Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch, chạy điện di kiểm tra và tính toán hàm lƣợng DNA để dùng cho phản ứng ghép nối vào vector tách dòng pBT. Phản ứng ghép nối là phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa base Adenin ở đầu 5’ của sản phẩm PCR với base Thymine ở đầu 3’ của vector tách dòng nhờ hoạt tính nối của enzyme T4 ligase. Nguyên lý và kỹ thuật ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng đƣợc trình bày cụ thể ở mục 2.2.2.4. Kết quả của phản ứng ghép nối sẽ đƣợc thể hiện sau khi biến nạp vào tế bào khả biến E.coli.
3.4.3. Kêt quả biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E. coli
Sản phẩm của quá trình chuyển gen vào vector pBT sẽ đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α, sau đó đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung carbenicilin 50 mg/l, X-gal 0,004% và IPTG 100μM. Quá trình này đƣợc trình bày
40
cụ thể ở mục 2.2.2.5. Kết quả của quá trình này sẽ là sự xuất hiện của những khuẩn lạc xanh và trắng, trong đó khuẩn lạc trắng là những khuẩn lạc chúng ta quan tâm.
Hình 3.8. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Hình 3.8 cho thấy kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến có kết quả tốt, trên đĩa nuôi cấy xuất hiện những khuẩn lạc xanh và trắng mật độ và số lƣợng tƣơng đối lớn đủ để qúa trình chọn lọn khuẩn lạc diễn ra dễ dàng (hình 3.8).
3.4.4 Kết quả chọn lọc dòng tế bào mang gen tái tổ hợp
Để xác định chính xác khuẩn lạc nào mang vector gắn đoạn DNA quan tâm chúng tôi tiến hành phản ứng colony - PCR. Với phƣơng pháp này giúp chúng ta phát hiện nhanh những dòng khuẩn lạc nào mang gen đích, giảm chi phí và tiết kiệm thời gian. Tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc trắng trên đĩa khuẩn lạc, sau đó thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi vector pUC-18. Phƣơng pháp tiến hành cụ thể đƣợc trình bày ở mục 2.2.6 Sản phẩm colony-PCR đƣợc điện di trên gel 0,8%.
Để chọn lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chúng tôi không sử dụng các cặp mồi đã nhân bản bằng phản ứng PCR (rbcL, rpoB, ITS và psbA - trnH) vì khi thực hiện phản ứng ghép nối sản phẩm PCR đã đƣợc sử dụng một lƣợng lớn do vậy ngoài những đoạn DNA quan tâm đã đƣợc gắn vào vector pBT vẫn còn rất nhiều đoạn DNA dƣ thừa, chúng tồn tại bên trong hoặc xung quanh các khuẩn lạc
41
mọc trên đĩa thạch khi biến nạp. Do đó khi tiến hành phản ứng clony - PCR với 4 cặp mồi trên chúng ta có thể vẫn thu đƣợc các băng vạch có kích thƣớc quan tâm tuy nhiên thực tế các đoạn DNA của chúng ta lại chƣa đƣợc biến nạp vào tế bào
E.coli.
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR - clony khuẩn lạc mồi rbcL
M : thang Marker 1Kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 : Các khuẩn lạc.
Mồi pUC18 đƣợc thiết kế nằm trên vector pBT và ở hai phía đối với đoạn cắt đa điểm. Khoảng cách giữa 2 mồi trên vector vào khoảng 200 bp. Do đó khi tiến hành phản ứng clony - PCR các khuẩn lạc trắng do vector tự đóng vòng sẽ thu đƣợc băng có kích thƣớc khoảng 200 bp, còn với plasmid tái tổ hợp còn các plasmid tái tổ hợp nhận đƣợc đoạn gen sẽ có kích thƣớc bằng kích thƣớc gen cộng thêm 200 bp.
Mồi rbcL nhân lên đoạn gen barcodes có kích thƣớc vào khoảng 750 bp, kết quả điện di trên hình 3.8 xuất hiện các băng vạch duy nhất có kích thƣớc vào khoảng hơn 900 bp. Nhƣ vậy bƣớc đầu cho thấy các dòng khuẩn lạc đều mang gen quan tâm trừ dòng số 1, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12, 17, 24 vì những dòng khuẩn lạc này không có băng vạch chúng ta quan tâm.
Các mồi còn lại cũng đƣợc tiến hành tƣơng tự và đã thu đƣợc các dòng khuẩn lạc mang gen cần quan tâm.
3.4.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp
Sau khi các dòng khuẩn lạc chứa đoạn gen ở trên đƣợc lựa chọn sẽ đƣợc nuôi trong 3 ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung carbenicillin 50 mg/l, lắc 200 vòng/phút qua đêm, sau đó tiến hành tách plasmid. Quá trình này đƣợc thực hiện theo quy
42
trình đã đƣợc trình bày ở mục 2.2.7. Plasmid đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8%.
Hình 3.10. Kết quả điện di plasmid tách chiết
M : thang maker 1kb; T1,T2,T3,T4,T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14, M1, Qx, G1, PQ64 : các plasmid của mồi rbcL
Qua kết quả điện di plasmid hình 3.10 ta thấy các plasmid tái tổ hợp đều có 3 băng rõ nét không bị đứt gẫy. Để kiểm tra chính xác sự có mặt của DNA đã đƣợc biến nạp chúng tôi tiến hành xử lý plasmid thu đƣợc bằng enzyme cắt giới hạn
BamHI.
3.4.6. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp
Các plasmid sau khi tách chiết cần tiến hành cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI để khẳng định plasmid có mang đoạn gen quan tâm hay không. Theo lý thuyết sau khi xử lý plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn sẽ thu đƣợc 2 phân đoạn có DNA: i) đoạn DNA đã đƣợc biến nạp và ii) phần plasmid còn lại sau khi đã mất đoạn DNA.
43
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI mồi rbcL.
M : thang Marker 1Kb; T1, T2, T3, T4, T6, T7, T8 : Các sản phẩm cắt của các plasmid đƣợc tách dòng đoạn gen rbcL
Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng BamHI ở các mẫu(T1,T2, T3, T4, T6, T7, T8)từ các plasmid đƣợc tách dòng đoạn gen rbcL cho thấy các mẫu plasmid đều phân thành hai băng trong đó có băng DNA kích thƣớc 750 bp quan tâm. Với các mẫu còn lại của mồi rbcL và 3 mồi còn lại chúng tôi cũng thu đƣợc kết quả tƣơng tự. Các đoạn gen này đã đƣợc xác định trình tự trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer.
3.5. Xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA chỉ thị
Các đoạn DNA sau khi đƣợc tách dòng thành công sẽ đƣợc gửi đọc trình tự tại công ty Macrogen (Công ty tham gia vào dự án giải trình tự bộ gen ngƣời). Trình tự đƣợc xác định trên máy đọc trình tự tự động theo nguyên lý của Sanger. Sau khi xử lý trình tự bằng phần mềm Bioedit và đối chiếu với những thông tin trên ngân hàng GenBank, chúng tôi đã tiến hành phân tích kết quả với cả 4 mồi nghiên cứu kết quả thu đƣợc nhƣ sau :
2500 bp
44
45
Bảng 3.2. So sánh trình tự vùng trnH-psbA intergenic lục lạp
Trình tự đoạn gen phân tích đƣợc có kích thƣớc 440 bp đúng so với kích thƣớc dự đoán là 450 bp trong đó có một số những sai khác ở các vị trí của 18 mẫu dó bầu nghiên cứu tuy nhiên những sai khác này là chƣa đủ để xác định phân loại giữa các mẫu nghiên cứu. Phân tích trình tự đoạn gen trnH-psbA cho thấy độ tƣơng đồng khi so sánh 18 mẫu Dó bầu nghiên cứu và trình tự A.sinensis đã đƣợc đăng trên ngân hàng GenBank có độ tƣơng đồng rất cao (99,1-100%). Điều này cho thấy hệ gen lục lạp ở dó bầu có tính bảo thủ rất cao giữa các cá thể ở các khu vực cách xa nhau về mặt địa lý (Hà Tĩnh, Phú Quốc, Lào). Hơn nữa, theo bản chất của hệ gen
46
lục lạp thì đây là hệ gen rất ít có những biến động giữa các cá thể thuộc các loài gần nhau.
47
Bảng 3.3. So sánh trình tự vùng gen lục lạp rpoB
Trình tự đoạn gen phân tích đƣợc có kích thƣớc 510 bp trong đó có một số vị trí sai khác giữa 18 mẫu nghiên cứu, tuy nhiên những sai khác này là những sai khác điểm nhỏ lẻ có thể bắt nguồn từ sự sai khác trong quá trình PCR vì emzym Taq polymerase không có hoạt tính sửa chữa trong quá trình PCR. Phân tích trình tự đoạn gen rpoB cho thấy độ tƣơng đồng khi so sánh 18 mẫu dó bầu nghiên cứu và
48
trình tự A.sinensis đã đƣợc đăng trên ngân hàng GenBank có độ tƣơng đồng rất cao (99,0 - 100%). Điều này càng khẳng định tính bảo thủ của hệ gen lục lạp ở thực vật.
50
Bảng 3.4. So sánh trình tự vùng gen lục lạp rbcL
Đoạn gen phân tích đƣợc có kích thƣớc 734 bp phù hợp với kích thƣớc ban đầu, trong kết quả phân tích trình tự thấy xuất hiện những vị trí sai khác của 18 mẫu dó bầu nghiên cứu đặc biệt ở vị trí 43 có sự thay đổi nucleotit A bằng G của với 6 mẫu Dó bầu nghiên cứu là AL2, AL6, AL8, M1, Qx, PQ64 so với 12 loài dó bầu còn lại. Đây là hai nhóm có xuất xứ cách xa nhau về mặt địa lý, các mẫu AL2, AL6, AL8, M1, Qx, PQ64 có xuất xứ từ Lào và Phú Quốc, các mẫu còn lại có xuất xứ từ Hà Tĩnh. Đây có thể coi là một dấu hiệu để bƣớc đầu phân biệt 18 cá thể dó bầu mà chúng ta nghiên cứu dù hệ số tƣơng đồng của 18 mẫu vẫn rất cao ( 99,0 - 100% ).
51
Bảng 3.5. Vị trí sai có thể khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng rbcL
STT Tên mẫu Vị trí sai khác
43 1 AL 02 G 2 AL 06 G 3 AL 08 G 4 G 1 A 5 T 1 A 6 T 2 A 7 T 3 A 8 T 4 A 9 T 6 A 10 T 7 A 11 T 8 A 12 T 9 A 13 T 10 A 14 T 11 A 15 T 14 A 16 PQ64 G 17 Qx G 18 M1 G
52
54
55
Kết quả phân tích trình tự cho thấy gen ITS có kích thƣớc 655 bp, hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu vẫn cao ( 91,1 - 100%) tuy nhiên trong trình tự xác định đƣợc xuất hiện nhiều sai khác có giá trị có thể sử dụng để phân loại đặc biệt là ở các vị trí 196, 455, 536, 596 611, 612. Một số sai khác đƣợc liệt kê trong bảng 3.3 dƣới đây.
Bảng 3.7. Các vị trí sai khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng ITS
STT Tên mẫu Vị trí dùng để phân loại 113 131 196 217 239 455 536 596 616 617 1 AL 02 C T T C C G A A G T 2 AL 06 C T T C C G A A G T 3 AL 08 C T T C C G A A G T 4 G 1 C T T C C G A A G T 5 T 1 T T C T T C G G A C 6 T 2 C T T C C G G G A C 7 T 3 T T C T T C G G A C 8 T 4 T C C T T C G G A C 9 T 6 C T T C C G A A G T 10 T 7 C T T C C G A A G T 11 T 8 C T T C C G A A G T 12 T 9 C C T C C C A A G T 13 T 10 C T T C C G A A G T 14 T 11 C T T C C G A A G T 15 T 14 T C C T T C G G A C 16 PQ64 C T T C C G A A G T 17 Qx C T T C C G A A G T 18 M1 C T T C C G A A G T
Với những sai khác ở những vị trí trên đã bổ xung thêm cơ sở để xác định phân loại 18 mẫu dó bầu nghiên cứu.
56 T7 QX A crassna AY920326 M1 Al8 A crassna AY920327 T11 T8 A sinensis FJ980392 A sinensis EF645836 G1 PQ64 Al6 Al2 A sinensis GQ891956 A sinensis EF645834 A sinensis EF645833 T6 T10 T9 T2 A yunnanensis EF645835 A rugosa AY920328 A rugosa AY920330 T1 T4 T3 T14 51 40 100 99 99 51 94 86 82 64 83 47 38 25 0.005
Hình 3.12. Cây phân loại giữa trên kết quả mồi ITS
Nhìn trên cây phân loại ta nhận thấy 18 mẫu dó bầu nghiên cứu có thể chia thành 2 nhóm lớn, với chỉ số bootstrap 80,5. Nhóm thứ nhât bao gồm các mẫu AL2, AL6, AL8, G1, Qx, PQ64, M1, T6, T7, T8, T9, T10, T11 cùng với A.crassna và A.
sinensis, nhóm thứ hai bao gồm các 5 mẫu còn lại. Các mẫu T1, T2, T3, T4, T14 phân thành 1 nhóm phân loại riêng với so với các loài A.crassna, A.sinensis, A.rugosa, A.yunasensis với chỉ số bootstrap 99,9%, có thể kết luận các mẫu này không thuộc 4 loài trên. Ở Việt Nam hiện nay ngoài 4 loài trên còn có 2 loài Dó Bà Nà (A.banacensis) và Dó Mã Lai (A. malacensis), tuy nhiên trình tự hai loại này chƣa đƣợc nghiên cứu. Nhiều khả năng các mẫu này là một trong hai loài trên. vì vậy cần sử dụng thêm các chỉ thị khác và các mồi barcode khác để có thể có kết luận chính xác hơn. Trình tự đoạn ITS của các mẫu T6, T7, T8, T9, T10, T11, các mẫu M1, QX, PQ64, G1 thu thập tại Phú Quốc và 3 mẫu thu thập ở Lào không có khác biệt tin cậy (25-47%) so với trình tự này của các loài A crassna và A. sinensis.
Từ kết quả phân tích chúng tôi nhận thấy rằng mối tƣơng quan di truyền giữa 18 mẫu dó bầu đƣợc nghiên cứu là tƣơng đối cao, Chỉ số tƣơng đồng di truyền
57
khoảng (91,1-100%). Các mẫu dó bầu có mức độ đa dạng di truyền thấp, tính bảo thủ cao điều này đã đƣợc chứng minh rõ ràng khi chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số chỉ thị đối với hệ gen lục lạp nhƣ trên.
58
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
- Đã tách chiết và tinh sạch đƣợc DNA tổng số của 18 mẫu dó bầu trong đó có 3 loài của Lào, 4 mẫu thu tại Phú Quốc và 11 mẫu thu tại Hà Tĩnh.
- Đã nhân bản thành công các đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, ITS bằng phƣơng pháp PCR từ DNA tổng số của 18 mẫu dó bầu.
- Đã xác định đƣợc trình tự nucleotide của 4 đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, trnL
của 18 mẫu dó bầu.
- Xuất hiện đƣợc những sai khác ở 4 gen này tuy nhiên gen trnH-psbA và rpoB khó có thể sử dụng để phân loại vì những sai khác này là do quá trình nhân bản.
- Với rbcL gen và ITS đã tìm đƣợc những sai khác có tính hệ thống và có giá trị trong việc sử dụng để phân loại.
2. Kiến nghị
- Tiếp tục sử dụng phƣơng pháp DNA bacode trong phân loại và xác định loài ở Việt Nam.
- Sử dụng gen rbcL và ITS vào việc xác định các loài dó bầu ở Việt Nam đồng thời tiến hành nghiên cứu với các mồi barcode khác để tìm ra các dấu hiệu xác định loài khác nhằm phân loại một cách chính xác và cụ thể hơn.
59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
`1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2002), Báo cáo tổng kết đề tài:
“Nghiên cứu xác định phƣơng pháp tạo trầm bằng tác nhân vi sinh trên cây dó bầu Aquilaria crassna”, Nha Trang.
2. Hoàng Cảnh (2006), Trầm hương và loại cây tạo ra trầm hương, lợi ích, thách thức và triển vọng. Hội trầm hƣơng Việt Nam.
3. Danh lục các loài thực vật Việt Nam, tập II, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Trung tâm nghiên cứu tài nguyên môi trƣờng, NXB Nông nghiệp.
4. Bùi Công Khánh (2007), Bước đầu tìm hiểu các chất tạo trầm nhân tạo trên cây dó bầu Aquilaria crassnatại Việt Nam, Nha Trang.
5. Thái Thành Lƣợm (2000), “Bảo vệ nguồn gen và khai thác kết qủa tạo trầm nhân
tạo trên cây trầm hƣơng”, Tạp chí khoa học phổ thông - Liên hiệp các hội khoa học kỹ thuật TP HCM, số 518.
6. Đào Sỹ Sành, Nguyễn Huy Sơn, Cao Văn, “Báo cáo kết quả ánh giá sơ bộ về tiềm năng sản xuất bột giấy của cây dó bầu”, Trung tâm nghiên cứu Lâm đặc sản, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Viện Công nghiệp giấy và Cenlulose.
7. Phạm Hồng Sơn (2006), Giáo trình kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử , Nhà xuất bản Đại học Huế, Huế.
8. Lê Duy Thành, Tạ Toàn, Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2005), Di truyền học, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
9. Anton L. (2007), Investigation of seed longevity and viability and cutting propagation for Aquilaria crassna, School of Marine and Tropical Biology James Cook University, Cairns.
60
Diana M. P., Mehrdad Hajibabaei, Spencer C. H. B. (2008), “Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well”. PLoS ONE, 3(7), pp. 2802.
11. Barden A., Awang A.N., Mulliken T., Song M. (2000),“Heart of the matter: