Để xác định chính xác khuẩn lạc nào mang vector gắn đoạn DNA quan tâm chúng tôi tiến hành phản ứng colony - PCR. Với phƣơng pháp này giúp chúng ta phát hiện nhanh những dòng khuẩn lạc nào mang gen đích, giảm chi phí và tiết kiệm thời gian. Tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc trắng trên đĩa khuẩn lạc, sau đó thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi vector pUC-18. Phƣơng pháp tiến hành cụ thể đƣợc trình bày ở mục 2.2.6 Sản phẩm colony-PCR đƣợc điện di trên gel 0,8%.
Để chọn lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chúng tôi không sử dụng các cặp mồi đã nhân bản bằng phản ứng PCR (rbcL, rpoB, ITS và psbA - trnH) vì khi thực hiện phản ứng ghép nối sản phẩm PCR đã đƣợc sử dụng một lƣợng lớn do vậy ngoài những đoạn DNA quan tâm đã đƣợc gắn vào vector pBT vẫn còn rất nhiều đoạn DNA dƣ thừa, chúng tồn tại bên trong hoặc xung quanh các khuẩn lạc
41
mọc trên đĩa thạch khi biến nạp. Do đó khi tiến hành phản ứng clony - PCR với 4 cặp mồi trên chúng ta có thể vẫn thu đƣợc các băng vạch có kích thƣớc quan tâm tuy nhiên thực tế các đoạn DNA của chúng ta lại chƣa đƣợc biến nạp vào tế bào
E.coli.
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR - clony khuẩn lạc mồi rbcL
M : thang Marker 1Kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 : Các khuẩn lạc.
Mồi pUC18 đƣợc thiết kế nằm trên vector pBT và ở hai phía đối với đoạn cắt đa điểm. Khoảng cách giữa 2 mồi trên vector vào khoảng 200 bp. Do đó khi tiến hành phản ứng clony - PCR các khuẩn lạc trắng do vector tự đóng vòng sẽ thu đƣợc băng có kích thƣớc khoảng 200 bp, còn với plasmid tái tổ hợp còn các plasmid tái tổ hợp nhận đƣợc đoạn gen sẽ có kích thƣớc bằng kích thƣớc gen cộng thêm 200 bp.
Mồi rbcL nhân lên đoạn gen barcodes có kích thƣớc vào khoảng 750 bp, kết quả điện di trên hình 3.8 xuất hiện các băng vạch duy nhất có kích thƣớc vào khoảng hơn 900 bp. Nhƣ vậy bƣớc đầu cho thấy các dòng khuẩn lạc đều mang gen quan tâm trừ dòng số 1, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12, 17, 24 vì những dòng khuẩn lạc này không có băng vạch chúng ta quan tâm.
Các mồi còn lại cũng đƣợc tiến hành tƣơng tự và đã thu đƣợc các dòng khuẩn lạc mang gen cần quan tâm.