2.2.1. Các bước nghiên cứu
- Thu thập mẫu lá ở các cây dó bầu
- Tách chiết tinh sạch DNA tổng số từ 18 mẫu dó bầu
- Sử dụng phƣơng pháp PCR để nhân bản đoạn gen quan tâm với mồi đặc hiệu - Tách dòng đoạn gen quan tâm
- Xác định trình tự gen và phân tích kết quả
2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu cây dó bầu
DNA đƣợc tách chiết bằng phƣơng pháp CTAB có cải tiến bao gồm các bƣớc sau.
25
-Cân 200 mg mẫu lá cây dó bầu và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn, chuyển ngay vào ống eppendorf 2 ml.
-Bổ sung 1 ml đệm rửa (thành phần bảng 2.3) vào ống eppendorf 2 ml, voltex tạo thành dịch đồng nhất. Ly tâm 13000 vòng/phút (v/p) trong 5 phút.
-Bổ sung 0,6 ml đệm tách chiết (thành phần bảng 2.4), đảo nhẹ thành hỗn hợp đồng nhất. Ủ trong 1 giờ 30 phút ( thỉnh thoảng đảo đều ).
- Bổ sung 0,8 ml chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều. Ly tâm 13000 v/p ở 4oC. Hút dịch nổi cho vào ống eppendorf 1,5 ml mới.
- Bổ sung 0,8 ml isopropanol, đảo nhẹ, để ở tủ -20oC trong 1 giờ (ít nhất 20 phút). Ly tâm 13000 v/p trong 15 phút ở 4oC, loại bỏ dịch nổi thu tủa.
- Bổ sung 0,8 ml cồn 70%. Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút ở 4oC, loại cồn thu tủa.
-Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng.
- Hòa tan DNA trong 200 µl nƣớc khử ion. Bổ sung 0,5 µl RNase (100 mg/ml) ủ ở 37oC trong 2 giờ.
- Bảo quản DNA tổng số ở -20o
C
Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm rửa
STT Hóa chất Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng
1 Sorbitol 350 mM
2 Tris-HCl (pH 8,0) 1 M 100 mM
3 EDTA (pH 8,0) 0,5 M 5 mM
4 Sordium metabisulfit 5%
Bảng 2.4. Thành phần dung dịch đệm tách
STT Hóa chất Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng
1 NaCl 3 M 1.5 M
2 Tris-HCl (pH 8,0) 1 M 100 mM
3 EDTA (pH 8,0) 0,5 M 20 mM
26
2.2.2.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên máy PCR PTC - 100 (MJ. Research., Mỹ) với tổng thể tích là 25 µl/mẫu trong đó chứa các thành phần và nồng độ của các chất tham gia phản ứng nhƣ sau:
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR
Bảng 2.6. Chu kỳ phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 2 phút
30
2 Biến tính 94 30 giây
3 Gắn mồi 54 50 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 10 phút
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.2.3. Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose Quy trình.
- Cắt vùng gel chứa đoạn DNA quan tâm trên bản điện di.
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nƣớc khử ion vô trùng 12,8
Buffer (10X) 2,5
MgCl2 (25 mM) 2,5
dNTPs (10 mM) 2,5
Primer barcode_F (100 pmol/µl) 1
Primer barcode_R (100 pmol/µl) 1
Taq DNA polymerase (6 unit/µl) 0,7
DNA 2
27
- Cân đoạn gel vừa cắt đƣợc và xác định thể tích đoạn gel này theo quy ƣớc 1mg trọng lƣợng sẽ tƣơng đƣơng với 1 µl thể tích.
- Bổ sung dịch kết gắn DNA vào cột tinh sạch GB (Gel Binding), theo tỉ lệ: Vmẫu:VGB = 1:1.
- Ủ hỗn hợp ở 60oC trong 10 phút và cứ 2 phút thì đảo nhẹ 1 lần cho đến khi gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết DNA và ly tâm 13000 vòng/phút (v/p) trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Tiếp tục bổ sung đệm rửa 0,7 ml WB (Washing Buffer), ly tâm 13.000v/p. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm thêm 1 lần nữa trong vòng 1 phút để loại đệm WB.
- Chuyển cột sang ống Eppendorf mới 1,5 ml. Bổ sung 30 µl nƣớc khử ion khử trùng, để ở nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút để thu mẫu DNA.
2.2.2.4. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector
Sau khi đoạn DNA đƣợc tinh sạch, tiến hành gắn chúng vào vector tái tổ hợp thông qua phản ứng lai DNA sử dụng enzyme DNA T4 - ligase. Vector sử dụng là vector pBT (Hình 2.1)
Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT
Phản ứng ghép nối ở điều kiện 22oC trong 1h30’.Sản phẩm sau khi ghép nối đƣợc sử dụng để biến nạp.
28 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng ligase Thành phần phản ứng Thể tích (µl) H2O 3 Buffer T4 ligase 1 pBT 1 T4 DNA ligase 1 DNA 5 Tổng thể tích 10
2.2.2.5. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. Coli
Biến nạp là quá trình chuyển DNA trực tiếp vào tế bào nhận, những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA đƣợc gọi là tế bào khả biến.
Quy trình.
- Tế bào khả biến lấy từ tủ -83 0C ra và cho vào đá khoảng 10 phút trƣớc khi biến nạp.
- Bổ sung 10 µl DNA plasmid vào ống tế bào khả biến (50 - 100 µl). - Để ổn định trong đá trong vòng 5 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC trong vòng 90 giây sau đó để trong đá 15 phút.
- Bổ sung 200 µl môi trƣờng LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 200 vòng/phút, 370C trong vòng 1giờ.
- Cấy trải 100 µl -150 µl trên môi trƣờng thạch LB chứa Carbenicillin. - Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC qua đêm.
- Sản phẩm sau biến nạp đƣợc cấy trải trên môi trƣờng có chứa kháng sinh carbenicilin, X-gal và IPTG kết quả sẽ xuất hiện hai loại khuẩn lạc: khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng. Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đều đã đƣợc biến nạp plasmid chứa gen kháng sinh carbenicillin nên có thể phát triển đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc này và phát triển thành các khuẩn lạc. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vector không có nhận đƣợc gen ngoại lai. Do vector có mang operon lacZ nên khi operon này hoạt động bình thƣờng và khi có mặt chất cảm ứng IPTG sẽ tổng hợp enzyme β-galactosidase, enzyme này sẽ chuyển hóa cơ chất X-gal thành
29
hợp chất có màu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng là do nhận đƣợc plasmid mang gen ngoại lai. Gen ngoại lai sẽ chèn vào và nó sẽ phá vỡ cấu trúc gen lacZ khi có chất cảm ứng IPTG thì gen lacZ cũng không tổng hợp enzyme β-galactosidase và không xảy ra sự chuyển hóa X-gal. Tuy nhiên không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn gen barcode chèn vào có thể là chứa đoạn gen là sản phẩm phụ của phản ứng PCR, sự đột biến trên promoter lac hay sự đứt gãy base thymine đầu 3’ của vector cũng có thể làm cho khuẩn lạc mang màu trắng. Vì vậy để có thể biết chính xác các khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp cần tiến hành chọn bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) để phục vụ cho quá trình nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 2.8. Thành phần môi trƣờng chọn lọc tế bào vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp
Hóa chất Thể tích
Xgal (0,004%) 40 μl
IPTG(100 μM) 20 μl
Carbecilin(100 mg/l) 20 μl
LB đặc 20 ml
2.2.2.6. Chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp và tách plasmid
Chọn dòng tế bào mang DNA tái tổ hợp: Sau khi biến nạp vector tái tổ hợp vào trong tế bào E.coli, chọn lọc trên môi trƣờng LB đặc có chứa Carbecilin 100 mg/l, Xgal 0,004%, IPTG 100 μM, ủ đĩa ở 37oC trong 16h sẽ thu đƣợc khuẩn lạc xanh - trắng.
Tuy nhiên không phải bất cứ khuẩn lac trắng nào cũng là khuẩn lạc nhận đƣợc đoạn gen chúng ta quan tâm do vậy chúng ta cần tiến hành quá trình sàng lọc bằng phản ứng PCR - clony.
Lấy lƣợng phù hợp sinh khối từ khuẩn lạc lựa chọn, cho sinh khối tế bào vi khuẩn này vào trong 10 µl nƣớc khử ion. Sau đó sử dụng 3 µl hỗn hợp này để dùng cho phản ứng PCR. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với thanh phần nhƣ sau
30
Bảng 2.9. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc
TT Thành phần và nồng độ Thể tích (µl)
1 H2O 12,8
2 Dream Taq Buffer 2,5
3 MgCl2 2,5
4 dNTPs (2,5 mM) 2,5
5 Mồi puC-18 xuôi (10 µM) 1,0
6 Mồi puC-18 ngƣợc (10µM) 1,0
7 Dream Taq (5 U/µl) 0,7
8 DNA 2,0
Tổng 25
Bảng 2.10. Chu kỳ phản ứng PCR- clony
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 5 phút
25
2 Biến tính 94 30s
3 Gắn mồi 54 50s
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30s
5 Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 10 phút
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.2.7. Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. Coli
Quy trình tách DNA plasmid đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp phenol/chloroform có cải tiến sử dụng hóa chất bao gồm 3 dung dịch Sol I, Sol II và Sol III .
Bảng 2.11. Thành phần hóa chất tách plasmid
Kí hiệu Thành phần
Sol I Glucose (50 mM), Tris-HCL (25 mM), EDTA (10 mM) Sol II NaOH (0,2 N), SDS (1%)
31
Tiến hành:
- Lấy dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào eppendorf 2ml, ly tâm 7000 vòng/phút (v/p) trong 5 phút. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.
- Thêm 100 µl dung dịch Sol , hoà tan bằng voltex cho cặn tan hoàn toàn. - Bổ sung 200 µl dung dịch Sol II đảo nhẹ.
- Thêm 150 µl dung dịch Sol III đảo nhẹ rồi đặt trong đá 5 phút. - Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Thu dịch nổi.
- Bổ sung dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1) theo tỷ lệ 1:1.
- Ly tâm 13000v/p trong 10 phút. Chuyển pha trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới.
- Bổ sung dung dịch isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1:1, ủ ít nhất 20 phút. - Ly tâm 13000 v/p trong 20 phút, thu kết tủa.
- Rửa kết tủa 2 lần bằng 500µl ethanol 70%, ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. - Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng, sau đó thêm 50 µl nƣớc khử ion, để ở nhiệt độ phòng cho tan hoàn toàn. Plasmid đƣợc bảo quản ở -200C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2.8. Phương pháp xử lý enzyme
Phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn
- Tiến hành
- Phản ứng cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pBT mang DNA barcode tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng DH5α bằng enzyme BamHI (Fermentas) thực hiện với các thành phần nhƣ sau:
Bảng 2.12. Thành phần hóa chất dùng trong phản ứng cắt enzyme
Thành phần phản ứng Tổng thể tích (µl)
H2O 5
Buffer fof BamHI 1
BamHI 1
Plasmid 3
32
Hỗn hợp phản ứng đƣợc mang ủ ở 37o C. Sau đó mang điện di kiểm tra các plasmid đạt yêu cầu sẽ đƣợc giữ lại để mang đọc trình tự.
2.2.2.9. Phương pháp xử lý trình tự
Phân đoạn DNA chỉ thị sau khi tách dòng thành công trong vector pBT đƣợc gửi đi phân tích trình tự tại công ty Macrogen (Công ty tham gia vào dự án giải trình tự bộ gen ngƣời). Về nguyên tắc, trình tự đƣợc xác định theo nguyên tắc đọc trình tự của Sanger. Sau đó sẽ so sánh trình tự DNA này với ngân hàng gen tại Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học (NCBI) của Hoa Kỳ.
33
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số
Để tách chiết DNA đa ̣t hiệu suất và độ tinh sa ̣ch nhất thì việc lƣ̣a cho ̣n một phƣơng pháp tách chiết phù hợp với đối tƣợng nghiên cứu là rất quan tr ọng. Hiện nay, phƣơng pháp tách chiết DNA sử dụng CTAB là phƣơng pháp khá phổ biến để tách chiết DNA từ các mẫu có nguồn gốc thực vật. Phƣơng pháp sử dụng lần đầu tiên đƣợc Murray and Thompson mô tả vào năm 1980, tới nay đã đƣợc sử dụng rất phổ biến có hiệu quả với các mẫu khó tách chiết nhƣ thực vật giàu polysaccharides hay các sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật.
Trong nghiên cứu này, các mẫu lá và gỗ các cây dó bầu đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp CTAB các bƣớc tiến hành nhƣ mục 2.2.1 chƣơng 2. Quá trình này gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: các mẫu lá dó bầu đƣợc nghiền nhanh trong nitơ lỏng thành bột mịn bằng cối chày sứ để phá vỡ tế bào.
- Giai đoạn 2: Làm biến tính protein, loại bỏ protein và các thành phần hữu cơ khác bằng phenol: chloroform:isoamylalcohol (25 : 24 : 1).
T1 T2 T3 T4 T6 T7 T8 T9 T10 T11
34
- Giai đoạn 3: Tủa DNA bằng isopropanol hay ethanol 100%, thƣờng tủa bằng isopropanol lạnh trƣớc, sau đó tiếp tục rửa cặn DNA bằng ethanol. Sau đó để loại bỏ RNA chúng tôi bổ sung thêm 0,5µl RNase (100mg/ml) ủ ở 37oC trong 2 giờ. Chất lƣợng DNA thu đƣợc sau tách chiết và tinh sạch ảnh hƣởng rất lớn đến kết quả quá trình nghiên cứu. Một số vấn đề thƣờng hay gặp là DNA thu đƣợc sau khi tách chiết bị phân huỷ và đứt gãy. Do vậy sau khi tách chiết DNA, chúng tôi kiểm tra chất lƣợng DNA thu đƣợc bằng phƣơng pháp điện di. Kết quả sau khi điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm bằng Ethidium bromide (hình 3.1) cho thấy DNA thu đƣợc sau khi tách có chất lƣợng tốt, DNA không bị đứt gẫy, các băng vạch đều sáng rõ.
3.2. Tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu của phản ứng PCR
Khuếch đại đoạn gen là công đoạn đầu tiên nhằm nhân lên các đoạn DNA chỉ thị mong muốn sử dụng các cặp mồi đặc hiệu. Trong nhiều công bố gần đây về sử dụng DNA barcode (Yonghua Li và cộng sự, 2010), các tác giả cho thấy việc nhân bản thành công các trình tự DNA barcode bằng phản ứng PCR phụ thuộc rất nhiều vào chất lƣợng DNA dùng làm khuôn và đặc biệt là nhiệt độ bắt mồi đặc hiệu (Yonghua Li và cộng sự, 2010).
Bảng 3.1 Nhiệt độ bắt mồi và kích thƣớc gen của các cặp mồi nghiên cứu STT Vùng gen
nhân bản
Ký hiệu mồi
Kích thƣớc đoạn gen nhân
bản Nhiệt độ bắt cặp mồi lý thuyết Nhiết độ bắt cặp mồi thực tế 1 rbcL P2F 750 bp 53 54 P2R 60 2 rpoB P5F 500 bp 59 54 P5R 60 3 psbA-trnH P10F 450 bp 57 56 P10R 72 4 ITS P12F 800 bp 74 57 P12R 76
35
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm xác định nhiệt độ bắt mồi tối ƣu nhằm nhân bản đặc hiệu các trình tự barcode của 4 cặp mồi. Bốn cặp mồi chúng tôi tiến hành nghiên cứu đƣợc thiết kế dựa theo Vijayan và Tsou (2010). Chúng tôi tiến hành thử nghiệm nhiệt độ gắn mồi của 4 cặp mồi và kiểm tra kích thƣớc nhân bản thực tế của 4 gen này với 18 mẫu dó bầu. Sau quá trình thử nghiệm với các dải nhiệt độ gắn mồi khác nhau, đã xác định đƣợc nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu cho 4 cặp mồi nghiên cứu và kích thức nhân bản của 4 gen này so với dự đoán ban đầu có sự thay đổi thể hiện trên bảng 3.1
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy ở các ngƣỡng nhiệt độ thấp không thu đƣợc sản phẩm PCR hoặc sản phẩm PCR không có chất lƣợng tốt. Trong khi ở nhiệt độ đặc hiệu, ở tất cả các mồi đều thu đƣợc một vạch DNA duy nhất và rõ nét. Ở ngƣỡng nhiệt độ cao không thu đƣợc sản phẩm PCR (hình 3.2). Nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu của 4 cặp mồi dao động từ 54 - 570
C.
Hình 3.2. Kết quả chạy PCR - gradient của chỉ thị rpoB ở các ngƣỡng nhiệt độ từ 49o
C tới 58oC
Trên hình 3.2 cho thấy ở các ngƣỡng nhiệt độ khác nhau cho các kết quả khác nhau ở nhiệt độ 49oC, 50oC, 51oC, 52oC không xuất hiện băng vạch, nhiệt độ 53oC, 54oC, 55oC, 56oC, 57oC cho một băng vạch duy nhất tuy nhiên chỉ ở 54oC mới cho đƣợc băng vạch rõ nét còn các nhiệt độ còn lại băng vạch xuất hiện mờ không rõ nét, ngoài ra nhiệt độ cao hơn 57oC không thấy xuất hiện băng vạch. Do
36
vậy, chúng tôi xác định nhiệt độ thích hợp sử dụng trong chỉ thị này là 54oC. Và chúng tôi xác định đƣợc sản phẩm PCR sử dụng mồi rpoB có kích thƣớc khoảng