm 1990 lên khoảng 8.4 triệu năm 2005 và tiên lượng đến năm 2025 là 8 triệu Đó là kết quả của chương trình tiêm chủng để phòng nhiễm HBV Trong khi đó tỷ lệ xơ gan và UTG do HBV lại có xu hướng tăng cao: năm 1990 là 21.900 đối với xơ gan, 9400 đối với UTG thì đến năm 2025 các số liệu tương ứng đó là 58.650 và 25.000 Tỷ lệ tử vong do HBV tăng từ 12.600 năm 1990 lên 40.000 ở năm 2025 [11]

1.3 Các yếu tố nguy cơ gây ung thư gan

Yếu tố nguy cơ chủ yếu nhất để tiến triển thành ung thư gan là xơ gan Tuy nhiên tại Mỹ có hơn ¼ các trường hợp ung thư gan không tìm thấy các yếu tố nguy cơ Các yếu tố nguy cơ tiến triển thành ung thư gan được biết khác là virut viêm gan B và C, chất độc như rượu và Aflatoxins, rối loạn chuyển hoá như đái tháo đường và gan nhiễm mỡ, bệnh nhiễm sắt sắc tố di truyền và liên quan các yếu tố miễn dịch như xơ gan mật nguyên phát và viêm gan tự miễn [8]

Theo tổ chức y tế thế giới HBV là yếu tố thứ hai sau thuốc lá được cho

là nguyên nhân gây ung thư ở người Từ trước tới nay đã có rất nhiều nghiên cứu về nguy cơ ung thư gan trên bệnh nhân nhiễm HBV được tiến hành tại các nước Đông Á, nơi mà hầu hết bệnh nhân nhiễm HBV từ khi mới sinh ra [12]

1.4 Một số hiểu biết về HBV

Cơ chế gây ung thư trên bệnh nhân nhiễm HBV đã được nghiên cứu rất tích cực và kết quả đã khẳng định HBV là một nguyên nhân quan trọng chủ yếu gây UTG [13] Để phản ánh rõ hơn vai trò của HBV trong UTG chúng tôi xin tóm tắt một số hiểu biết về HBV hiện nay

1.4.1 Cấu trúc của HBV

1.4.1.1 Đặc điểm hình thái

HBV là loại virus nhỏ thuộc họ Hepadnavirus Đây là loại virus viêm

gan duy nhất có nucleic acid nhân là DNA Dưới kính hiển vi điện tử người ta thấy có 3 loại tiểu thể khác nhau của HBV:

• Tiểu thể hình cầu nhỏ có đường kính 22nm

• Tiểu thể hình ống (hình que) có đường kính 20-22nm, dài từ 400nm

40-• Tiểu thể hình cầu lớn (còn gọi là tiểu thể Dane) có đường kính là 42-45nm

Hai tiểu thể hình cầu và hình ống là phần vỏ thừa ra trong quá trình nhân lên của hạt virus hoàn chỉnh (Dane), đây cũng chính là các kháng nguyên bề mặt HBsAg của HBV Các tiểu thể cầu nhỏ và hình ống có thể đứng riêng rẽ hoặc đứng với nhau thành từng cụm, chúng không phải là hạt virus hoàn chỉnh nên không có khả năng lây nhiễm

Hình 1.1 Tiểu thể nhỏ hình cầu (A) và hình ống (B) của HBV

Tiểu thể Dane chính là hạt HBV hoàn chỉnh được cấu tạo như sau: Lớp

vỏ ngoài cùng của hạt virus được cấu tạo bởi các protein bề mặt gọi chung là Hepatitis B surface protein (HBs) Lớp vỏ này bao bọc xung quanh một protein được đặt tên là protein lõi- Hepatitis B core protein (HBc) hay còn gọi

là capsid Lớp capsid này bao bọc xung quanh vòng DNA nhân và enzym phiên mã ngược polymerase của HBV (hình 1.2)

Hình 1.2 Hạt virus hoàn chỉnh

(tiểu thể Dane) của HBV

Hình 1.3 Hình ảnh hiển vi điện tử HBV [14]

A

B

Hệ gen của HBV có bốn khung đọc mở (open-reading frame) ORF gối lên nhau hoàn toàn hoặc không hoàn toàn nhằm giảm thiểu chiều dài của bộ gen, bao gồm: gen lõi C, gen bề mặt S, gen X, gen polymerase P Các gen này

mã hóa cho toàn bộ các protein của virus Sự bắt cặp bổ sung của các nucleotide trên vùng gối của hai sợi (âm và dương) được giới hạn bởi hai trình tự lặp trực tiếp DR1 và DR2 cho phép quá trình khép vòng của hệ gen xảy ra khi protein P (polymerase) liên kết đồng hóa trị với đầu 5’ của sợi âm (hình 1.4)

ORF của gen S khá dài chứa ba codon khởi đầu ATG chia ORF này

thành ba vùng Pre-S1, Pre-S2 và S mã hóa cho ba dạng protein bề mặt hay còn gọi là các kháng nguyên bề mặt (HBsAg) của virus: kháng nguyên S nhỏ

mã hóa bởi gen S (226 anino acid- a.a), kháng nguyên S trung bình mã hóa bởi gen Pre-S2/S (thêm 55 a.a so với kháng nguyên S nhỏ), kháng nguyên S lớn mã hóa bởi gen Pre-S1/Pre-S2/S (tùy thuộc vào từng kiểu huyết thanh (serotype) thêm 108 a.a hoặc 119 a.a so với kháng nguyên S trung bình)

ORF của gen C mang hai bộ ba khởi đầu mã hóa hai loại protein:

protein cấu trúc của lớp vỏ nucleocapside có vai trò quan trọng trong việc lắp gép hạt virus (kháng nguyên lõi- HBcAg); protein Pre- core là tiền thân của một loại kháng nguyên sớm được tiết ra bởi những tế bào bị xâm nhiễm (HBeAg)

ORF của gen X mã hóa cho kháng nguyên X (HBxAg), kháng nguyên

này không tham gia vào cấu trúc của virus Có rất nhiều ghi nhận về mối liên

hệ giữa protein này với cơ chế sinh ung thư của tế bào gan bị nhiễm [15], [16], [17]

ORF của gen P chiếm 80% chiều dài bộ gen, mã hóa một enzym đa

chức năng có kích thước 831a.a được gọi là protein P (polymerase hoặc Pol) Enzym này có trách nhiệm thực hiện các chức năng sau trong quá trình tái tạo virus: (i) đóng khung RNA tiền hệ gen của virus; (ii) “mồi” cho quá trình tổng hợp DNA; (iii) phiên mã ngược RNA tiền hệ gen thành DNA sợi đôi; (iv) có hoạt tính RNAse-H để biến tính RNA tiền hệ gen Protein này cũng là mục tiêu lý tưởng cho các thành phần kháng virus được sử dụng trong điều trị viêm gan B mạn tính [18]

Hình 1.4 Cấu trúc bộ gen HBV tương ứng với các mRNA (A) và với các protein (B)

Cấu trúc của gen polymerase HBV bao gồm 4 vùng bảo toàn đã được xác định thông qua so sánh với trình tự enzym phiên mã ngược của HIV và được xác nhận lại bởi các nghiên cứu di truyền và chức năng virus Bốn vùng khác nhau trong protein P được thể hiện ở hình 1.5 [18]

B

A

Hình 1.5 Gen S và P gối nhau trong cấu trúc gen HBV

Gen S mã hóa các protein vỏ (nhỏ- SHBsAg, trung bình- MHBsAg và lớn LHBsAg) Vùng háo nước lớn (Major Hydrophilic Region- MHR) từ a.a 101 đến 160 Yếu tố a nằm trong vùng này Vị trí xúc tác của enzym phiên mã ngược của HBV (RT) tại vùng YMDD

™ Protein tận cùng (Terminal protein) là một phần của polymerase đóng vai trò như đoạn mồi trong quá trình phiên mã ngược, do đó đây là nơi bắt đầu quá trình tổng hợp sợi âm [19] Các đột biến điểm tại vùng này làm polymerase virus không thể đóng vòng RNA tiền hệ gen dẫn đến HBV mất khả năng tái tạo [18]

™ Vùng đệm (Spacer) không có hoạt tính enzym và không mang những vị trí kháng thuốc, cho đến nay chức năng của vùng này vẫn chưa được sáng tỏ

™ Vùng RT/ polymerase là vùng chức năng nơi mà quá trình phiên mã ngược và tổng hợp sợi DNA thứ hai diễn ra Vùng này được chia thành 7 miền nhỏ A, B, C, D, E, F, G Vị trí tổng hợp nằm trong miền C xung quanh

trình tự YMDD là một motif bảo toàn cao giữa các Hepadnavirus và Retrovirus và được coi là vùng nhận biết nucleotide của enzym virus Các đột

biến điểm gây nên hiện tượng kháng thuốc thường xảy ra trong miền A, B và

C Trong miền C các đột biến điểm biến motif YMDD thành YIDD, YVDD, YRDD và YSDD là phổ biến nhất và rất có ý nghĩa trong lâm sàng

™ Vùng RNAse-H có hoạt tính loại bỏ RNA khuôn

1.4.2 Cơ chế nhân lên của HBV

Sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ (với Human hepatitis B virus là người và tinh tinh; đối với Duck hepatitis B virus và Squirrel hepatitis virus là vịt, sóc, chồn…) và vượt qua hàng rào bảo vệ của hệ thống miễn dịch, HBV

sẽ di chuyển tới tổ chức gan theo hệ thống tuần hoàn Cơ chế thâm nhập của HBV vào trong tế bào gan cho tới nay vẫn chưa được làm rõ mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu công bố về phương thức gắn kết của đoạn Pre-S1 trên protein bề mặt của HBV với một số các thụ cảm thể trên bề mặt tế bào gan [20], [21], [22] Quá trình nhân lên của HBV được tóm tắt như sau:

Protein bề mặt của HBV có các vị trí gắn đặc hiệu với các thụ cảm thể trên bề mặt tế bào gan, nhờ đó virus xâm nhập được vào trong tế bào gan Sau khi hòa màng, virus lột bỏ hết lớp vỏ ngoài và giải phóng lõi DNA vào trong nhân của tế bào gan Tại đây, bộ gen của virus từ một vòng DNA kép không hoàn chỉnh được biến đổi thành cccDNA hoạt động như một khuôn phiên mã

tạo ra các mRNA của virus Các mRNA này được vận chuyển qua màng nhân

ra tế bào chất và được dịch mã tạo ra các protein virus: protein bề mặt (HBsAg), protein lõi (HBcAg), HBeAg, Pol, protein HBx và một số protein khác chưa xác định Ngay sau khi được tổng hợp, các protein này tự động

“lắp ghép” với mRNA của virus Từ mRNA, nhờ khả năng phiên mã ngược của protein Pol tổng hợp hai chuỗi đơn DNA của virus để tạo thành hạt HBV hoàn chỉnh rồi được “nảy chồi” để lắp ráp nốt các kháng nguyên bề mặt khi đi qua mạng lưới nội chất HBV lúc này đã hoàn thiện sẽ thoát ra khỏi tế bào và

đi vào hệ tuần hoàn rồi tiếp tục xâm nhiễm các tế bào gan khác để thực hiện chu trình nhân lên mới

Hình 1.6 Chu trình nhân lên của HBV trong tế bào gan [21]

Trong suốt quá trình trên, một số HBV DNA mới được hình thành trong

tế bào chất có thể quay trở lại nhân tế bào để tổng hợp cccDNA để từ đó lại hình thành nên các hạt virus hoàn chỉnh khác [20], [21] Chu trình đó cứ tái

diễn nhiều lần trong suốt thời gian tồn tại của HBV trong cơ thể vật chủ Người ta ước tính ở mỗi bệnh nhân mang HBV mạn tính mỗi ngày có khoảng

1011 hạt virus được tạo thành [18], [23] Trong một số trường hợp, các sản phẩm protein như HBsAg có thể được tổng hợp dư thừa dẫn đến hiện tượng ở một số bệnh phẩm chúng ta thấy các tiểu thể kích thước nhỏ (32nm) hình cầu hoặc hình ống Đây là một trong những nguyên nhân giải thích tại sao việc định lượng nồng độ HBsAg trong máu ít có giá trị trong việc đánh giá mức độ hoạt động của HBV Tất cả các hạt HBV hoàn chỉnh cũng như các tiểu thể không hoàn chỉnh đều có trong máu và lưu hành trong hệ tuần hoàn

Trong quá trình nhân lên, do enzyme Pol của HBV không có hoạt tính tự đọc sửa dẫn đến hậu quả là tần suất đột biến xuất hiện rất cao, ước tính mỗi năm có từ 1,5 x 10-5 đến 5 x 10-5 vị trí nucleotide thay thế ở những người có HBeAg (+) [18], [23] Sự thay đổi trên bộ gen của HBV xảy ra sau những đột biến rải rác và có thể là sự chọn lọc ưu thế đối với đáp ứng miễn dịch của vật chủ và các yếu tố khác như kháng thuốc điều trị [18] Tỷ lệ xuất hiện các đột biến hoặc các đột biến cộng hợp trên HBV ở bệnh nhân có HBeAg (-) được ghi nhận là cao hơn các đối tượng khác Theo Desmond kết quả này gợi mở khả năng đáp ứng miễn dịch của vật chủ có thể có vai trò quan trọng trong sự tiến hóa của HBV [23] Trong một số trường hợp quá trình nhân lên của HBV không được thực hiện một cách tuần tự và chính xác như trên dẫn đến việc xuất hiện các đột biến gen và xa hơn nữa là sự xuất hiện của những kiểu gen HBV khác nhau [18]

1.4.3 Cơ chế bệnh sinh của HBV

Quá trình nhân lên của HBV không gây độc trực tiếp cho tế bào chủ Thực tế này hoàn toàn phù hợp với những nghi nhận trên các bệnh nhân VGB không triệu chứng, mặc dù vẫn ghi nhận được sự nhân lên của virus nhưng

Ngày nay các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, chính cơ chế đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ chống lại các kháng nguyên của virus được biểu hiện trên

bề mặt tế bào gan bị lây nhiễm là nguyên nhân làm tổn thương tế bào gan Cơ chế này đã được minh chứng bởi dấu hiệu lâm sàng trên các bệnh nhân có sức

đề kháng kém; khi bị nhiễm HBV, mức độ tổn thương gan cấp tính chỉ ở mức

độ trung bình nhưng lại có tỷ lệ tiến triển sang thể mạn tính rất cao [18]

Hình 1.7 Cơ chế đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với HBV [21]

Cơ chế đáp ứng miễn dịch đối với HBV và vai trò của nó đối với cơ chế bệnh sinh vẫn chưa được tìm hiểu một cách đầy đủ Những nghiên cứu lâm sàng trên máu ngoại vi cho thấy cơ chế đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với các kháng nguyên của HBV diễn ra như sau (hình 1.7): Quá trình nhân lên của HBV trong tế bào gan tạo ra vô số các hạt virus cũng như các các protein HBsAg Cả hai cấu tử trên đều bị tế bào trình diện kháng nguyên bắt giữ và phân cắt thành các mảnh peptid Các mảnh peptid được gắn trên các phân tử MHC-I, MHC-II trên bề mặt tế bào và được trình diện ra ngoài Các thụ thể

trên tế bào bổ trợ trưởng thành CD4+ nhận biết các kháng nguyên của virus được trình diện trên phân tử MHC-II, kích hoạt Lympho T gây độc CD8+ Các thụ thể trên CD8+ nhận diện các kháng nguyên của virus được gắn với phân tử MHC-I, ghi nhớ chúng rồi thực hiện cơ chế đáp ứng miễn dịch theo hai con đường: (i) một mặt kích thích hệ miễn dịch sinh ra TNF α và interferon γ để ngăn cản sự nhân lên của virus xung quanh tế bào gan nhưng không tiêu diệt tế bào chủ này; (ii) mặt khác tìm kiếm các mảnh peptid gắn với MHC-I trên bề mặt tế bào gan để tiêu diệt, qua đó tiêu diệt luôn tế bào gan [21]

1.4.4 Cơ sở của sự đa dạng bộ gen HBV

Nhờ protein Pol của HBV là một enzym đa chức năng, vừa có hoạt tính của RNAnase vừa có hoạt tính DNAnase nên virus này có khả năng tái bản với tốc độ cao trong tế bào lây nhiễm Tuy nhiên, protein này không có hoạt tính đọc sửa nên trong quá trình tái bản bộ gen virus xảy ra các đột biến với tỷ

lệ cao, ước tính từ 1,4 đến 3,2 x 10-5 sự thay thế nucleotide tại mỗi vị trí trong một năm [21] Tỷ lệ này thấp hơn một đến hai lần so với các virus mang enzym polymerase không có chức năng đọc sửa ở các RNA virus nhưng lại cao hơn các DNA virus khác tới bốn lần [18], [24] Kết quả là, quần thể HBV

có thể tiến hóa nhanh hơn hầu hết các DNA virus khác trong khả năng đáp ứng với các tác nhân môi trường, và sự xuất hiện của các đột biến dưới những

áp lực của những tác nhân này có thể là những hiện tượng xảy ra thường xuyên Gần đây, khi nghiên cứu quá trình tiến hóa của 8 bộ gen HBV kiểu gen B từ các bệnh nhân âm tính HBeAg (không điều trị) trong giai đoạn 25 năm, Osiowy (2006) đã ghi nhận được tỷ lệ thay thế nucleotide ước tính là 7,9

x 10-5 nucleotide/vị trí/năm Điều thú vị là, khi nghiên cứu một bệnh nhân nhiễm HBV kiểu gen F có kháng thể kháng HBsAg trong giai đoạn 3 năm, một tỷ lệ lớn hơn đã được ghi nhận 2,7 x 10-3 [25]

Ngoài cơ chế gây đột biến điểm do thiếu khả năng đọc sửa của protein Pol, còn có các cơ chế tiềm tàng khác làm phát sinh các biến thể bộ gen HBV như: chỉnh sửa DNA virus bởi cytidine deaminase của tế bào (xúc tác thay thế Guanine thành Adenine và Cytosine thành Thymine), hay thêm/bớt các đoạn trình tự trong hệ gen HBV do quá trình ghép nối RNA tiền hệ gen bởi enzym topoisomerase I trong tế bào [26]

Tất cả các nhân tố trên đều góp phần hình thành những biến dị di truyền

và là nguyên nhân sâu xa tạo nên sự đa dạng của các chủng HBV Những kiểu gen (genotype), kiểu gen phụ (subgenotype), kiểu huyết thanh phụ thuộc HBsAg (serotype) mặc dù cùng chung một nguồn gốc nhưng có lịch sử tiến hóa riêng rẽ để tạo nên sự ổn định về mặt di truyền Chúng xuất hiện trong những quần thể người đặc trưng và di trú cùng với vật chủ tới các khu vực khác nhau tạo nên sự phân bố địa lý của các chủng HBV trên toàn thế giới Hơn thế nữa, quá trình tái tổ hợp giữa các kiểu gen tạo ra các biến thể mới cũng góp phần tạo nên sự đa dạng di truyền của HBV [27]

Trong phạm trù biến dị di truyền, cần phải phân biệt rõ ràng giữa các kiểu gen HBV và đột biến đã được thiết lập Các kiểu gen khác nhau là các dạng tương đối ổn định của virus, là kết quả của những thay đổi ngẫu nhiên được chọn lọc qua nhiều năm dưới những áp lực quần thể Nói cách khác, khái niệm kiểu gen được áp dụng với các dạng có khả năng tái bản thành các bản sao mang trình tự hệ gen đạt được sự ổn định sau một thời gian dài [28] Trong khi đó, các đột biến phát sinh ở từng cá thể dưới áp lực miễn dịch gây

ra bởi điều kiện tự nhiên hoặc do các can thiệp y học Chúng bao gồm các đột biến giúp virus thoát khỏi globulin miễn nhiễm HBIG (Hepatitis B immune globulin), tác dụng của vaccin, các loại thuốc kháng virus Ở các bệnh nhân cấy ghép gan, quá trình điều trị lâu dài với hàm lượng HBIG cao trong hoàn cảnh nồng độ virus thấp và số lượng tế bào gan dễ tổn thương lớn là môi

trường nuôi dưỡng lý tưởng cho các đôt biến HBV xảy ra Đối với các bệnh nhân HBV mạn tính, các đột biến xảy ra tự nhiên có thể được chọn lọc bởi đáp ứng miễn dịch của cơ thể người bệnh [29]

1.4.5 Mối liên quan giữa nhiễm HBV với UTG

1.4.5.1 Vai trò của các protein HBV trong sinh bệnh học ung thư gan

HBV có thể mã hoá cho các protein có vai trò quan trọng trong sự hình thành ung thư gan Ví dụ như HBX là một gene không cấu trúc của HBV được nghiên cứu rất nhiều Gene này có vai trò điều biến phiên mã đa chức năng cũng như kiểm soát đáp ứng với các áp lực gây tổn thương gene, thoái giáng protein, chết có chương trình và nhiều các con đường tín hiệu khác nhau Mặc dù cơ chế đặc hiệu của nó vẫn chưa rõ nhưng HBX đóng một vai trò rất quan trọng trong việc hình thành các khối ung thư gan ác tính đã được chứng minh trong các nghiên cứu chuyển gene trên chuột [13] Ngoài ra HBx protein đã được chứng minh là có khả năng gắn kết với protein ức chế khối u

là P53 và ức chế chức năng của protein này [12]

1.4.5.2 Kiểu gene HBV trong sinh bệnh học ung thư gan

Các yếu tố thuộc về virut khác như kiểu gene HBV đã được chứng minh là có liên quan đến sinh bệnh học ung thư gan Cho đến hiện nay 10 kiểu gene của HBV được xác định dựa trên sự khác biệt trên trình tự của bộ gene HBV, được ký hiệu từ A đến J [29]

Người ta thấy rằng, trên bệnh nhân mang kiểu gene C tỷ lệ dương tính của HBeAg cũng như mức độ nhân lên của HBV cũng cao hơn là ở nhóm mang kiểu gene B Thời gian chuyển đảo huyết thanh ở nhóm có kiểu gene C lâu hơn so với kiểu gene B, tỷ lệ đột biến điểm tại vùng tiền nhân (Pre-Core)

ở nhóm có kiểu gene C cũng cao hơn là nhóm có kiểu gene B Những đột biến

này thường thấy ở nhóm bệnh nặng như xơ gan và ung thư gan hơn là ở nhóm bệnh nhân viêm gan cấp và viêm gan mạn tính Trong khi đó những bệnh nhân trẻ dưới 50 tuổi mang kiểu gene B thường tiến triến thành ung thư gan nhanh hơn là kiểu gene C ở cùng độ tuổi [30]

Một nghiên cứu khác gần đây trên 375 bệnh nhân được thu thập tại một

số bệnh viện khu vực Hà Nội chúng tôi thấy kiểu gene C đã được tìm thấy nhiều ở nhóm ung thư hơn là ở nhóm không ung thư [31]

1.4.5.3 Hiện tượng tái tổ hợp kiểu gene và đồng/bội nhiễm hơn một kiểu gene trong bệnh do nhiễm HBV

Nhờ có những kỹ thuật phân tích trình tự gene người ta đã phát hiện ra rằng HBV không phải chỉ có những kiểu gene đơn thuần như trên đã mô tả

mà còn có sự tái tổ hợp kiểu gene (recombination), hay là sự pha trộn hơn một kiểu gene Những nghiên cứu trước đây cho thấy rằng có sự tái tổ hợp giữa kiểu gene B và C; A và C là khá phổ biến Người ta cho rằng vùng lõi (core) của kiểu gene C có vai trò rất quan trọng trong việc hình thành kiểu gene hỗn hợp này Trong những nghiên cứu gần đây người ta và chúng tôi đã thấy rằng

tỷ lệ đồng/bội nhiễm hơn một kiểu gene là không hiếm, từ 18,9%, đến 33,7%

và 60% [31] Thêm vào đó người ta thấy đồng/bội nhiễm kiểu gene cũng gặp

ít hơn ở nhóm bệnh nhân bị viêm gan B cấp, mạn và người mang HBV không triệu chứng so với nhóm bệnh nhân bị xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan liên quan nhiễm HBV

1.4.5.4 Vai trò của đột biến gene HBV và nồng độ HBV DNA trong ung thư gan

Trong quá trình phát triển và nhân lên tự nhiên của virút có thể xuất hiện đột biến trên geneome của chúng Người ta thấy rằng, đột biến trên

genome của HBV, đặc biệt là trên gene HBx, Pre-S sẽ làm tăng nguy cơ phát sinh ung thư tế bào gan nguyên phát Một nghiên cứu trên 160 bệnh nhân nhiễm HBV tại Nhật Bản cho thấy có 23% bệnh nhân có đột biến tại vùng Pre-S Trong đó đột biến mất đoạn tại vùng Pre-S trên bệnh nhân xơ gan và ung thư gan là 54% so với nhóm viêm gan mạn tính và người mang virut chỉ

1.4.5.5 Tương tác giữa bộ gene HBV với gene người

Ngày càng có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh sự tương tác qua lại giữa gene HBV với gene người dẫn đến biến đổi các dòng tín hiệu nội, ngoại bào Đó là những dòng tín hiệu rất quan trọng liên quan đến sự hình thành ung thư [34], [18] Trong số những gene người có biểu hiện rõ nhất là gene P53 và gene mã hoá thụ cảm thể cho androgene Đối với gene ức chế khối u người ta đã thấy HBX của HBV có một đoạn tương đồng với gene P53 Khi HBX cài cắm vào bộ gene người thì sẽ gắn kết và làm bất hoạt gene P53 Dẫn đến làm thay đổi chết có chương trình của tế bào hoặc khối u không

bị ức chế [35]

Ung thư gan do nhiễm HBV thường gặp trên các bệnh nhân nam hơn là bệnh nhân nữ Bệnh nhân nam thường có nồng độ HBV DNA tăng cao hơn bệnh nhân nữ, mà HBV DNA là một yếu tố nguy cơ phát triển UTG Nguyên nhân nào dẫn đến tình trạng đó đã được các nghiên cứu gần đây chứng minh

Trên môi trường nuuôi cấy người ta chuyển gene HBV và gene mã hóa thụ cảm thể androgene vào trong tế bào gan HepG2 để đánh giá ảnh hưởng của dòng tín hiệu androgene lên quá trình sao dịch mã của HBV Kết quả cho thấy thụ cảm thể androgene có thể làm tăng quá sinh sao mã thành HBV RNA sau khi hoạt hóa thụ thể này Người ta cũng đã xác định được vùng tăng cường I (enhancer I) của HBV là nơi chịu trách nhiệm trong đáp ứng với sự hoạt hóa của thụ cảm thể androgene Bằng công nghệ ngưng kết miễn dịch sợi nhiễm sắc và phương pháp liên kết trong ống nghiệm người ta đã chứng minh thụ cảm thể androgene đã liên kết trực tiếp với vùng tăng cường I theo cơ chế phụ thuộc chất gắn (ligand-dependent) Qua đó người ta đã xác định được 2 cấu trúc cơ bản trong khu vực vùng tăng cường này chịu trách nhiệm đáp ứng với thụ thể androgene Khi gây đột biến khu vực này thì sẽ gây mất ảnh hưởng của thụ thể androgene Những kết quả đó đã chứng minh dòng tín hiệu qua androgene có thể làm tăng mức độ sao mã của HBV thông qua sự gắn trực tiếp lên các vị trí đáp ứng androgene với vùng tăng cường I của HBV Kết quả này có thể giải thích nguyên nhân làm cho nồng độ HBV DNA tăng cao hơn trên bệnh nhân nam và qua đó làm tăng nguy cơ của UTG [36]

Như vậy, ung thư gan là một trong những ung thư phổ biến nhất trên thế giới Bên cạnh những yếu tố nguy cơ liên quan đến ung thư gan như xơ gan, nhiễm độc thì nhiễm HBV là một nguyên nhân quan trọng hàng đầu Qua nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng ngày nay người ta đã chứng minh rất rõ vai trò của HBV trong bệnh sinh ung thư gan

1.5 Các phương pháp chẩn đoán ung thư gan hiện nay

Các phương pháp chẩn đoán UTG hiện nay gồm khám xét lâm sàng, các xét nghiệm máu phát hiện dấu ấn ung thư AFP, siêu âm, X quang, nội soi, chụp cắt lớp vi tính (CT scanner), cộng hưởng từ (Magnetic Resonany

Imaging, MRI), sinh thiết gan chẩn đoán mô bệnh học [37] Tuy nhiên, tất

cả các phương pháp trên thường phát hiện được bệnh ở giai đoạn muộn Khi

đó các biện pháp can thiệp điều trị ít mang lại hiệu quả, thời gian sống của bệnh nhân sau khi chẩn đoán UTG không kéo dài quá 6 tháng nếu không được phẫu thuật hoặc 95,5% trường hợp chết trong vòng 1 năm kể từ khi phát hiện [38] Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử phát hiện sớm và tiên lượng UTG góp phần nâng cao hiệu quả điều trị là cần thiết và có ý nghĩa

1.6 Các dấu ấn phân tử có giá trị trong chẩn đoán ung thư gan

Từ trước tới nay chúng ta vẫn chỉ dựa vào khám xét lâm sàng, siêu âm, xét nghiệm Alpha-fetoprotein (AFP) và sinh thiết gan làm tổ chức học để chẩn đoán ung thư gan Tuy nhiên khi bệnh được chẩn đoán bằng các phương pháp trên thì hầu hết các bệnh nhân UTG tử vong trong thời gian ngắn sau đó, bởi vì như vậy thì đã muộn, sự tiến triển của khối ung thư rất nhanh, không còn khả năng điều trị Ngay tại Mỹ khi nghiên cứu trên 8730 bệnh nhân UTG

từ năm 1991 đên 2005 người ta thấy cũng chỉ có 8.7% trường hợp được phẫu thuật, 1.4% được ghép gan, 3.6% được tiêm cồn tại chỗ và 16% được tắc mạch hóa dầu Có tới 70.3% chỉ được điều trị triệu chứng hoặc không được điều trị gì, do không được chẩn đoán kịp thời [39] Vì vậy, sự cần thiết nhất hiện nay là phải tìm ra các dấu ấn sinh học có độ nhạy, độ đặc hiệu cao để chẩn đoán sớm và theo dõi tái phát sau phẫu thuật, góp phần đưa ra các phác

đồ điều trị phù hợp Như chúng ta đã biết AFP là một dấu ấn sinh học có giá trị đã và đang được dùng để chẩn đoán và theo dõi UTG trong nhiều năm qua AFP cùng với siêu âm là những thông số rất có giá trị, nhưng tỷ lệ âm tính giả vẫn có thể lên tới 40% trên các bệnh nhân UTG giai đoạn sớm Và ngay cả trên các bệnh nhân UTG ở giai đoạn muộn thì nồng độ AFP vẫn trong giới

hạn bình thường từ 15-30% Gần đây các dấu ấn sinh học khác dùng để chẩn đoán UTG như des-g-carboxy prothrombin, alkaline phosphatase isoenzyme-I (ALP-I), và kháng nguyên đặc hiệu polypeptide tổ chức đã được nghiên cứu

để nâng cao độ nhạy và giá trị đặc hiệu góp phần trong chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh, tuy nhiên nhìn chung kết quả còn chưa thống nhất [40], [41] Qua tổng kết chúng ta có thể thấy một số dấu ấn phân tử có giá trị cao trong chẩn

đoán sớm UTG đang được quan tâm nhất là:

1.6.1 Alpha-fetoprotein đặc hiệu (HS-AFP) ung thư gan và mRNA của nó (Hepatoma specific AFP và AFP-mRNA)

AFP là một glycoprotein có trọng lượng phân tử 70 kD, được tổng hợp bởi túi ối thai, gan và ruột AFP có thời gian bán huỷ là 5-7 ngày Nồng độ trong huyết thanh của AFP là một dấu ấn chỉ điểm tiên lượng đáp ứng và sống sót của tế bào mầm ung thư [42] Tuy nhiên khi có sự tăng nhẹ của AFP thì có thể là do phản ứng tăng không đặc hiệu của một số bệnh lý gan không ung thư Vì vậy, mặc dù có giá trị chẩn đoán UTG nhưng tỷ lệ dương tính giả và

âm tính giả có thể hơn 40%, nhất là trong các trường hợp khối u nhỏ hơn 3

cm [37] Gần đây người ta phát hiện thấy một tiểu phần của AFP đặc hiệu ung thư gan là HS-AFP có giá trị hơn AFP cả về độ nhạy và độ đặc hiệu để phân biệt bệnh lý ung thư và không ung thư của gan [43], [44] Dựa theo khả năng liên kết với lens culinaris agglutinin (LCA) hoặc sự khác biệt về điểm đẳng điện mà AFP toàn bộ được chia thành 3 dạng là AFP-L1, AFP-L2, và AFP-L3 HS-AFP là mảnh liên kết với LCA, là thành phần glycoform chủ yếu của AFP trong huyết thanh bệnh nhân UTG Các nghiên cứu trước đây cho thấy mặc dù không có mối liên quan nào giữa HS-AFP với AFP, cũng như tình trạng nhiễm HBV, kích thước và số lượng khối u, nhưng HS-AFP lại có mối liên quan với mức độ biệt hoá tế bào ung thư, di căn và tái phát bệnh [43],

[45] Điều đó gợi ý rằng HS-AFP có giá trị đặc hiệu hơn AFP trong chẩn đoán

sớm và theo dõi tái phát UTG

Gần đây nhờ có các kỹ thuật sinh học phân tử người ta đã chứng minh các dấu ấn di truyền (gene-markers) và các protein đặc hiệu ung thư có thể được sử dụng để theo dõi tiến triển bệnh lý trở thành u của tế bào gan và để chẩn đoán UTG ở giai đoạn sớm [46]

AFP-mRNA trong tế bào đơn nhân máu ngoại vi đang rất được quan tâm nghiên cứu [47] Nếu mRNA đặc hiệu tế bào gan được phát hiện trong máu ngoại vi thì có thể suy đoán là có các tế bào ung thư gan lưu hành và có thể tiên lượng được di căn [40] Cho đến hiện nay đã có rất nhiều phương pháp để chẩn đoán và tiên lượng UTG như khám xét lâm sàng, các dấu ấn sinh học phân tử, gene ung thư tuy nhiên các kết quả vẫn chưa thống nhất Do

đó, trong điều kiện có nhiều bệnh nhân nhiễm HBV như Việt nam, chúng ta

có điều kiện và cần thiết phải xác định vai trò của HS AFP-mRNA

bám dính của Aflatoxin β1 (AFB1) nên từ trước tới nay các nghiên cứu chủ yếu tập trung trên các đối tượng bệnh nhân có liên quan chất độc này Gần đây người ta thấy rằng quá trình sửa chữa chậm của đột biến này có thể do sự cản trở của HBx-protein của HBV Thông qua kháng nguyên HBX mà đột biến P53 tại vị trí 249 có thể gây UTG [50] Điều thú vị là sự xuất hiện của đột biến gene này tương đương nhau ở cả huyết tương và tổ chức sinh thiết gan trên bệnh nhân Nghiên cứu gần đây của Kirk DG và cs, (2005) cho thấy đột biến điểm 249ser trên gene P53 gặp ở 24,6% bệnh nhân UTG có HBsAg (+) so với chỉ 0,3% trên nhóm chứng; nguy cơ tiến triển UTG trên bệnh nhân nhiễm HBV là cao tương đương với nhiễm AFB1 với (OR: 10.0, 95% CI: 5.16–19.6 và OR: 13.2, 95% CI: 4.99–35.0); tuy nhiên khi kết hợp cả 2 yếu tố thì nguy cơ là rất cao với (OR: 399, 95% CI: 48.6–3270) [51] Vì vậy nghiên cứu xác định các đột biến xẩy ra trên gene mã hoá P53 ở bệnh nhân nhiễm HBV có thể sử dụng là một marker giúp chẩn đoán sớm tiền ung thư khi mới

có tổn thương ở mức phân tử là cơ sở cho chẩn đoán sớm UTTBGNP cũng như là một yếu tố dự báo và tiên lượng bệnh có ý nghĩa quan trọng trong áp dụng các biện pháp can thiệp sớm và nâng cao hiệu quả điều trị kéo dài thời gian sống của bệnh nhân

1.6.3 IFN receptor

Các nghiên cứu trước đây cho thấy có nhiều gene biến đổi liên quan đến mức độ cảm nhiễm virut Có nhiều các yếu tố của vật chủ đã được nghiên cứu nhằm giải thích cho sự khác biệt này như: Kháng nguyên bạch cầu người, phức hợp hoa hợp mô chủ yếu lớp I, II, tính đa hình của các gene mã hóa cytokine, MBL, cũng như thụ cảm thể vitamin A [52], [53], [54] Một phân tử

có vai trò quan trọng trong nhiễm HBV có thể là thụ cảm thể của α/β (IFNR) mRNA mã hóa cho thụ cảm thể này ở trong tế bào được cho là có vai trò quan trọng trong sinh bệnh học nhiễm virut viêm gan C và là một yếu

interferon-tố tiên lượng hiệu quả điều trị của IFN [55], [56] IFNRs được biểu hiện trên hầu hết các tế bào và tồn tại dưới dạng phức hợp nhiều protein với các kích thước từ 95, 115, và 135 kD [57] Trong số các chuỗi IFNαR1 thì Glyco-protein a135 kD đóng vai trò trung tâm trong quá trình hình thành dòng tín hiệu để IFNα/β liên kết với tế bào Gene mã hóa IFNαR1 nằm trên nhiễm sắc thể 21 tại vị trí 21q22.11, đây là vị trí đã được chứng minh là có liên quan đến bệnh sinh nhiễm HBV [58] Tại vị trí này cũng chứa gene mã hóa cho các thụ thể của các cytokine nhóm II: interferon-alpha receptor-2 (IFNAR2), interleukin-10 receptor-B (IL10RB) và interferon-gamma receptor-2 (IFNGR2) [59] Đột biến gene mã hóa cho các thụ thể này đã được chứng minh có liên quan đến các bệnh nhiễm trùng virut và các bệnh tự miễn Đối với một dạng đột biến gene của IFN R như IFNαR1 đã được nghiên cứu và cho thấy có liên quan đến hiệu quả điều trị IFN [60] Một điểm đột biến trên gene này đã được chứng minh có liên quan đến mức độ tổn thương gan, tăng ALT [61]

Gần đây có 2 điểm đột biến mới được tìm thấy trên gene IFNAR1 (G17470C

và Leu168Val) đã được chứng minh có liên quan đến bệnh sốt rét do Plasmodium falciparum tại Gambia [62] Một điểm đột biến SNP (rs1012335) nằm trên intron 3 của gene IFNAR1 do sự thay thế C bằng G tại vị trí 17470; điểm đột biến thứ 2 (rs2257167) nằm trên exon 4 và làm thay đổi acide amine Val (GTT) thành Leu (CTT) Trong bệnh sốt rét do P.falciparum đột biến này

tỏ ra có tác dụng bảo vệ cơ thể chủ Vì thế nên chúng tôi tiến hành khảo sát đột biến gene IFNAR1 trên các bệnh nhân nhiễm HBV để đánh giá vai trò của các đột biến này trong diễn biến bệnh

1.6.4 DNA lưu hành tự do

Cho đến nay việc chẩn đoán xác định UTG phải dựa vào kết quả sinh

xác rất cao Tuy nhiên, một khó khăn là bắt buộc phải tiến hành can thiệp sinh thiết Do đó, không phải cơ sở y tế nào cũng có thể thực hiện được và khi có những kết quả đó thì cơ hội điều trị là rất thấp

DNA lưu hành trong huyết tương là một dấu ấn quan trọng chứng tỏ sự

có mặt của tế bào trong máu Vì vậy, DNA lưu hành tự do (cfDNA) là một dấu ấn lý tưởng để chẩn đoán, theo dõi tiến triển bệnh [63] Các nghiên cứu trước đây cho thấy nồng độ cfDNA trong huyết thanh bệnh nhân UTG nhiễm virut viêm gan C (HCV) cao hơn có ý nghĩa so với bệnh nhân nhiễm HCV không có UTG [64] Nồng độ cfDNA cũng tăng song song với mức độ biệt hoá tế bào ung thư và có tương quan thuận với kích thước khối u, cũng như tương quan nghịch với tiên lượng HCC [65]

Gene glutathione S-transferase ð (pi) – GSTP1 là 1 gene đa hình thuộc nhóm DNA lưu hành tự do, nó được coi là một trong các dấu ấn phân tử có giá trị trong phát hiện sớm bệnh ung thư Trong các nghiên cứu gần đây, người ta thấy gene GSTP1 biểu hiện ở 80% tế bào ung thư gan, và thấp hơn trên các bệnh khác [66] Gene GSTP1 mã hoá cho enzyme Glutathione S-transferase (GSTs), enzyme này đóng vai trò rất quan trọng trong khử độc bằng cách xúc tác cho việc nối các hợp chất có ái điện tử và ưa nước, những chất này có tác động làm giảm glutathione Do đó, nồng độ gene GSTP1 lưu hành tự do trong huyết tương có thể trở nên một dấu ấn có giá trị giúp chẩn đoán và theo dõi kết quả điều trị UTG

1.6.5 Một số dấu ấn của HBV có giá trị trong chẩn đoán UTG

1.6.5.1.Kiểu gene HBV

Dựa trên sự khác biệt về hơn 8% toàn bộ bộ gene của HBV và 4% trên đoạn gene pre S người ta đã xác định được 10 kiểu gene của HBV (A-J) và hơn 20 dưới kiểu gene khác nữa Kết quả nghiên cứu cho thấy kiểu gene có

ảnh hưởng rõ rệt đến diễn biến tự nhiên của bệnh nhiễm HBV So với kiểu gene B thì kiểu gene C gây bệnh nặng hơn, tiến triển thành xơ gan, ung thư gan nhanh hơn, thời gian chuyển đổi huyết thanh HBeAg muộn hơn và không bền vững, mức độ viêm hoại tử gan nặng hơn [30]

1.6.5.2 HBV DNA

Dấu ấn HBV DNA tại thời điểm theo dõi đầu tiên được cho là một yếu

tố tiên lượng tốt nhất cho các bệnh nhân viêm gan B mạn tính ở người lớn Nồng độ HBV DNA càng cao thì tỷ lệ xuất hiện ung thư gan, xơ gan càng lớn sau nhiều năm theo dõi [hình 1.8]

Hình 1.8 Mối liên quan giữa nồng độ HBV DNA với UTG

Ghi chú: Sau 13 năm theo dõi thì tần suất xuất hiện ung thư gan tăng rõ rệt trên nhóm bệnh nhân có nồng độ HBV DNA cao, khoảng 14% sau nếu HBV DNA >10 6 copies/ml [67].

Nhận định này cũng đúng cho ngay cả khi theo dõi trên những người mang HBV mạn tính không triệu chứng, tức là men gan, chức năng gan hoàn toàn bình thường (hình 1.9) [33], [67]

Hình 1.9 Tần suất xuất hiện UTG trên người mang HBV mạn tính không triệu chứng [33]

Cụ thể, mặc dù men gan (AST, ALT) hoàn toàn bình thường nhưng nồng độ HBV DNA càng cao thì nguy cơ ung thư gan càng lớn Sau 12 năm theo dõi nếu HBV DNA >105 copies/ml thì tần suất xuất hiện ung thư là 15.3%, trong khi đó tần suất đó chỉ có 2.3% khi HBV DNA <105 copies/ml

1.6.5.3 Đột biến gene HBV đặc hiệu

Nhờ có sinh học phân tử mà ngày nay chúng ta có thể phát hiện được các đột biến gene một cách dễ dàng Kết quả nghiên cứu đó cho thấy các đột biến quan trọng trên bộ gene của HBV có ảnh hưởng rất lớn đến sự tiến triển ung thư gan (Hình 1.10) [68], [69] và xơ gan [67]

Ghi chú: Mối liên quan giữa đột biến vùng khởi động nhân với tần suất xuất hiện ung thư gan Kết quả cho thấy đột biến gene vùng khởi động nhân sẽ gây ung thư nhiều hơn có ý nghĩa so với không đột biến [69]

Hình 1.10 Mối liên quan giữa đột biến vùng khởi động nhân với UTG

Một nghiên cứu gần đây khi phân tích hồi cứu các số liệu của các công trình đã được công bố cho kết quả rất có giá trị Cụ thể, sau khi sử dụng các phương pháp thống kê chính xác người ta có thể đưa ra được các giá trị về độ nhạy và độ đặc hiệu để tiên lượng ung thư gan qua các đột biến gene Kết quả cho thấy nếu có đột biến gene tại điểm đôi A1762T/G1764A thì tiên lượng bệnh nhân sẽ ung thư gan rất cao với độ nhạy hơn 70% và độ đặc hiệu là hơn 60% Nếu kết hợp các đột biến gene A1762T/G1764A với các đột biến khác như C1653T và T1753V thì nguy cơ ung thư gần như là chắc chắn (độ đặc hiệu = 93.9%) [69]

1.7 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các dấu ấn phân tử trong chẩn đoán UTG tại Việt Nam

Có nhiều nghiên cứu về UTG hiện nay ở Việt Nam, tuy nhiên các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào tỷ lệ mắc, các phương pháp can thiệp điều trị, đặc biệt là các phương pháp điều trị ít xâm lấn đã mang lại những hiệu quả nhất định

Gần đây đánh giá giá trị chẩn đoán sớm UTG bằng siêu âm kết hợp siêu âm doppler màu chúng tôi thấy đây là một phương pháp chẩn đoán hình

đặc hiệu 82,4% tuy nhiên nếu so sánh với AFP> 500 ng/ml thì độ đặc hiệu thấp hơn AFP Gần đây Khiên VV và Cs đã sử dụng AFP-L3 (AFP ái lực với Lectin) trong chẩn đoán UTG cho kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu và tỷ lệ dự báo của test dương tính tương ứng là 96,9%, 92% và 95,5% Marker AFP-L3

có thể sử dụng để phân biệt và chẩn đoán sớm UTG ở những bệnh nhân viêm gan mạn tính có AFP huyết thanh tăng nhẹ [44] Tuy nhiên do khó khăn về mặt kỹ thuật và giá thành nên AFP-L3 chưa được áp dụng phổ biến trong chẩn đoán ở nước ta

Chìa khoá thành công của can thiệp điều trị UTG phụ thuộc rất nhiều vào thời gian phát hiện bệnh sớm hay muộn Trong khi các phương pháp chẩn đoán hiện nay thường chỉ phát hiện được ở giai đoạn muộn Mặc dù còn tương đối mới mẻ ở Việt Nam, các kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng ngày càng nhiều vào chẩn đoán và theo dõi điều trị các bệnh lý do vi sinh vật, tổn thương di truyền gây ra, đặc biệt là các bệnh lý do HBV, HCV, HIV Tuy nhiên trong lĩnh vực ung thư, chưa có nghiên cứu nào công bố áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại để chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh nhân UTG nói chung và nhiễm HBV nói riêng Đặc biệt là các nghiên cứu về đột biến gene và giá trị của chúng trong chẩn đoán và tiên lượng UTG

Gần đây trong một số công trình nghiên cứu của chúng tôi tiến hành ở Cộng hoà liên bang Đức về liên quan của đột biến gene (đột biến MBL, HBX, IFN-alfa 2 promoter) với các thể lâm sàng viêm gan virut B [54], [70], [71], cũng như tác động của kiểu gene của HBV và đồng nhiễm HBV/Parvovirut B19 trên quá trình bệnh lý gan [31], [72] Trong những nghiên cứu này bước đầu thu được một số kết quả nhất định như giải thích được phần nào mối liên quan của đột biến gene với bệnh cảnh lâm sàng bệnh lý gan cũng như bệnh sinh UTG Tuy nhiên, đây chỉ là những nghiên cứu liên quan trong bệnh sinh của bệnh lý gan do HBV mà chưa có các nghiên cứu ứng dụng khác Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại trong chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh nhân UTG nhiễm HBV đóng vai trò quan trọng và cần thiết góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và kéo dài thời gian sống của bệnh nhân

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Đối tượng

Tổng số có 190 bệnh nhân được chia thành 3 nhóm:

- Ung thư gan: 90 bệnh nhân và được chia thành 3 nhóm nhỏ: 30 bệnh nhân ung thư gan có kích thước khối u < 2cm; 30 bệnh nhân ung thư gan có kích thước khối u từ 2-5 cm; và 30 bệnh nhân có kích thước khối u > 5cm

- Viêm gan B mạn tính: 50 bệnh nhân

- Người mang HBV mạn tính không triệu chứng: 50 bệnh nhân

Để so sánh một số gene người chúng tôi lấy 100 người khỏe mạnh làm nhóm chứng

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân ung thư gan

- Lâm sàng: bệnh nhân mệt mỏi ăn uống kém, gầy sút cân nhanh Có thể có các triệu chứng khác như gan to dưới bờ sườn, bờ sắc mật độ chắc, có u cục lổn nhổn nổi trên bề mặt đau khi thăm khám

- Xét nghiệm: AFP tăng cao, Bilirubin trực tiếp và gián tiếp có thể tăng, AST, ALT hoặc phosphataza kiềm tăng Siêu âm phát hiện khối tăng âm khư trú hoặc lan tỏa Chụp CT hoặc MRI xác định vị trí kích thước khối u Sinh thiết gan xét nghiệm làm tế bào học hoặc/và mô bệnh học cho kết quả xác định có UTG và mức độ biệt hoá kèm theo Xét nghiệm huyết thanh có HBsAg (+)

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân viêm gan B mạn tính

- Bệnh nhân đã được xác định có HBsAg (+) sau thời gian > 6 tháng

- Các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng có biểu hiện tổn thương mô gan Hiện tại có biểu hiện lâm sàng viêm gan như mệt mỏi, chán ăn, gan to dưới bờ sườn mật độ chắc, có thể có vàng da HBc-Ab-IgG(+), men ALT có thể tăng

cao hơn 2 lần bình thường, Bilirubin máu và nước tiểu có thể bình thường hoặc tăng

- Sinh thiết gan làm mô bệnh học cho thấy hình ảnh viêm gan mạn tính

2.1.3 Tiêu chuẩn lựa chọn người mang HBV mạn tính không triệu chứng

- Tiền sử và hiện tại chưa bị viêm gan bao giờ

-Tình cờ phát hiện có HBsAg (+) qua các đợt khám sức khỏe định kỳ

- Hiện tại AST/ALT, Bilirubin trong giới hạn bình thường

2.1.4 Tiêu chuẩn loại trừ

- Những người có Anti HIV (+), Anti HCV (+), có tiền sử và bằng chứng nhiễm Aflatoxin

- Ung thư cơ quan khác di căn gan

- Các bệnh nhân có tiền sử và hiện tại điều trị các thuốc kháng virut hoặc Interferon

2.1.5 Địa điểm lấy mẫu

- Bệnh nhân viêm gan B mạn tính được thu thập tại Khoa Truyền nhiễm Bệnh viện TƯQĐ 108

- Bệnh nhân ung thư gan được thu thập tại Khoa Tiêu hóa, Bệnh viện TƯQĐ

108 và Khoa Tiêu hóa, Bệnh viện Bạch Mai

- Người mang HBV mạn tính không triệu chứng được theo dõi hồ sơ tại Khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện TƯQĐ 108

2.2 Phương pháp

Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp tiến cứu, mô tả, theo dõi dọc

2.2.1 Thu thập bệnh nhân và số liệu nghiên cứu

- Tất cả các bệnh nhân sau khi đảm bảo các tiêu chuẩn nghiên cứu được thu thập hồ sơ theo mẫu thống nhất

- Các thông số về huyết học, sinh hóa, miễn dịch, Xquang, siêu âm và sinh học phân tử được theo dõi đăng kí đầy đủ định kỳ sau mỗi 6 tháng

- Nhóm ung thư gan được sinh thiết gan 1 lần khi vào viện lần đầu Kỹ thuật được tiến hành tại Khoa Tiêu Hóa Mẫu bệnh phẩm được gửi lên Khoa Giải phẫu bệnh để tiến hành các xét nghiệm mô bệnh học và hóa mô miễn dịch

- Tất cả các bệnh nhân được lấy máu 2 lần (tại thời điểm khi đưa vào nghiên cứu và khi kết thúc nghiên cứu) để gửi về Khoa Sinh học phân tử Tại Khoa sinh học phân tử các xét nghiệm về gene, protein đã được tiến hành

Hình 2.1 Quy trình thu thập mẫu và phân chia xét nghiệm

Nhận xét: bệnh nhân được theo dõi các chỉ tiêu trong một mẫu thống nhất,

bên cạnh đó, ngay từ khi đưa vào nghiên cứu và cứ sau mỗi 6 tháng thì đều được lấy thêm các mẫu máu để lưu giữ tại Khoa sinh học phân tử Từ đó sẽ tách chiết DNA, RNA để chuyển tới các phòng xét nghiệm của Học viện quân

y, Đại học y Hà Nội, Viện Công nghệ sinh học

Hình 2.2 Các thời điểm thu thập bệnh phẩm

Chú thích: Tính đến tháng 12 năm 2008 chúng tôi thu thập được 150 bệnh

nhân lần 1, đến tháng 6/2009 chúng tôi thu thập thêm được 40 bệnh nhân nữa Tại thời điểm tháng 6 năm 2009 150 đầu tiên được theo dõi lần thứ 2 Đến tháng 12 năm 2009 150 bệnh nhân đầu tiên được theo dõi lần 3, 40 bệnh nhân theo dõi lần 2 Đến tháng 6 năm 2010 thì có 150 bệnh nhân được theo dõi lần

4 và 40 bệnh nhân được theo dõi lần 3 Hiện tại chúng tôi đang tiếp tục theo dõi những bệnh nhân này Như vậy, tính đến tháng 6 năm 2010 thì trong số

190 bệnh nhân theo dõi được 3 lần thì có 150 bệnh nhân được 4 lần theo định

kỳ 6 tháng Kí hiệu: AFP = alpha feto protein; HMMD = hóa mô miễn dịch; MBH = mô bệnh học; BN L1 5 = bệnh nhân được theo dõi lần 1 5

15 15

Phản ứng Real time sử dụng TaqMan Probe được thiết kế gồm: Một bộ

mồi đặc hiệu và một chuỗi oligonucleotide (Probe) có trình tự bổ sung với đoạn trình tự khuôn nằm giữa hai mồi

Mẫu dò oligonucleotide được thiết kế với đầu 5’ gắn chất phát tín hiệu huỳnh quang (Reporter) và đầu 3’ gắn một chất kìm hãm sự phát tín hiệu huỳnh quang phát ra từ Reporter được gọi chung là Quencher Mẫu dò này ở trạng thái nguyên vẹn (không bị phân hủy), ở trạng thái bình thường (không

bị kích hoạt) thì toàn bộ năng lượng phát ra từ Reporter được truyền sang Quencher khiến cho Reporter không phát được tín hiệu huỳnh quang mà chỉ

có Quencher phát được, nhưng máy chủ sẽ không nhận được tín hiệu vì hệ thống kính lọc không phù hợp với bước sòng phát ra từ Quencher

Khi phản ứng PCR diễn ra, mẫu dò sẽ bắt cặp bổ sung vào DNA khuôn

sau đó bị phân cắt bởi hoạt tính 5’exonucleaza của TaqDNA polymerase

trong quá trình tổng hợp chuỗi Chính nhờ sự phân cắt này làm cho Reporter được giải phóng khỏi Quencher để phát tín hiệu huỳnh quang, đồng thời loại

bỏ mẫu dò khỏi khuôn DNA cho phép kéo dài tiếp sản phẩm PCR Reporter

bị phân cắt khỏi khuôn DNA sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR có nghĩa là tín hiệu huỳnh quang thu được sẽ tỷ lệ với sự nhân lên của sản phân PCR (Hình 2.3)

Hình 2.3 Nguyên lý phản ứng định lượng Real-time PCR sử dụng mẫu dò TaqMan

Dựa vào nguyên lý trên chúng tôi đã thiết kế một cặp mồi trong vùng bảo tồn của gen S của HBV và mẫu dò oligonucleotide có đầu 5’(Reporter) mang hợp chất phát mầu FAM và đầu 3’(Quencher) mang hợp chất TAMRA

để định lượng nồng độ HBV DNA (bảng 2.1), phản ứng định lượng được chuẩn bị với thành phần như bảng 2.2

Bảng 2.1: Trình tự bộ mồi định lượng HBV DNA Real-time PCR

5´-3´

Phương pháp này cho phép định lượng chính xác nồng độ của HBV – DNA (số copies/ml) Đồng thời cho biết nồng độ của đoạn gene đích ngay trong từng thời điểm quan tâm (Hình 2.4).

Hình 2.4 Biểu diễn kết quả của xét nghiệm HBV DNA real time PCR

Giải thích: Hình trên cho biết đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của các mẫu đo và đường chuẩn để tính toán nồng độ HBV DNA Mỗi lần xét nghiệm chúng ta luôn phải chạy song song các mẫu chuẩn đã biết nồng độ để xây dựng đường chuẩn

2.2.4 Phương pháp xác định kiểu gene HBV

Cơ sở của việc sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP để xác định kiểu gen HBV

đó chính là sự khác biệt trong trình tự vùng mã hóa gen Core giữa các kiểu gen của HBV Với hầu hết các kiểu gen của HBV, chiều dài của bộ gen trung bình khoảng 3221bp, trong đó vùng mã hóa gen Core được định vị từ nt 1903 đến nt 2458 So sánh trình tự các nucleotide vùng này giữa các kiểu gen khác nhau của HBV chúng tôi nhận thấy:

- Có các vị trí nhận biết khác nhau của enzym giới hạn Tsp905I

- Kiểu gen G có sự chèn của 36 nt vào vị trí từ nt 1906 đến nt 1941 so

với bảy kiểu gen còn lại (A, B, C, D, E, F, H)

- Kiểu gen A có sự chèn thêm 6 nt vào vị trí từ nt 2360 đến nt 2365 so

với bảy kiểu gen còn lại (B, C, D, E, F, G, H)

Dựa trên những quan sát trên chúng tôi thiết kế các cặp mồi đặc hiệu có trình tự như bảng 4

Bảng 2.3: Trình tự các bộ mồi đặc hiệu cho vùng Core HBV

thước (nt)

T m ( 0 C)

HBcore-A R

TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTC

HBcore-noA

R

TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTC

5’-GTCGTCT-3’

31 64

Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi HBcore F/ HBcore-A,R (cặp mồi A) sẽ khuyếch đại vùng Core của kiểu gen A và cho sản phẩn có kích thước 520bp Phản ứng PCR với cặp mổi HBcore F/ HBcore-noA,R (cặp mồi noA) sẽ khuyếch đại vùng Core của các kiểu gen không phải là A (bảy kiểu gen còn lại) Sản phẩn PCR nếu có kích thước là 550bp, xác định HBV DNA khuôn thuộc kiểu gen G Nếu sản phẩm PCR có kích thước 514bp, xác đinh HBV DNA khuôn thuộc sáu kiểu gen còn lại (B, C, D, E, F, H), và để xác định HBV DNA khuôn đó thuộc kiểu gen nào trong số 6 kiểu gen còn lại đó cần

tiến hành phản ứng cắt RE Tsp509I

Cặp mồi HbPre-CoreF/ HBx-core R được xem như bộ mồi bổ trợ Đối với các mẫu có nồng độ HBV DNA thấp <105, khi nhân trực tiếp hai cặp mồi trên sẽ khó có khả năng phát hiện sản phẩm PCR trên bản gel điện di, do đó cần tiến hành chạy nested PCR bằng cặp mồi ngoài là HbPre-Core/ FHBx-core R Sản phẩn PCR của cặp mồi này có kích thước 742bp, sau đó sẽ được làm khuôn cho hai cặp mồi A và noA (hình 2.5)

Hình 2.5: Nguyên lý PCR lồng áp dụng cho đoạn trình tự Core

Phản ứng PCR

Các hóa chất cho phản ứng PCR đều do hãng Fermentas cung cấp HBV DNA sau khi được tách từ khối huyết thanh của bệnh nhân và có kết quả định lượng đạt yêu cầu sẽ được tiến hành khuyếch đại với các bộ mồi như trên bằng máy ABI 9700 (Mỹ)

Phản ứng PCR cặp mồi HBcore F/ A,R và HBcore F/ noA,R chạy cùng một chu trình nhiệt độ: