sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng cà định dạng của tập đoàn cây dó bầu ( aquilaria sp.) tại hà tĩnh

Theo các kết quả nghiên cứu thực nghiệm nhiều năm của Trung tâm nghiên cứu lâm đặc sản thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam, dó bầu là loài cây thích nghi tốt với khí hậu nhiệt đới nó

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

HOÀNG ĐĂNG HIẾU

SỬ DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG VÀ ĐỊNH DANH LOÀI CỦA TẬP

ĐOÀN CÂY DÓ BẦU(AQUILARIA SP.) TẠI HÀ TĨNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

HOÀNG ĐĂNG HIẾU

SỬ DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG VÀ ĐỊNH DANH LOÀI CỦA TẬP

ĐOÀN CÂY DÓ BẦU(AQUILARIA SP.) TẠI HÀ TĨNH

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS CHU HOÀNG HÀ

Hà Nội - 2012

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về cây dó bầu 2

1.1.1 Đặc điểm phân loại và vị trí phân bố của cây dó bầu 2

1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cây dó bầu 3

1.1.3 Giá trị kinh tế và sinh thái của cây dó bầu 5

1.1.4 Thực trạng trồng và khai thác cây dó bầu trong nước và trên thế giới 7

1.1.5 Các nhân tố ảnh hưởng tới khả năng tạo trầm nhân tạo 9

1.2 Một số phương pháp sử dụng trong việc định danh loài và xác định quan hệ di truyền 10

1.3 DNA barcode - quan điểm mới trong phân loại 12

1.3.1 Giới thiệu DNA barcode 12

1.3.2 Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode 13

1.4 Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở thực vật 14

1.4.1 Trình tự gen nhân 14

1.4.2 Vùng gen mã hóa ribosome 15

1.4.3 Trình tự gen luc lạp 15

1.4.4 Trình tự gen rbcL 17

1.4.5 Trình tự gen matK 17

1.4.6 Trình tự gen rpoB và rpoC1 17

1.4.7 Trình tự gen ycf5 18

1.4.8 Trình tự hai gen trnH - psbA 18

1.4.9 Trình tự hai gen trnL(UAA) - trnF(GAA) 19

1.5 Tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật 19

1.6 Một số kết quả trong nghiên cứu về cây dó bầu tại Việt Nam và trên thế giới 21 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

2.1.Vật liệu 22

2.1.1 Thực vật 22

2.1.2 Chủng vi khuẩn 23

2.1.3 Hóa chất 23

2.1.4 Máy móc thiết bị 23

2.1.5 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Các bước nghiên cứu 24

2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu 24

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số 33

3.2 Tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu của phản ứng PCR 34

3.3 Kết quả nhân bản gen với các cặp mồi nghiên cứu 36

3.3.1 Kết quả nhân bản gen rbcL 36

3.3.2 Kết quả nhân bản gen rpoB 36

3.3.3 Kết quả nhân bản gen psbA-trnH 37

3.3.4 Kết quả nhân bản gen ITS 38

3.4 Kết quả tách dòng gen 38

3.4.1 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel) 38

3.4.2 Kết quả chuyển gen vào vector tách dòng 39

3.4.3 Kết quả biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli 39

3.4.4 Kết quả chọn lọc dòng tế bào mang gen tái tổ hợp 40

3.4.5 Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp 41

3.4.6 Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp 42

3.5 Xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA chỉ thị 43

3.5.1 Kết quả xác định và phân tích trình tự gen trn-psbA 44

3.5.2 Kết quả xác định và phân tích trình tự gen rpoB 46

3.5.3 Kết quả xác định và phân tích trình tự vùng gen lục lạp rbcL 48

3.5.4 Kết quả xác định và phân tích trình tự gen ITS 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp 16

Bảng 2.1 Thông tin về các mẫu dó bầu dùng trong nghiên cứu 22

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi nhân bản gen barcode 24

Bảng 2.3 Thành phần dung dịch đệm rửa 25

Bảng 2.4 Thành phần dung dịch đệm tách 25

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 26

Bảng 2.6 Chu kỳ phản ứng PCR 26

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng ligase 28

Bảng 2.8 Thành phần môi trường chọn lọc tế bào vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp 29 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc 30

Bảng 2.10 Chu kỳ phản ứng PCR- clony 30

Bảng 2.11 Thành phần hóa chất tách plasmid 30

Bảng 2.12 Thành phần hóa chất dùng trong phản ứng cắt enzyme 31

Bảng 3.1 Nhiệt độ bắt mồi và kích thước gen của các cặp mồi nghiên cứu 34

Bảng 3.2 So sánh trình tự vùng trnH-psbA intergenic lục lạp 45

Bảng 3.3 So sánh trình tự vùng gen lục lạp rpoB 47

Bảng 3.4 So sánh trình tự vùng gen lục lạp rbcL 50

Bảng 3.5 Vị trí sai có thể khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng rbcL 51

Bảng 3.6 So sánh trình tự vùng gen ribosom ITS 54

Bảng 3.7 Các vị trí sai khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng ITS 55

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Lá cây dó bầu 2

Hình 1.2 Hoa và quả cây dó bầu 5

Hình 2.1 Sơ đồ vector pBT 27

Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số của một số mẫu dó bầu nghiên cứu 33

Hình 3.2 Kết quả chạy PCR - gradient của chỉ thị rpoB ở các ngƣỡng nhiệt độ từ 49oC tới 58oC 35

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen rbcLcủa các mẫu dó bầu nghiên cứu 36

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen rpoB của các mẫu dó bầu nghiên cứu 37

Hình 3.5.Kết quả điện di sản phẩm PCR gen psbA-trnH của các mẫu dó bầu nghiên cứu 37

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen ITS của các mẫu dó bầu nghiên cứu 38

Hình 3.7 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR gen rpoB 39

Hình 3.8 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 40

Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR - clony khuẩn lạc mồi rbcL 41

Hình 3.10 Kết quả điện di plasmid tách chiết 42

Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI mồi rbcL 43

Hình 3.12 Cây phân loại giữa trên kết quả mồi ITS 56

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

CBOL Consortium for the Barcode of Life

CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside

ITS-rDNA Internal Transcribed Spacer-rDNA

PCR Polymerase Chain Reaction

rDNA Ribosome deoxyribonucleic acid

RAPD Random Amplyfied Polymorphism DNA

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

SDS Sodium dodecyl sulphate

STS Sequence-Tagged Site

TAE Tris - Acetic acid - EDTA

Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase

TE Tris - Ethylenediaminetetraacetic acid

X-gal X - 5 - brom - 4 - chloro3 - indolyl - β - D - galactosidase

MỞ ĐẦU

Cây dó bầu (Aquilaria sp) là một trong những loài thực vật đặc hữu của nước

ta, phân bố rải rác từ Bắc tới Nam, tập trung nhiều ở các tỉnh miền Trung đặc biệt là

Hà Tĩnh và Quảng Nam Cây dó bầu mang lại giá trị kinh tế rất lớn với mục đích chủ yếu là khai thác trầm hương, một mặt hàng có giá trị kinh tế cao sử dụng trong công nghiệp mỹ phẩm, trong dược liệu, trong tôn giáo, chế tác đồ thủ công mỹ nghệ

Ở nước ta hiện đã phát hiện ra 6 loài dó bầu phân bố rải rác trong rừng rậm

nhiệt đới thường xanh, ẩm nguyên sinh: A crassna (Dó bầu, Dó tía, Dó trắng),

A baillonii (Dó Gạch), A rugosa (Dó Quả Nhăn), A malaccensis (Dó Mã Lai),

A sinensis (Dó Trung Quốc), A banaensis (Dó Bà Nà) Trong đó A crassna là loài

được trồng phổ biến nhất do có khả năng tạo ra loại trầm Kỳtốt nhất thế giới Tuy nhiên, hiện nay các loài dó bầu ở Việt Nam bị lai tạp rất nhiều, công tác lựa chọn giống đưa vào trồng dựa chủ yếu vào quan sát hình thái, theo kinh nghiệm của mỗi

cá nhân, dẫn đến năng suất và chất lượng trầm thu được không ổn định Do vậy, việc chọn lọc giống cây ban đầu để đưa vào triển khai là hết sức quan trọng và là nhiệm vụ cấp thiết trong công tác bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen quý

Hiện nay phương pháp DNA barcode là một trong những công cụ phục vụ định danh loài chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng DNA chuẩn hay còn gọi là chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode) Việc xác định loài bằng DNA chỉ thị có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài thực vật [16] trong đó có dó bầu ở Việt Nam [18] khi những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để định danh hoặc phân biệt loài

Xuất phát từ những yêu cầu đặt ra như vậy chúng tôi quyết định thực hiện đề

tài “Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định

danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh.”

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về cây dó bầu

1.1.1 Đặc điểm phân loại và vị trí phân bố của cây dó bầu

Cây dó bầu (Aquilaria sp.) là một trong những loài thực vật có giá trị kinh tế

cao Ở Việt Nam, cây dó bầu phân bố rải rác từ Bắc tới Nam, có nhiều ở các tỉnh miền Trung Cây dó bầu có rất nhiều tên gọi tùy theo mỗi địa phương như: cây Trầm Hương, Dó Trầm, Dó Bầu Hương, cây Tóc [43]

Cây dó bầu thuộc chi trầm Aquilaria, họ Thymeleaceae, bộ Thymelaeales,

lớp cây gỗ lớn Magnoliopsida, ngành Mộc Lan Magnoliophyta [41], [42]

Hình 1.1 Lá cây dó bầu

Chi Trầm Aquilaria gồm 24 loài khác nhau, tuy nhiên chỉ có 15 loài có khả năng cho trầm hương gồm: Aquilaria crassna; A baillonii; A sinensis hoặc

A chinesis; A borneensis; A Malaccensi; A gollocha; A hirta; A rostrata;

A beccariana; A cummingiana; A filaria; A khasiana; A microcarpa;

A grandiflora; A bancana; A Rugosa Trong đó loài A rugosa mới đây được

TS Lê Công Kiệt và TS Paul Kessler người Hà Lan phát hiện năm 2005 [18]

Trên thế giới, chi trầm phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á và miền Nam Trung Quốc Ở nước ta, dó bầu phân bố rải rác trong rừng rậm nhiệt đới thường xanh, rừng ẩm nguyên sinh thuộc các tỉnh Tuyên Quang,

Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, đặc biệt là từ Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quãng Ngãi, Bình Định, Ninh Thuận, Bình Thuận đến Tây Nguyên, An Giang, Kiên Giang và đảo Phú Quốc [42]

Trong số các loài có khả năng tạo trầm thì Aquilaria crassna là loài cây nổi

tiếng có khả năng tạo ra loại trầm kỳ tốt nhất thế giới [5]

1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng của cây dó bầu

Dó bầu là một loại cây gỗ thường xanh, cao 20 - 30 m, đường kính thân đạt

60 - 80 cm, thân thường thẳng, đôi khi có rãnh dạng lòng máng, vỏ ngoài nhẵn, màu nâu xám, thịt vỏ màu trắng có nhiều chất xơ (cellulose), nứt dọc lăn tăn, dễ bóc và tước ngược từ gốc lên, cành mảnh, cong queo, màu nâu nhạt, có lông hoặc nhẵn, tán thưa Lá đơn, mọc cách (so le), cuống lá dài 4 - 6 mm, phiến lá hình trứng, bầu dục thuôn đến mác thuôn, kích thước 8 - 15 x 2,5 - 9 cm, mặt trên màu lục bóng, mặt dưới nhạt hơn và có lông mịn, gốc lá thon nhọn dần hay tù; chóp lá nhọn, thuôn nhọn, tận cùng có mũi, gân bên 15 - 18 đôi, thay đổi thất thường, khá rõ ở mặt dưới Cụm hoa hình tán hoặc chùm tán, mọc ở nách lá hoặc ở đầu cành, cuống cụm hoa mảnh, dài 2 - 3 cm Hoa nhỏ, mẫu 5, đài hợp ở phần dưới, hình chuông, màu vàng lục, trắng nhạt hoặc vàng xám, phía ngoài có lông thưa; mặt trong gần như nhẵn, có

10 đường gân rõ, tồn tại ở quả, 5 thùy dài hình trứng thuôn, dài 12 - 15 mm Phần phụ dạng cánh hoa, gốc bầu có tuyến mật Quả nang gần hình trứng ngược hoặc hình quả lê, dài 4 cm, đường kính 2,5 - 3 cm, có lông mềm, ngắn, có mang dài tồn tại, khi khô nứt làm 2 mảnh, thường mỗi quả chỉ có một hạt Mùa hoa vào tháng 7 -

8, quả chín vào tháng 9 - 10 [3], [43]

Dó bầu sinh trưởng rải rác trong rừng thường xanh ẩm nhiệt đới, nguyên sinh hoặc thứ sinh, trên sườn núi hoặc trên đất bằng ở độ cao 50 - 1.000 m có khi lên tới 1.200 m so với mặt biển Ở nước ta, dó bầu thường phân bố rải rác trên sườn núi có

độ dốc nhỏ, thoát nước Trong quần xã của dó bầu thường gặp các cây gỗ lớn: Táu, Huỳnh , Gụ mật … Đôi khi cũng gặp cây dó bầu mọc trong rừng thứ sinh cùng các

loài Thánh thất, Mò lưng bạc, Bưởi bung, Mít nài và Ràng ràng

Dó bầu (A crassna) ưa đất feralit điển hình, feralit trên núi phong hóa từ đá

kết, đá phiến hay đá granit Lớp đất mặt trung bình hay mỏng, hơi ẩm, chua hoặc gần trung tính (pH vào khoảng từ 4 - 6)

Tại Malaysia và vùng Đông Bắc Ấn Độ, dó bầu (A malaccensis) phân bố

khá rải rác, độ gặp khoảng 2,5 cá thể trên một hecta Ở Đông Bắc Ấn Độ, loài dó bầu này thường mọc rải rác ở độ cao từ 200 - 700 m, đôi khi lên tới 1.000 m Dó bầu sinh trưởng trong các khu vực có lượng mưa hàng năm thay đổi từ 1.500 - 6.500 mm, nhiệt độ trung bình tối đa năm 22 - 28oC Những kết quả quan sát ở vùng Đông Bắc Ấn Độ còn cho biết, loài này phân bố chủ yếu trong rừng ẩm thường xanh hoặc rừng thường xanh, rất ít gặp trong rừng nửa rụng lá Tuy nhiên, trong thực tế, cây dó bầu trước và sau khi tái tạo trầm vẫn sinh trưởng tốt ở những nơi có

độ cao trên dưới 40 m so với mực nước biển A malaccensis thích ứng với các loại

đất phong hóa trên nham thạch, trên các loại đá biến tính, nhưng cũng sinh trưởng tốt trên đất phong hóa từ sa thạch [42]

Tại Malaysia, từ lâu đã đưa cây dó bầu vào trồng trọt, những quần thể rừng

trầm A malaccensis 67 năm tuổi đã có chiều cao trung bình 27 m, và đường kính

thân trung bình 38 cm Những cây dó bầu có độ trưởng thành 80 năm tuổi tại miền Đông Bắc Ấn Độ, có chiều cao cây 25 - 30 m, thân to nhất có đường kính 55 - 70

cm Ở miền Tây Bắc Ấn Độ (Arunachal Pradesh), các quần thể trầm 8 năm tuổi đã

có chiều cao gần 5 m, và đường kính thân gần 30 cm Cũng ở Tây Bắc Ấn Độ, chúng thường bắt đầu ra hoa, kết quả ở thời kỳ đạt 7 - 9 năm tuổi Những cá thể có kích thước trung bình cho năng suất hạt tốt, mỗi cây có thể cho tới 1,5 kg hạt [42]

Các khối trầm thường được tạo thành trong thân cây hoặc trong những cành lớn, chúng là kết quả của cả một quá trình chuyển hoá các hoạt động bệnh lý ở những nơi bị bệnh, bị thương… Nấm là một thành phần có tác dụng trong các hoạt động đó, ngoài ra các côn trùng đục thân cây cũng có thể có mối liên hệ nào đó Có giả thuyết cho rằng, trước tiên cây bị nấm gây bệnh tại những chỗ bị thương làm cho cây bị suy yếu, tiếp đó nấm thâm nhập vào cây và tạo thành các khối trầm Nhựa trầm là sản phẩm từ cây hay do nấm tạo ra? Lý giải diễn biến của quá trình

chuyển hóa để tạo thành các hợp chất hóa học trong nhựa trầm thế nào vẫn còn là vấn đề nan giải và vẫn chưa hiểu biết tường tận [1]

Đến nay đã xác định được nấm Cytosphaera mangiferae có ở trầm của loài

A Malaccensis và nấm Melanotus flavolives chứa trong khối trầm từ loài

A sinensis [42]

Hình 1.2 Hoa và quả cây dó bầu

1.1.3 Giá trị kinh tế và sinh thái của cây dó bầu

Giá trị kinh tế quan trọng nhất của cây dó bầu là để khai thác trầm hương Từ thời xa xưa trầm hương đã được coi là sản vật hết sức quí hiếm, ngày nay trầm hương vẫn là lâm sản ngoài gỗ có giá trị thương mại quốc tế lớn Trên thế giới trầm hương được sử dụng để chưng cất tinh dầu trầm, một chất định hướng quan trọng trong ngành công nghiệp để sản xuất các loại mỹ phẩm cao cấp Tinh dầu trầm có giá trị đặc biệt, được dùng trong công nghệ chế biến các loại chất thơm, các loại nước hoa cao cấp, giá trị Trầm hương là sản phẩm văn hóa vật chất tín ngưỡng tâm linh của dân tộc Việt Nam đã tồn tại từ xa xưa đến thời nay [9]

Theo CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora - Công ước về buôn bán quốc tế những loài động thực vật hoang dã nguy cấp) khối lượng mua bán trầm hương trên thị trường thế giới thời kỳ

1995 - 1997 khoảng 1.350 tấn Giá mua bán trầm hương được tính theo kg tùy thuộc vào chất lượng Giá bán trầm tại thị trường Dubai (Arabia Saudi) vào năm

1993 giao động từ 27 đô la Mỹ/kg (loại thấp nhất) đến 10.000 đô la Mỹ/kg (loại tốt

nhất) [11] Theo ước tính của Liên hiệp Khoa học sản xuất tinh dầu - hương liệu -

mỹ phẩm Việt Nam thì trong những năm từ 1980 đến 1990, khối lượng trầm hương các loại đã bị khai thác và xuất khẩu từ nước ta khoảng 300 tấn Trong đó có 2.000

kg trầm từ loại 1 - 4 trị giá khoảng 1,5 triệu USD và 300.000 kg Trầm loại 5 - 9 trị giá khoảng 4,5 triệu USD; đặc biệt là 200 g kỳ nam loại 1 - 3 trị giá 0,5 triệu USD

và tới 2.800 kg kỳ nam loại 4 - 8 trị giá 2,52 triệu USD Với giá trị kinh tế cao, trầm hương đã đem đến những hứa hẹn triển vọng cho ngành sản xuất lâm nghiệp khi 1

ha trồng cây dó bầu, tạo trầm hương có thể làm ra giá trị 1,5 - 1,8 tỷ đồng/ 10 năm, bình quân giá trị tạo ra 150 - 180 triệu/ ha/năm, trong đó lợi nhuận từ 50 - 60 % [11]

Ngoài ra trong y học, trầm hương còn được sử dụng để chữa một số bệnh hiểm nghèo Theo Đông y, trầm hương là vị thuốc quý hiếm, có vị cay, tính ôn, vào

3 kinh: tì, vị, thận; có tác dụng dáng khí, nạp thận, bình can, tráng nguyên dương, chữa các bệnh đau bụng, đau ngực, nôn mửa, hen suyễn, lợi tiểu, giảm đau, trấn tĩnh, hạ sốt, cấm khẩu, thổ huyết, khó thở, kích dục… Theo tây y, trầm hương có tác

dụng kháng khuẩn, đặc biệt là với các loại khuẩn Mycobacterium tuberculosis và Shigella flexneri, có tính khánh sinh, tạo kháng thể mạnh (diệt khuẩn, làm lành vết

thương), có tác dụng chữa một số bệnh như bệnh về tim mạch (suy tim, đau ngực), bệnh về hô hấp (hen suyễn), bệnh về thần kinh (an thần, mất ngủ, giảm đau, trấn tĩnh….), bệnh về tiêu hoá (đau bụng, buồn nôn, tiêu chảy), bệnh về tiết niệu (bí tiểu tiện) Đặc biệt, có thể dùng trầm hương để chữa ung thư tuyến giáp [42]

Cũng giống như một số cây lâm nghiệp khác, dó bầu là một trong những cây lâm nghiệp cung cấp nguyên liệu làm giấy có chất lượng cao Theo các kết quả nghiên cứu thực nghiệm nhiều năm của Trung tâm nghiên cứu lâm đặc sản thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam, dó bầu là loài cây thích nghi tốt với khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều và cho năng suất khai thác khá cao, được ngành công nghiệp giấy xác định là một trong những nguồn nguyên liệu chính trong các dự án đầu tư phát triển sản xuất của ngành từ nay đến năm 2010 [6]

Bên cạnh đó đối với môi trường sinh thái và phát triển bền vững thì việc đưa

dó bầu vào cơ cấu cây rừng với mục tiêu 5 triệu hecta rừng tại tỉnh Hà Tĩnh nói riêng và trong cả nước nói chung đã góp phần thúc đẩy tăng độ che phủ của rừng, chống xói mòn đất và bảo vệ môi trường Đồng thời góp phần bảo tồn và phát triển loài cây đặc hữu, qúy hiếm, có giá trị về khoa học và kinh tế của nước ta Đây còn

là giải pháp phù hợp với quy luật sản xuất đi đôi với bảo vệ môi trường, kết hợp lợi ích trước mắt với lợi ích lâu dài, làm giàu trên cơ sở khai thác và tái tạo lợi thế đặc hữu, ưu việt của tài nguyên quốc gia Hơn nữa, cây dó bầu còn có ý nghĩa tạo công

ăn việc làm cho người lao động, mở ra hướng phát triển kinh tế bền vững cho nông thôn, vùng sâu vùng xa [5]

1.1.4 Thực trạng trồng và khai thác cây dó bầu trong nước và trên thế giới

Với giá trị kinh tế cao và nhu cầu ngày càng tăng nên trên thế giới nói chung

và Việt Nam nói riêng, trầm hương tự nhiên bị khai thác đến cạn kiệt [13] Năm

1994, cây dó bầu được ghi trong công ước quốc tế CITES quy định về việc buôn bán các sinh vật có nguy cơ tuyệt chủng [31]

- Trong nước

Theo thống kê của ngành thương mại, nước ta từ năm 1986 - 1990 đã khai thác và xuất khẩu khoảng 1.163,9 tấn trầm hương Nhưng cũng giống như các nước trên thế giới, số lượng này ngày càng giảm sút, năm 1985 khai thác và xuất khẩu 216,1 tấn đến năm 1990 chỉ còn 73,4 tấn

Do có giá trị kinh tế cao và những thành công ban đầu trong các nghiên cứu tạo trầm trên cây dó bầu mà hiện nay, các dự án trồng cây dó bầu đã và đang thu hút

sự quan tâm của các địa phương trên cả nước Việc nhân giống cây dó bầu và sản xuất trầm bền vững là một vấn đề cần thiết về mặt kinh tế và xã hội nhằm đem lại nguồn lợi lớn từ trầm hương đồng thời góp phần bảo vệ môi trường và ngăn ngừa tình trạng khai thác cây dó bầu trong tự nhiên Quyết định 16/2005/QĐ-BNN ngày 15/03/2005 của Bộ NN-PTNT đã cho phép 6 trên 9 vùng sinh thái cả nước được trồng rừng sản xuất bằng cây dó bầu Kết quả trong vòng 3 - 4 năm gần đây diện tích cây dó bầu tăng nhanh góp phần đa dạng hóa loại cây trồng rừng và cây đặc sản, hứa hẹn nhiều triển vọng lớn cho nền lâm nghiệp nói riêng và nền kinh tế nói

chung [44]

Theo thống kê của Hiệp hội trầm hương, năm 2002, diện tích trồng cây dó bầu ở các tỉnh phía Nam là 2.340 ha đến năm 2004 đã lên đến 5.527 ha, số liệu này chủ yếu do tư nhân trồng cung cấp [7] Số liệu thống kê của hiệp hội trầm hương cho thấy chỉ qua 2 năm diện tích trồng cây dó bầu ở các tỉnh phía Nam đã tăng thêm 70%, đến năm 2007 đã có trên 22 tỉnh, thành trồng cây dó bầu với diện tích khoảng 15.000 - 18.000 ha, phân bố trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam [4]

Tuy nhiên, do diện tích trồng cây dó bầu ngày càng tăng, trong khi đó nguồn cung cấp hạt giống chủ yếu là những cây dó bố mẹ còn lại trong rừng tự nhiên và từ một số cây trồng vào thập niên 80, 90 của thế kỷ XX dễ dẫn đến thoái hóa giống Ngoài ra, phần lớn các cơ sở sản xuất giống cây là của tư nhân, hạt giống thu hái từ những cây chưa tuyển chọn đầu dòng hoặc cây chưa thành thục sinh dục, kỹ thuật gieo ươm hạn chế, làm cho chất lượng giống cây còn những điều đáng lo ngại Hơn nữa, hiện nay, các loài dó bầu ở Việt Nam bị lai tạp rất nhiều, công tác lựa chọn giống đưa vào trồng dựa chủ yếu vào quan sát hình thái, theo kinh nghiệm của mỗi

cá nhân dẫn đến năng suất và chất lượng trầm thu được không ổn định

- Trên thế giới

Tại Malaysia và vùng Đông Bắc Ấn Độ, dó bầu (Aquilaria crassna) phân bố

khá rải rác, độ gặp khoảng 2,5 cá thể trên một hecta Thái Lan được biết đến là quốc gia trồng và khai thác trầm hương nổi tiếng Ở miền đông Thái Lan phát hiện thấy

loài A subintegra, theo số liệu cho biết loài này rất phổ biến ở tỉnh Trad Trước đây,

do người nông dân không biết khai thác trầm từ loài này nên đã đem một số loài từ

nơi khác về trồng như loài A crassna Vì vậy, hiện nay loài A subintegra đã bị lai

tạp rất nhiều Tính đến năm 2003, loài cây này được trồng rất nhiều ở tỉnh Trad và

đã trở thành nơi cung cấp tinh dầu trầm có chất lượng tốt nhất thế giới Đồng thời

các nhà khoa học đã tìm thấy nhiều loài có khả năng tạo trầm thuộc chi Aquilaria

đều có nguồn gốc từ các miền Đông-Bắc-Nam của Thái Lan [15]

Có thể thấy, nhu cầu trầm hương trên thế giới ngày càng cao và trầm hương mua bán trên thị trường hầu hết là khai thác từ thiên nhiên Nhưng một thực tế cho

thấy việc khác thác trầm hương vào những thập niên cuối thế kỷ XX có tính chất huỷ diệt cây dó bầu, làm cho nguồn cung cấp trầm hương trên thị trường ngày càng cạn kiệt Năm 1993, Indonesia khai thác và xuất khẩu hơn 661 tấn đến năm 1997 con số ấy chỉ còn 302 tấn; tương tự như Indonesia, Malaysia từ 43,6 tấn còn 21,6 tấn; Campuchia năm 1995 khai thác và xuất khẩu 133,8 tấn sau 3 năm chỉ còn 13,2 tấn; Ấn Độ năm 1995 xuất khẩu 15,1 tấn đến năm 1997 còn 1,4 tấn Những số liệu này cho thấy một thực tế khối lượng trầm hương mua bán trên thị trường đang giảm sút nghiêm trọng do cây dó bầu từ thiên nhiên bị khai thác nặng nề Yêu cầu cấp thiết đặt ra cho các quốc gia phải có biện pháp cũng như kế hoạch trồng và nghiên cứu tạo trầm trên cây dó bầu đảm bảo nhu cầu lớn của thị trường thế giới [5]

1.1.5 Các nhân tố ảnh hưởng tới khả năng tạo trầm nhân tạo

Sự tạo trầm trong tự nhiên của cây dó bầu là sự biến đổi của các phần tử gỗ

do tác động bệnh lý bởi vết nứt gãy, sự xâm nhập của các loài nấm…xảy ra một cách tự nhiên năm này sang năm khác Khi bị nhiễm bệnh ở một vùng nào đó, cây

sẽ tích tụ nhựa đến đây để tự băng bó vết thương, xem như một khả năng tự đề kháng để chống lại bệnh nên tạo ra trầm kỳ Căn cứ vào sự hóa nhựa nhiều hay ít

mà có những sản phẩm như: Tóc, Trầm hương và Kỳ nam Để sản xuất trầm hương nhân tạo thách thức lớn nhất là công nghệ tạo trầm, chất lượng cây giống, các chỉ tiêu về lâm sinh đối với cây dó trồng, sự tương thích giữa các cây trồng xen, bệnh của cây [43]

Trong đó, dựa trên cơ chế hình thành trầm trong tự nhiên, hiện nay về cơ bản

có 3 kỹ thuật cấy tạo trầm nhân tạo được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu: Phương pháp vật lý (gây vết thương cơ giới); Phương pháp hóa học (xúc tác hóa chất); Phương pháp sinh học (xử lý với men vi sinh) Một số cách tạo trầm khác như kết hợp một số phương pháp trên với nhau

Nhìn chung mỗi phương pháp tạo trầm hương cho kết quả không giống nhau

về số lượng, chất lượng, thời gian và chi phí, nhưng có thể khẳng định con người đã tạo được trầm hương trên cây dó bầu là rõ ràng Ngoài ra, các nghiên cứu tạo các

chromone invitro (thành phần chính trong tinh dầu trầm) từ nuôi cấy huyền phù tế

bào của dó bầu đã bước đầu có kết quả [23], [20]

Bên cạnh các nghiên cứu về các kỹ thuật cấy tạo trầm nhân tạo, một hướng nghiên cứu cũng rất quan trọng nhưng còn bị bỏ ngỏ đó là các nghiên cứu ở mức độ sinh học phân tử quần thể dó bầu để xác định nhóm các cá thể hay giống dó bầu có khả năng tạo trầm hiệu quả, vì ngay trong tự nhiên không phải bất kỳ thân cây dó bầu nào cũng có trầm và khả năng tạo trầm, chất lượng trầm ở các loài khác nhau cũng là rất khác nhau Hơn nữa, việc đầu tư trồng cây dó bầu đến khi thu hoạch là khá lâu, đòi hỏi thời gian khoảng 7-10 năm (sau 5-7 năm mới có thể cấy tạo trầm nhân tạo, và sau 2-3 năm mới có thể hạ cây để thu trầm) Trong hội nghị về cây trầm hương ngày 24/9/2004 tại thành phố Hồ Chí Minh, các chủ trại trầm cũng đưa

ra những băn khoăn về công tác lựa chọn giống để có được trầm chất lượng cao, do chất lượng trầm tạo được thật sự chỉ tạo trầm loại 4, loại 5 ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả kinh tế [5]

1.2 Một số phương pháp sử dụng trong việc định danh loài và xác định quan

hệ di truyền

Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác định loài ở động, thực vật và hầu hết các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc như những loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống nhau, càng gần nhau thì tính chất giống nhau càng nhiều Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học Đối với thực vật, đặc điểm hình thái học của các loài thực vật qua nhận biết hình thái lá, hoa, quả, cách thức phân cành…có ưu điểm dễ quan sát trực tiếp bằng trực quan nhưng chỉ dựa vào thống kê phân tích một hoặc nhiều tính trạng được thể hiện ra bên ngoài nên hiệu quả thấp Điều này thật sự gặp nhiều khó khăn khi các mẫu vật cần giám định không còn nguyên vẹn, mất hình thái bên ngoài Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh nghiệm dân gian sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại

Các phương pháp phân loại học phân tử và xác định loài là hướng nghiên cứu được phát triển mạnh trên thế giới hiện nay, được xây dựng dựa trên việc nhận

biết thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu của các taxon sinh vật Hiện nay, các kỹ thuật dựa trên phân tích DNA là phương pháp có hiệu quả cao trong việc định loại và giám định loài

Phân loại học phân tử có thể dựa trên sự nghiên cứu các gen trong hệ gen nhân, hệ gen của các bào quan như ti thể, lục lạp hoặc các sản phẩm của gen như protein, enzyme Mỗi loại gen, sản phẩm của gen lại phù hợp với từng đối tượng và mục đích nghiên cứu khác nhau Do đó, việc lựa chọn gen nào, loại protein nào có ý nghĩa lớn đối với sự thành công của mỗi hướng nghiên cứu Các kỹ thuật thường được sử dụng bao gồm: kỹ thuật isozym (đồng enzyme), các kỹ thuật phân tích so sánh trình tự nucleotide các đoạn DNA như phương pháp đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), các kỹ thuật trên cơ sở phản ứng PCR như SSR (Simple Sequence Repeats), đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên - RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA) [17], [24], đa hình chiều dài các đoạn DNA nhân bản - AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), phân tích trình tự DNA … [7], [8] đã giúp giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và tiến hoá của nhiều loài động, thực vật và vi sinh vật Thêm vào đó các

kỹ thuật này cũng được sử dụng như những chỉ thị phân tử để xác định những gen kiểm soát hoặc có liên quan đến tính trạng nào đó của các cá thể, loài hay các nhóm loài

Gần đây, việc sử dụng các DNA mã vạch (DNA barcode) để định danh loài đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những đóng góp đáng kể trong việc phân loại loài Để nhận dạng gen hay đánh giá mức độ tiến hoá loài thì các nhóm gen chính thường được sử dụng là gen ribosome rRNA, gen

ty thể, và gen lục lạp (thực vật) trong đó gen rRNA 18S, 5S và 16S hay được dùng

để đánh giá mối quan hệ tiến hoá giữa các sinh vật So với chỉ thị hình thái và chỉ thị hoá học, chỉ thị DNA cho độ chính xác cao hơn mà không lệ thuộc vào bất cứ yếu tố khách quan nào

1.3 DNA barcode - quan điểm mới trong phân loại

1.3.1 Giới thiệu DNA barcode

Kỹ thuật DNA barcode (DNA mã vạch) là một tên mới cho một khái niệm

cũ Thuật ngữ “ DNA mã vạch ” lần đầu tiên được sử dụng vào năm 1993 (Arnon, 1993), trong một bài báo mà không nhận được sự chú ý nhiều từ cộng đồng khoa học, và gần đây thuật ngữ này được sử dụng lại trong nhiều nghiên cứu Về cơ bản,

kỹ thuật này dựa vào việc sử dụng một khu vực DNA (400-800 bp) như là một tiêu chuẩn để nhận dạng các loài một cách nhanh chóng và chính xác Kỹ thuật DNA mã vạch giúp các nhà phân loại học trong công tác phân loại và xác định loài, Nâng cao năng lực kiểm soát, hiểu biết và tận dụng sự đa dạng sinh học Ngoài ra, kỹ thuật này có triển vọng nghiên cứu và ứng dụng trong khoa học cuộc sống, trong khoa học pháp y, y tế, nghiên cứu y dược, sản xuất và kiểm soát chất lượng thực phẩm Phương pháp này vô cùng có ý nghĩa trong các trường hợp các mẫu vật sinh học cần giám định loài đã được qua xử lý, chế biến như các dạng chế phẩm thuốc hay thực phẩm đã qua chế biến…

Trên thực tế, DNA barcode bắt đầu có tầm ảnh hưởng từ nghiên cứu của Hebert và cs (2002), kết quả của nhóm nghiên cứu chỉ ra rằng các cá thể từ bộ sưu tập của 200 loài có quan hệ gần gũi với nhau thuộc bộ cánh vảy có thể xác định với

độ chính xác 100% bằng cách sử dụng gen ty thể cytochrome c oxidase tiểu đơn vị

I (COI) [36] Sau đó nhiều nghiên cứu về định danh loài bằng chỉ thị DNA đã thành công trên động vật như chim, cá, ốc tiền, nhện và một số loài côn trùng thuộc bộ Cánh cứng Gần đây, hệ thống chỉ thị DNA đang được thiết lập cho các nhóm sinh vật khác như thực vật, tảo, nấm, sinh vật nguyên sinh và vi khuẩn đã thu được hiệu quả đáng kể

Để thúc đẩy việc sử dụng DNA barcode cho tất cả sinh vật nhân chuẩn sống trên hành tinh này, CBOL (Consortium for the Barcode of Life ) đã được thành lập vào tháng 5 năm 2004, gồm hơn 120 tổ chức từ 45 quốc gia Với mục tiêu ban đầu

là xây dựng một thư viện trực tuyến trình tự barcode cho tất cả các loài chưa được biết đến, có thể làm tiêu chuẩn phân loại cho bất kỳ mẫu DNA nào Với sự hỗ trợ

của CBOL, DNA barcode ngày càng phát triển và trở thành một phương pháp phân loại và định danh loài mới

Trong bối cảnh của nền kinh tế phát triển nhanh và hậu quả tác động đến động vật, thực vật của các quốc gia khác nhau, sự xác định loài sử dụng phương pháp nhanh là cần thiết để đánh giá đa dạng sinh học của các khu vực này nhằm bảo

vệ các loài đặc hữu quý hiếm và nguy cấp Tuy nhiên cần lưu ý rằng DNA barcode không thể thay thế phân loại nhưng nó là công cụ hữu ích để tạo ra thông tin về đơn

vị phân loại chưa biết Hiện nay, trên thế giới, kỹ thuật này đang được sử dụng chủ yếu bởi các nhà phân loại học và nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực khác như khảo

cổ học, công nghiệp sinh học và chế biến thực phẩm…

1.3.2 Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode

Đặc điểm quan trọng nhất của DNA barcode là phải phổ biến và đặc hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng Điều này có nghĩa là các đoạn gen được sử dụng như một barcode nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có sự biến đổi giữa các loài nhưng ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi không đáng kể

Do đó, DNA barcode lý tưởng là một đoạn DNA có trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp được với cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để dễ dàng khuếch đại bằng PCR

Với động vật, hệ gen ty thể với các đặc tính di truyền theo dòng mẹ, tốc độ đột biến cao chủ yếu là các đột biến thay thế trong vùng mã hoá, vùng điều khiển và không tái tổ hợp được coi là một công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu tìm ra nguồn gốc các loài Thêm vào đó, DNA ty thể có số lượng bản sao lớn trong tế bào và bền vững trong thời gian rất dài, hàng nghìn năm trong khi đó DNA nhân chỉ có một bản sao và nhanh chóng bị phân huỷ ra ngoài môi trường Do vậy phần lớn các nghiên cứu sử dụng một vùng DNA ngắn của gen ty thể mã hóa cytochrome c oxidase subunit I (COI) làm chỉ thị DNA Mặc dù có vài trường hợp ngoại lệ, COI được coi là một chỉ thị DNA điển hình và chung cho các loài động vật [35], [36], [45]

Quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực vật gặp nhiều khó khăn Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối với chỉ thị

DNA và hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal

Transcribed Spacer) thường được sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên cứu [12], [26], [32] Trong vòng 5 năm qua, nhiều vùng gen đã được nghiên cứu và

đề xuất là chỉ thị DNA cho thực vật [14], [19], [29] Tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận [14], [22], [25] Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để định danh loài đối với thực vật [14], [29], [19]

Theo Taberlet P và cs (2007), hệ thống mã vạch DNA lý tưởng phải đáp ứng các yêu cầu sau đây:

- Thứ nhất, đoạn DNA chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt giữa các loài nhưng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong cùng loài

- Thứ hai, hệ thống định danh bằng DNA phải được chuẩn hóa, với cùng một vùng DNA có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau

- Thứ ba, đoạn DNA chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có thể dễ dàng định danh loài vào các nhóm phân loại (chi, họ,…)

- Thứ tư, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mồi nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự DNA

- Đoạn DNA nghiên cứu nên có kích thước ngắn để quá trình nhân bản DNA không bị sai lệch Thông thường, đoạn DNA nghiên cứu có kích thước 150 bp trở lại, nếu dài hơn sẽ dễ bị sai lầm trong quá trình nhân bản DNA

1.4 Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở thực vật

1.4.1 Trình tự gen nhân

Các trình tự barcode được nhân bản từ DNA hệ gen của bố mẹ dự kiến sẽ cung cấp nhiều hơn thông tin về các loài cần xác định Tuy nhiên khó khăn trong việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc có bản sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lượng DNA genome và khả năng phân biệt dưới loài do bảo toàn gen chức năng có thể chính là lý do tại sao hạn chế số lượng

các gen nhân được thử nghiệm trong xác định loài bằng phương pháp DNA barcode [36], [39]

1.4.2 Vùng gen mã hóa ribosome

Gen rDNA là hệ thống đa gen mã hóa phần RNA của ribosome Các gen DNA ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S và xen giữa

các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers) nằm ở hai bên

sườn của vùng 5,8S Vùng mã hóa của ba gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai vùng

ITS Nhìn chung các đơn vị rDNA được lặp lại hàng nghìn lần và được sắp xếp tập

trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể Một trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống đa gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khác biệt giữa các loài khác nhau

Hiện tại, nrITS vùng ITS của gen nhân được xem là một trong những công cụ

hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì nó phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chức năng Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản vô tính cho thấy một số

mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 do nhiều nguyên nhân như

lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và hình thành gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó Trên cơ sở này nrDNA có thể được sử dụng

để phân định chính xác và hiệu quả thực vật trong cùng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm, lâu năm, trên cạn, dưới nước) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [36], [39] [40]

1.4.3 Trình tự gen luc lạp

Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử DNA mạch vòng có kích thước 120

- 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large single-copy region) và bản sao đơn nhỏ (small single-copy region) Hai bản sao được phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau (IRa và IRb) có độ dài trung bình 20 - 30 kb Hệ gen lục lạp

chứa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao), các gen tRNA (35 gen) và các gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp trong lục lạp (khoảng 100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng

Bảng 1.1 Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp Mồi Trình tự 5’→3’

rbcL a-f

a-r

ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC

←

→

←

→: mồi xuôi; ←: mồi ngƣợc

Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng loài do vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật đƣợc các nhà khoa học rất quan tâm Dựa trên những thông tin có sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu gần đây, một số locus là đoạn gen hay các gen đƣợc chọn để nghiên cứu làm chỉ thị barcode tiềm năng cho

các loài thực vật trên trái đất Có khoảng 20 gen lục lạp có độ dài phù hợp (khoảng

1 kb) được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài Các gen này chứa đựng nhiều mức độ tiến hoá và vì vậy phù hợp cho nhiều mức độ phân loại [36], [38], [35]

Các locus khác nhau đã được đề xuất về điều tra nhóm, mồi thích hợp cho các gen này được trình bày trong bảng 1.1

1.4.4 Trình tự gen rbcL

Trong các gen lạp thể, rbcL là trình tự gen đặc trưng nhất, mã hóa các tiểu

đơn vị lớn của rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/ oxygenase (RUBISCO)

rbcL là gen đầu tiên được giải trình từ thực vật rbcL đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật với hơn 10000 trình tự rbcL có sẵn

trong GenBank Do sự dễ dàng trong khuếch đại PCR ở một số nhóm thực vật,

CBOL gần đây đã công nhận rbcL là một trong những trình tự gen tiềm năng nhất

cho các nghiên cứu DNA barcode ở thực vật Tuy nhiên, do khả năng phân biệt loài

thấp, nên hầu hết các nhóm đều cho rằng nên sử dụng kết hợp rbcL với các với các chỉ thị barcode khác, ví dụ như matK là hai locus barcode chuẩn cho thực vật [36],

[37], [39]

1.4.5 Trình tự gen matK

Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hoá nhanh nhất,

có kích thước khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên quan đến quá

trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA Do matK tiến hoá

nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật CBOL đã thử

nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ

dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng

matK là một trong những locus barcode chuẩn cho thực vật [36], [40]

1.4.6 Trình tự gen rpoB và rpoC1

Gen rpoB, rpoC1, rpoC2 mã hóa ba trong 4 tiểu đơn vị của RNA polymerase

lục lạp Khi nghiên cứu họ Dipterocarpaceae, Tsumura và đtg (1996) đã nhận thấy

gen rpoB là thích hợp để nghiên cứu phát sinh loài Hiện nay rpoB là gen được sử

dụng nhiều trong nghiên cứu phát sinh loài và xác định các loài vi khuẩn, đặc biệt là

khi nghiên cứu các chủng có quan hệ gần gũi Cùng với gen 16S rRNA, rpoB được

sử dụng trong nhiều nghiên cứu để xác định loài vi khuẩn mới, do vậy các gen này được đề xuất là chỉ thị barcode độc lập hoặc kết hợp với một số gen khác Trong các nghiên cứu gần đây, CBOL đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt

loài cuả đoạn gen rpoC1 là thấp nhất (43%) Mặc dù vậy, trong nghiên cứu Liu và đtg (2010) đã chỉ ra rpoC1 là một chỉ thị rất hữu ích khi được sử dụng để phân biệt

các loài bryophytes Do vậy cần có các nghiên cứu tiếp theo để chứng minh sự phù

hợp khi sử dụng rpoB và rpoC1 làm chỉ thị barcode trong các nghiên cứu giám định

loài [36], [38]

1.4.7 Trình tự gen ycf5

ycf5 mã hóa cho một protein có chứa 330 amino acids Gen này được bảo tồn

trên tất cả các vùng thực vật và đã được kiểm nghiệm cho phù hợp với DNA barcode của một vài nhóm Tuy nhiên, gen này chưa được công nhận và sử dụng nhiều trong vai trò của một DNA barcode [36], [35]

1.4.8 Trình tự hai gen trnH-psbA

Gen trnH-psbA có kích thước trung bình khoảng 450 bp, nhưng thay đổi từ

296 đến 1120 bp, trnH-psbA được chứng minh là có khả năng xác định loài cao Locus trnH-psbA đã được khuếch đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín và hạt trần Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín trnH-psbA lại có kích thước rất ngắn (~

300 bp), kích thước của gen này thay đổi lớn do sự có mặt của gen rpS19 hoặc các gen giả nằm giữa cùng gen của hai gen trnH và psbA Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử dụng trnH-psbA như chỉ thị barcode độc lập cho thực vật hay kết hợp với matK CBOL thấy rằng khả năng phân biệt loài của trnH-psbA là cao

nhất (69%) trong số 7 locus được thử nghiệm và do đó đề nghị nó như là chỉ thị

barode bổ sung trnH-psbA có thể sử dụng trong hệ thống barcode ba locus khi hệ

thống barcode hai locus không cung cấp đầy đủ khả năng phân tích [36], [28]

1.4.9 Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA)

Locus trnL (UAA) - trnF (FAA) chứa gen trnL (UAA), vùng intron và vùng nằm giữa hai gen trnL (UAA) và trnF (GAA) Taberlet và đtg là nhóm nghiên cứu đầu tiên sử dụng trnL trong các nghiên cứu hệ thống học thực vật Vùng không mã hoá trnL(UAA) và trnF (GAA) không phải là vùng có sự biến đổi lớn nhất của

DNA lục lạp nhưng có ưu thế như cấu trúc bậc 2 với vùng biến đổi và vùng bảo thủ xen kẽ nhau Điều này tạo thuận lợi cho các nghiên cứu tìm kiếm trình tự nucleotide

ở các vùng bảo thủ để thiết kế mồi và sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại các đoạn

gen ở vùng biến đổi Trong nghiên cứu để xác định trnL (UAA) intron có nên được

sử dụng làm vùng DNA barcode, Taberlet (2007) đã sử dụng 100 loài thực vật và

kết luận rằng trnL intron có thể sử dụng như là một barcode của thực vật, trnL-trnF

là một barcode tiềm năng cho phân tích, xác định các loài thực vật [29], [36], [40]

1.5 Tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật

Trọng tâm nghiên cứu barcode ở thực vật chủ yếu là về đánh giá hiệu quả tương đối của của các đoạn gen chỉ thị đã được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực vật gặp nhiều khó khăn Hệ gen ty thể ở thực vật thường quá bảo thủ nên không được dùng cho chỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang nhiều đặc điểm mong muốn đối với chỉ thị DNA như ở hệ gen ty thể ở động vật Ở hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal Transcribed Spacer) cũng được sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên cứu [12], [26], [35]

Mặc dù một vài locus trong hệ gen lục lạp và gen nhân đã được nghiên cứu làm chỉ thị trong nghiên cứu DNA barcode song kết quả thu được vẫn có những hạn chế Điều này cho thấy việc cần thiết sử dụng kết hợp các locus để bổ sung cho nhau đem lại hiệu quả cao hơn trong đánh giá, phân loại các loài thực vật Trên thực

tế từ lâu rbcL đã được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài, bên cạnh đó trình tự gen matK có tỷ lệ tiến hóa cao nhất trong các gen lạp thể cũng có khả năng phân biệt loài cao Trên cơ sở đó CBOL đã kết hợp hai locus của rbcL và matK mang lại

hiệu quả cao (70% sự phân biệt loài) và giảm nhiều chi phí cho các điều tra về xây

dựng mối quan hệ cũng như phân loại đánh giá các loài thực vật Hiệu quả kết hợp giữa hai gen này thích hợp cho các nghiên cứu như là điều tra tương tác thực vật - động vật, xác định các loài cây được bảo vệ, các cuộc khảo sát đa dạng sinh học quy

mô lớn và phân biệt cây giống trong các chương trình tái sinh rừng phân biệt và cho mục đích xác định loài và phân loại [36]

Spooner sau khi xem xét hiệu quả của psbA - trnH, matK, nrITS trên 63 loài khoai tây dại đã chỉ ra rằng trình tự của psbA - trnH, matK và nrITS không cung cấp đầy đủ các thông tin về loài cụ thể Gen lạp thể không cho thấy đầy đủ sự khác biệt, trong khi các trình tự nrITS cho thấy sự khác biệt trong loài cao Những khó khăn

đó cũng gặp phải trong chi Magnolioideae, họ Magnoliaceae và trong họ Lauraceae khi giải thích những mối quan hệ trong loài Từ những nghiên cứu cụ thể trên ba nhóm thực vật khác nhau, thực vật hạt kín, hạt trần và rêu các nhà phân loại kết luận

rằng việc kết hợp các locus hệ gen lạp thể như rbcL + rpoC1 + matK + trnH-psbA

mang lại hiệu quả cao như một hệ thống barcode duy nhất cho xác định các nhóm loài rộng Vì vậy, trong các dự án như giám định loài sử dụng các chỉ thị barcode, việc đề xuất barcode hai locus tiêu chuẩn là không đủ do sự phân ly trong loài và quần thể ở nhiều thực vật hạt kín là rất lớn Đặc biệt trong cùng khu vực phân bố trải qua giao phối và giao phối cận huyết, sự thay đổi của một hoặc hai trình tự gen lạp thể không đủ để đánh dấu ranh giới loài Các vấn đề sinh học như đa bôi thể, dị bội, sinh sản vô tính, chuyển gen, chọn dòng, phân ly và tiến hóa nhanh hình thái học dẫn đến sự khó khăn trong xác định loài Do vậy không thể sử dụng cùng một vùng DNA để xác định cho các loài khác nhau mà cần lựa chọn các vùng DNA khác nhau cho xác định ở các loài khác nhau [37], [38]

Hiện nay hệ thống DNA barcode cho thực vật chưa hoàn chỉnh Tuy nhiên với các trình tự DNA barcode này, các nhà khoa học đã có những nghiên cứu, ứng dụng đầy hứa hẹn cho xác định loài ở thực vật, mở ra một triển vọng mới cho cho công tác đánh giá, phân loại và bảo tồn đa dạng sinh học

1.6 Một số kết quả trong nghiên cứu về cây dó bầu tại Việt Nam và trên thế giới

Xuất phát từ những giá trị mà cây dó bầu mang lại đã thúc đẩy các nhà khoa học trên thế giới trong đó có Việt Nam đã tiến hành những thí nghiệm để nghiên cứu về loài cây này Một trong những nghiên cứu có đóng góp lớn nhất cho tới nay

là TS Lê Công Kiệt và TS Paul Kessler người Hà Lan đã phát hiện loài Aquilaria rugosa năm 2005 đồng thời phân biệt được Aquilaria rugosa với A sinnesiss, A crassna, A yunasensis [18]

Bằng chỉ thị AFLP nhóm nghiên cứu của Nurita và đống tác giả (2009) đã

phát hiện được sự tương đồng di truyền giữa các Aquilaria sp là A malaccensis, A beccatianavà A crassna khoảng 63,9 đến 72% so với các loài Aquilaria khác [21]

Các nhà khoa học người Malaysia cũng đã tiến hình phân tích trên 5 quần thể cây

dó bầu ở Malaysia bằng chỉ thị RAPD với 23 cặp mồi RADP từ đó đã tìm ra 5 chỉ

thị SCAR để phân biệt A hita với các Aquilaria khác [27]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1.Vật liệu

2.1.1 Thực vật

Gồm 18 mẫu lá cây dó bầu được thu thập tại Hà Tĩnh, Phú Quốc và tại Lào được thống kê qua bảng sau

Bảng 2.1 Thông tin về các mẫu dó bầu dùng trong nghiên cứu

2.1.2 Chủng vi khuẩn

Chủng vi khuẩn Escherichia coli (DH5α) sử dụng cho mục đích tách dòng

do Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học cung cấp

2.1.3 Hóa chất

Kit tinh sạch DNA (AccuPrep® Gel Purification Kit) của hãng Bioneer (Hàn Quốc)

Enzyme hạn chế BamHI, T4 DNA Ligase của Fermentas (Hàn Quốc), Taq

DNA polymerase, RNase đƣợc mua từ hãng Fermentas, vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học cung cấp

Hóa chất dùng cho tách chiết DNA tổng số: Nitơ lỏng, CTAB, NaCl, Tris HCl, EDTA, Sorbitol, NaH2PO4, H2O deion, Isopropanol, Ethanol, Chloroform, Isoamyl alcohol, RNase

Hóa chất dùng cho tách dòng gen: X-gal, IPTG, Vector tách dòng pBT do phòng Công nghệ tế bào thực vật cung cấp, Bacto tryptone, Yeast extract, NaCl, kháng sinh carbecillin

Hóa chất để tách plasmid: Sol I (Tris HCl, EDTA), Sol II (NaOH, SDS), Sol III (Kali axetat), isopropanol, ethanol, phenol, chloroform Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: MgCl2, Buffer , Taq-polymerase, dNTP.

Hóa chất dùng trong điện di DNA: agarose, TAE 1X (Tris - Acetic acide - EDTA), ethidium bromide

2.1.4 Máy móc thiết bị

Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, cùng với các trang thiết bị khác của phòng

Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học

2.1.5 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm 4 cặp mồi barcode và 1 cặp mồi pUC18 Trình tự nucleotide của các cặp mồi được trình bầy trong bảng 2.2

Bảng 2.2.Trình tự các cặp mồi nhân bản gen barcode

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các bước nghiên cứu

- Thu thập mẫu lá ở các cây dó bầu

- Tách chiết tinh sạch DNA tổng số từ 18 mẫu dó bầu

- Sử dụng phương pháp PCR để nhân bản đoạn gen quan tâm với mồi đặc hiệu

- Tách dòng đoạn gen quan tâm

- Xác định trình tự gen và phân tích kết quả

2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu cây dó bầu

DNA được tách chiết bằng phương pháp CTAB có cải tiến bao gồm các bước sau

- Cân 200 mg mẫu lá cây dó bầu và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn, chuyển ngay vào ống eppendorf 2 ml

- Bổ sung 1 ml đệm rửa (thành phần bảng 2.3) vào ống eppendorf 2 ml, voltex tạo thành dịch đồng nhất Ly tâm 13000 vòng/phút (v/p) trong 5 phút

- Bổ sung 0,6 ml đệm tách chiết (thành phần bảng 2.4), đảo nhẹ thành hỗn hợp đồng nhất Ủ trong 1 giờ 30 phút ( thỉnh thoảng đảo đều )

- Bổ sung 0,8 ml chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều Ly tâm 13000 v/p ở 4oC Hút dịch nổi cho vào ống eppendorf 1,5 ml mới

- Bổ sung 0,8 ml isopropanol, đảo nhẹ, để ở tủ -20oC trong 1 giờ (ít nhất 20 phút) Ly tâm 13000 v/p trong 15 phút ở 4oC, loại bỏ dịch nổi thu tủa

- Bổ sung 0,8 ml cồn 70% Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút ở 4oC, loại cồn thu tủa

- Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng

- Hòa tan DNA trong 200 µl nước khử ion Bổ sung 0,5 µl RNase (100 mg/ml)

2.2.2.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên máy PCR PTC - 100 (MJ Research., Mỹ) với tổng thể tích là 25 µl/mẫu trong đó chứa các thành phần và nồng độ của các chất tham gia phản ứng nhƣ sau:

5 Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 10 phút

- Cân đoạn gel vừa cắt được và xác định thể tích đoạn gel này theo quy ước 1mg trọng lượng sẽ tương đương với 1 µl thể tích

- Bổ sung dịch kết gắn DNA vào cột tinh sạch GB (Gel Binding), theo tỉ lệ:

2.2.2.4 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector

Sau khi đoạn DNA được tinh sạch, tiến hành gắn chúng vào vector tái tổ hợp thông qua phản ứng lai DNA sử dụng enzyme DNA T4 - ligase Vector sử dụng là vector pBT (Hình 2.1)

Hình 2.1 Sơ đồ vector pBT Phản ứng ghép nối ở điều kiện 22oC trong 1h30’.Sản phẩm sau khi ghép nối được sử dụng để biến nạp

2.2.2.5 Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E Coli

Biến nạp là quá trình chuyển DNA trực tiếp vào tế bào nhận, những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA được gọi là tế bào khả biến

- Sốc nhiệt ở 42oC trong vòng 90 giây sau đó để trong đá 15 phút

- Bổ sung 200 µl môi trường LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 200 vòng/phút,

370C trong vòng 1giờ

- Cấy trải 100 µl -150 µl trên môi trường thạch LB chứa Carbenicillin

- Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC qua đêm

- Sản phẩm sau biến nạp được cấy trải trên môi trường có chứa kháng sinh carbenicilin, X-gal và IPTG kết quả sẽ xuất hiện hai loại khuẩn lạc: khuẩn lạc xanh

và khuẩn lạc trắng Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đều đã được biến nạp plasmid chứa gen kháng sinh carbenicillin nên có thể phát triển được trên môi trường chọn lọc này và phát triển thành các khuẩn lạc Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vector không có nhận được gen ngoại lai Do vector có mang operon lacZ nên khi operon này hoạt động bình thường và khi có mặt chất cảm ứng IPTG sẽ tổng hợp enzyme β-galactosidase, enzyme này sẽ chuyển hóa cơ chất X-gal thành