rpoB là một trong những gen cơ bản trong việc nghiên cứu sự phát sinh loài, đã đƣợc sử dụng ở nhiều nhóm sinh vật khác nhau.
37
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen rpoB của các mẫu dó bầu nghiên cứu M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4,
T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
Kết quả trên bản điện di cho thấy các băng đều sáng rõ và chỉ có một băng vạch duy nhất với kích thƣớc khoảng 500 bp đúng nhƣ kích thƣớc dự đoán ban đầu ở tất cả các mẫu nghiên cứu (hình 3.4).
3.3.3 Kế quả nhân bản gen psbA-trnH
Gen trnH-psbA có kích thƣớc trung bình khoảng 450 bp, nhƣng thay đổi từ 296 đến 1120 bp. trnH-psbA có khả năng xác định loài cao. Locus trnH-psbA đã khuếch đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín và hạt trần, dƣơng xỉ, rêu. Với các mẫu dó bầu nghiên cứu gen psbA-trnH có kích thƣớc vào khoảng 450 bp (hình 3.5)
Hình 3.5.Kết quả điện di sản phẩm PCR gen psbA-trnH của các mẫu dó bầu nghiên cứu M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4,
T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
500 bp
38
3.3.4. Kết quả nhân bản gen ITS
ITS là gen nhân đƣợc sử dụng nhiều trong phân tích đa dạng và xác định loài ở thực vật, tuy nhiên việc nhân bản gen này thƣờng gặp khó khăn trong việc khuếch đại PCR đơn gen hoặc số lƣợng bản sao của gen ít. Kết quả nhân bản gen ITS ở cây dó bầu cho thấy gen ITS có kích thƣớc khỏang 800bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% cho thấy các băng vạch đều sáng rõ nét và chỉ có một băng duy nhất điều này chứng tỏ quá trình nhân bản gen ITS có kết quả tốt ở cả 18 mẫu dó bầu nghiên cứu (hình 3.6).
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen ITS của các mẫu dó bầu nghiên cứu M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4,
T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
3.4. Kết quả tách dòng gen
3.4.1 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel)
Sản phẩm PCR thu đƣợc sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất nhƣ mồi, đệm PCR, các nucleotide,...còn dƣ, và đôi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hƣởng đến kết quả của quá trình tách dòng, do vậy cần tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trƣớc khi tiến hành quá trình đƣa gen vào vector tách dòng. Việc tinh sạch đƣợc thực hiện bằng bộ Kit AccuPrep Gel Purification Kit. Nguyên lý của phản ứng và quy trình thực hiện đƣợc nêu ở mục 2.2.2.3. Các đoạn gen sau khi tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8% để kiểm tra chất lƣợng và xác định sơ bộ hàm lƣợng DNA tinh sạch, kết quả thể hiện ở hình 3.7
39
Hình 3.7. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR gen rpoB
M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4, T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch ở hình 3.7 cho thấy chỉ có một băng vạch có kích thƣớc tƣơng ứng với đoạn gen đƣợc nhân lên bằng mồi barcode tƣơng ứng. Các băng vạch rõ nét chứng tỏ các DNA không bị đứt gãy trong quá trình tinh sạch, có thể tiến hành phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng tiếp theo.
Tƣơng tự với các sản phẩm PCR của các gen còn lại cũng đã đƣợc tiến hành tinh sạch và cho kết quả tốt tƣơng tự gen rpoB.
3.4.2. Kết quả chuyển gen vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch, chạy điện di kiểm tra và tính toán hàm lƣợng DNA để dùng cho phản ứng ghép nối vào vector tách dòng pBT. Phản ứng ghép nối là phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa base Adenin ở đầu 5’ của sản phẩm PCR với base Thymine ở đầu 3’ của vector tách dòng nhờ hoạt tính nối của enzyme T4 ligase. Nguyên lý và kỹ thuật ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng đƣợc trình bày cụ thể ở mục 2.2.2.4. Kết quả của phản ứng ghép nối sẽ đƣợc thể hiện sau khi biến nạp vào tế bào khả biến E.coli.
3.4.3. Kêt quả biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E. coli
Sản phẩm của quá trình chuyển gen vào vector pBT sẽ đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α, sau đó đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung carbenicilin 50 mg/l, X-gal 0,004% và IPTG 100μM. Quá trình này đƣợc trình bày
40
cụ thể ở mục 2.2.2.5. Kết quả của quá trình này sẽ là sự xuất hiện của những khuẩn lạc xanh và trắng, trong đó khuẩn lạc trắng là những khuẩn lạc chúng ta quan tâm.
Hình 3.8. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Hình 3.8 cho thấy kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến có kết quả tốt, trên đĩa nuôi cấy xuất hiện những khuẩn lạc xanh và trắng mật độ và số lƣợng tƣơng đối lớn đủ để qúa trình chọn lọn khuẩn lạc diễn ra dễ dàng (hình 3.8).
3.4.4 Kết quả chọn lọc dòng tế bào mang gen tái tổ hợp
Để xác định chính xác khuẩn lạc nào mang vector gắn đoạn DNA quan tâm chúng tôi tiến hành phản ứng colony - PCR. Với phƣơng pháp này giúp chúng ta phát hiện nhanh những dòng khuẩn lạc nào mang gen đích, giảm chi phí và tiết kiệm thời gian. Tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc trắng trên đĩa khuẩn lạc, sau đó thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi vector pUC-18. Phƣơng pháp tiến hành cụ thể đƣợc trình bày ở mục 2.2.6 Sản phẩm colony-PCR đƣợc điện di trên gel 0,8%.
Để chọn lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chúng tôi không sử dụng các cặp mồi đã nhân bản bằng phản ứng PCR (rbcL, rpoB, ITS và psbA - trnH) vì khi thực hiện phản ứng ghép nối sản phẩm PCR đã đƣợc sử dụng một lƣợng lớn do vậy ngoài những đoạn DNA quan tâm đã đƣợc gắn vào vector pBT vẫn còn rất nhiều đoạn DNA dƣ thừa, chúng tồn tại bên trong hoặc xung quanh các khuẩn lạc
41
mọc trên đĩa thạch khi biến nạp. Do đó khi tiến hành phản ứng clony - PCR với 4 cặp mồi trên chúng ta có thể vẫn thu đƣợc các băng vạch có kích thƣớc quan tâm tuy nhiên thực tế các đoạn DNA của chúng ta lại chƣa đƣợc biến nạp vào tế bào
E.coli.
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR - clony khuẩn lạc mồi rbcL
M : thang Marker 1Kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 : Các khuẩn lạc.
Mồi pUC18 đƣợc thiết kế nằm trên vector pBT và ở hai phía đối với đoạn cắt đa điểm. Khoảng cách giữa 2 mồi trên vector vào khoảng 200 bp. Do đó khi tiến hành phản ứng clony - PCR các khuẩn lạc trắng do vector tự đóng vòng sẽ thu đƣợc băng có kích thƣớc khoảng 200 bp, còn với plasmid tái tổ hợp còn các plasmid tái tổ hợp nhận đƣợc đoạn gen sẽ có kích thƣớc bằng kích thƣớc gen cộng thêm 200 bp.
Mồi rbcL nhân lên đoạn gen barcodes có kích thƣớc vào khoảng 750 bp, kết quả điện di trên hình 3.8 xuất hiện các băng vạch duy nhất có kích thƣớc vào khoảng hơn 900 bp. Nhƣ vậy bƣớc đầu cho thấy các dòng khuẩn lạc đều mang gen quan tâm trừ dòng số 1, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12, 17, 24 vì những dòng khuẩn lạc này không có băng vạch chúng ta quan tâm.
Các mồi còn lại cũng đƣợc tiến hành tƣơng tự và đã thu đƣợc các dòng khuẩn lạc mang gen cần quan tâm.
3.4.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp
Sau khi các dòng khuẩn lạc chứa đoạn gen ở trên đƣợc lựa chọn sẽ đƣợc nuôi trong 3 ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung carbenicillin 50 mg/l, lắc 200 vòng/phút qua đêm, sau đó tiến hành tách plasmid. Quá trình này đƣợc thực hiện theo quy
42
trình đã đƣợc trình bày ở mục 2.2.7. Plasmid đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8%.
Hình 3.10. Kết quả điện di plasmid tách chiết
M : thang maker 1kb; T1,T2,T3,T4,T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14, M1, Qx, G1, PQ64 : các plasmid của mồi rbcL
Qua kết quả điện di plasmid hình 3.10 ta thấy các plasmid tái tổ hợp đều có 3 băng rõ nét không bị đứt gẫy. Để kiểm tra chính xác sự có mặt của DNA đã đƣợc biến nạp chúng tôi tiến hành xử lý plasmid thu đƣợc bằng enzyme cắt giới hạn
BamHI.
3.4.6. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp
Các plasmid sau khi tách chiết cần tiến hành cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI để khẳng định plasmid có mang đoạn gen quan tâm hay không. Theo lý thuyết sau khi xử lý plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn sẽ thu đƣợc 2 phân đoạn có DNA: i) đoạn DNA đã đƣợc biến nạp và ii) phần plasmid còn lại sau khi đã mất đoạn DNA.
43
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI mồi rbcL.
M : thang Marker 1Kb; T1, T2, T3, T4, T6, T7, T8 : Các sản phẩm cắt của các plasmid đƣợc tách dòng đoạn gen rbcL
Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng BamHI ở các mẫu(T1,T2, T3, T4, T6, T7, T8)từ các plasmid đƣợc tách dòng đoạn gen rbcL cho thấy các mẫu plasmid đều phân thành hai băng trong đó có băng DNA kích thƣớc 750 bp quan tâm. Với các mẫu còn lại của mồi rbcL và 3 mồi còn lại chúng tôi cũng thu đƣợc kết quả tƣơng tự. Các đoạn gen này đã đƣợc xác định trình tự trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer.
3.5. Xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA chỉ thị
Các đoạn DNA sau khi đƣợc tách dòng thành công sẽ đƣợc gửi đọc trình tự tại công ty Macrogen (Công ty tham gia vào dự án giải trình tự bộ gen ngƣời). Trình tự đƣợc xác định trên máy đọc trình tự tự động theo nguyên lý của Sanger. Sau khi xử lý trình tự bằng phần mềm Bioedit và đối chiếu với những thông tin trên ngân hàng GenBank, chúng tôi đã tiến hành phân tích kết quả với cả 4 mồi nghiên cứu kết quả thu đƣợc nhƣ sau :
2500 bp
44
45
Bảng 3.2. So sánh trình tự vùng trnH-psbA intergenic lục lạp
Trình tự đoạn gen phân tích đƣợc có kích thƣớc 440 bp đúng so với kích thƣớc dự đoán là 450 bp trong đó có một số những sai khác ở các vị trí của 18 mẫu dó bầu nghiên cứu tuy nhiên những sai khác này là chƣa đủ để xác định phân loại giữa các mẫu nghiên cứu. Phân tích trình tự đoạn gen trnH-psbA cho thấy độ tƣơng đồng khi so sánh 18 mẫu Dó bầu nghiên cứu và trình tự A.sinensis đã đƣợc đăng trên ngân hàng GenBank có độ tƣơng đồng rất cao (99,1-100%). Điều này cho thấy hệ gen lục lạp ở dó bầu có tính bảo thủ rất cao giữa các cá thể ở các khu vực cách xa nhau về mặt địa lý (Hà Tĩnh, Phú Quốc, Lào). Hơn nữa, theo bản chất của hệ gen
46
lục lạp thì đây là hệ gen rất ít có những biến động giữa các cá thể thuộc các loài gần nhau.
47
Bảng 3.3. So sánh trình tự vùng gen lục lạp rpoB
Trình tự đoạn gen phân tích đƣợc có kích thƣớc 510 bp trong đó có một số vị trí sai khác giữa 18 mẫu nghiên cứu, tuy nhiên những sai khác này là những sai khác điểm nhỏ lẻ có thể bắt nguồn từ sự sai khác trong quá trình PCR vì emzym Taq polymerase không có hoạt tính sửa chữa trong quá trình PCR. Phân tích trình tự đoạn gen rpoB cho thấy độ tƣơng đồng khi so sánh 18 mẫu dó bầu nghiên cứu và
48
trình tự A.sinensis đã đƣợc đăng trên ngân hàng GenBank có độ tƣơng đồng rất cao (99,0 - 100%). Điều này càng khẳng định tính bảo thủ của hệ gen lục lạp ở thực vật.
50
Bảng 3.4. So sánh trình tự vùng gen lục lạp rbcL
Đoạn gen phân tích đƣợc có kích thƣớc 734 bp phù hợp với kích thƣớc ban đầu, trong kết quả phân tích trình tự thấy xuất hiện những vị trí sai khác của 18 mẫu dó bầu nghiên cứu đặc biệt ở vị trí 43 có sự thay đổi nucleotit A bằng G của với 6 mẫu Dó bầu nghiên cứu là AL2, AL6, AL8, M1, Qx, PQ64 so với 12 loài dó bầu còn lại. Đây là hai nhóm có xuất xứ cách xa nhau về mặt địa lý, các mẫu AL2, AL6, AL8, M1, Qx, PQ64 có xuất xứ từ Lào và Phú Quốc, các mẫu còn lại có xuất xứ từ Hà Tĩnh. Đây có thể coi là một dấu hiệu để bƣớc đầu phân biệt 18 cá thể dó bầu mà chúng ta nghiên cứu dù hệ số tƣơng đồng của 18 mẫu vẫn rất cao ( 99,0 - 100% ).
51
Bảng 3.5. Vị trí sai có thể khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng rbcL
STT Tên mẫu Vị trí sai khác
43 1 AL 02 G 2 AL 06 G 3 AL 08 G 4 G 1 A 5 T 1 A 6 T 2 A 7 T 3 A 8 T 4 A 9 T 6 A 10 T 7 A 11 T 8 A 12 T 9 A 13 T 10 A 14 T 11 A 15 T 14 A 16 PQ64 G 17 Qx G 18 M1 G
52
54
55
Kết quả phân tích trình tự cho thấy gen ITS có kích thƣớc 655 bp, hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu vẫn cao ( 91,1 - 100%) tuy nhiên trong trình tự xác định đƣợc xuất hiện nhiều sai khác có giá trị có thể sử dụng để phân loại đặc biệt là ở các vị trí 196, 455, 536, 596 611, 612. Một số sai khác đƣợc liệt kê trong bảng 3.3 dƣới đây.
Bảng 3.7. Các vị trí sai khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng ITS
STT Tên mẫu Vị trí dùng để phân loại 113 131 196 217 239 455 536 596 616 617 1 AL 02 C T T C C G A A G T 2 AL 06 C T T C C G A A G T 3 AL 08 C T T C C G A A G T 4 G 1 C T T C C G A A G T 5 T 1 T T C T T C G G A C 6 T 2 C T T C C G G G A C 7 T 3 T T C T T C G G A C 8 T 4 T C C T T C G G A C 9 T 6 C T T C C G A A G T 10 T 7 C T T C C G A A G T 11 T 8 C T T C C G A A G T 12 T 9 C C T C C C A A G T 13 T 10 C T T C C G A A G T 14 T 11 C T T C C G A A G T 15 T 14 T C C T T C G G A C 16 PQ64 C T T C C G A A G T 17 Qx C T T C C G A A G T 18 M1 C T T C C G A A G T
Với những sai khác ở những vị trí trên đã bổ xung thêm cơ sở để xác định phân loại 18 mẫu dó bầu nghiên cứu.
56 T7 QX A crassna AY920326 M1 Al8 A crassna AY920327 T11 T8 A sinensis FJ980392 A sinensis EF645836 G1 PQ64 Al6 Al2 A sinensis GQ891956 A sinensis EF645834 A sinensis EF645833 T6 T10 T9 T2 A yunnanensis EF645835 A rugosa AY920328 A rugosa AY920330 T1 T4 T3 T14 51 40 100 99 99 51 94 86 82 64 83 47 38 25 0.005
Hình 3.12. Cây phân loại giữa trên kết quả mồi ITS
Nhìn trên cây phân loại ta nhận thấy 18 mẫu dó bầu nghiên cứu có thể chia thành 2 nhóm lớn, với chỉ số bootstrap 80,5. Nhóm thứ nhât bao gồm các mẫu AL2, AL6, AL8, G1, Qx, PQ64, M1, T6, T7, T8, T9, T10, T11 cùng với A.crassna và A.
sinensis, nhóm thứ hai bao gồm các 5 mẫu còn lại. Các mẫu T1, T2, T3, T4, T14 phân thành 1 nhóm phân loại riêng với so với các loài A.crassna, A.sinensis, A.rugosa, A.yunasensis với chỉ số bootstrap 99,9%, có thể kết luận các mẫu này không thuộc 4 loài trên. Ở Việt Nam hiện nay ngoài 4 loài trên còn có 2 loài Dó Bà Nà (A.banacensis) và Dó Mã Lai (A. malacensis), tuy nhiên trình tự hai loại này chƣa đƣợc nghiên cứu. Nhiều khả năng các mẫu này là một trong hai loài trên. vì vậy cần sử dụng thêm các chỉ thị khác và các mồi barcode khác để có thể có kết luận chính xác hơn. Trình tự đoạn ITS của các mẫu T6, T7, T8, T9, T10, T11, các mẫu M1, QX, PQ64, G1 thu thập tại Phú Quốc và 3 mẫu thu thập ở Lào không có khác biệt tin cậy (25-47%) so với trình tự này của các loài A crassna và A. sinensis.
Từ kết quả phân tích chúng tôi nhận thấy rằng mối tƣơng quan di truyền giữa 18 mẫu dó bầu đƣợc nghiên cứu là tƣơng đối cao, Chỉ số tƣơng đồng di truyền