54
55
Kết quả phân tích trình tự cho thấy gen ITS có kích thƣớc 655 bp, hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu vẫn cao ( 91,1 - 100%) tuy nhiên trong trình tự xác định đƣợc xuất hiện nhiều sai khác có giá trị có thể sử dụng để phân loại đặc biệt là ở các vị trí 196, 455, 536, 596 611, 612. Một số sai khác đƣợc liệt kê trong bảng 3.3 dƣới đây.
Bảng 3.7. Các vị trí sai khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng ITS
STT Tên mẫu Vị trí dùng để phân loại 113 131 196 217 239 455 536 596 616 617 1 AL 02 C T T C C G A A G T 2 AL 06 C T T C C G A A G T 3 AL 08 C T T C C G A A G T 4 G 1 C T T C C G A A G T 5 T 1 T T C T T C G G A C 6 T 2 C T T C C G G G A C 7 T 3 T T C T T C G G A C 8 T 4 T C C T T C G G A C 9 T 6 C T T C C G A A G T 10 T 7 C T T C C G A A G T 11 T 8 C T T C C G A A G T 12 T 9 C C T C C C A A G T 13 T 10 C T T C C G A A G T 14 T 11 C T T C C G A A G T 15 T 14 T C C T T C G G A C 16 PQ64 C T T C C G A A G T 17 Qx C T T C C G A A G T 18 M1 C T T C C G A A G T
Với những sai khác ở những vị trí trên đã bổ xung thêm cơ sở để xác định phân loại 18 mẫu dó bầu nghiên cứu.
56 T7 QX A crassna AY920326 M1 Al8 A crassna AY920327 T11 T8 A sinensis FJ980392 A sinensis EF645836 G1 PQ64 Al6 Al2 A sinensis GQ891956 A sinensis EF645834 A sinensis EF645833 T6 T10 T9 T2 A yunnanensis EF645835 A rugosa AY920328 A rugosa AY920330 T1 T4 T3 T14 51 40 100 99 99 51 94 86 82 64 83 47 38 25 0.005
Hình 3.12. Cây phân loại giữa trên kết quả mồi ITS
Nhìn trên cây phân loại ta nhận thấy 18 mẫu dó bầu nghiên cứu có thể chia thành 2 nhóm lớn, với chỉ số bootstrap 80,5. Nhóm thứ nhât bao gồm các mẫu AL2, AL6, AL8, G1, Qx, PQ64, M1, T6, T7, T8, T9, T10, T11 cùng với A.crassna và A.
sinensis, nhóm thứ hai bao gồm các 5 mẫu còn lại. Các mẫu T1, T2, T3, T4, T14 phân thành 1 nhóm phân loại riêng với so với các loài A.crassna, A.sinensis, A.rugosa, A.yunasensis với chỉ số bootstrap 99,9%, có thể kết luận các mẫu này không thuộc 4 loài trên. Ở Việt Nam hiện nay ngoài 4 loài trên còn có 2 loài Dó Bà Nà (A.banacensis) và Dó Mã Lai (A. malacensis), tuy nhiên trình tự hai loại này chƣa đƣợc nghiên cứu. Nhiều khả năng các mẫu này là một trong hai loài trên. vì vậy cần sử dụng thêm các chỉ thị khác và các mồi barcode khác để có thể có kết luận chính xác hơn. Trình tự đoạn ITS của các mẫu T6, T7, T8, T9, T10, T11, các mẫu M1, QX, PQ64, G1 thu thập tại Phú Quốc và 3 mẫu thu thập ở Lào không có khác biệt tin cậy (25-47%) so với trình tự này của các loài A crassna và A. sinensis.
Từ kết quả phân tích chúng tôi nhận thấy rằng mối tƣơng quan di truyền giữa 18 mẫu dó bầu đƣợc nghiên cứu là tƣơng đối cao, Chỉ số tƣơng đồng di truyền
57
khoảng (91,1-100%). Các mẫu dó bầu có mức độ đa dạng di truyền thấp, tính bảo thủ cao điều này đã đƣợc chứng minh rõ ràng khi chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số chỉ thị đối với hệ gen lục lạp nhƣ trên.
58
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
- Đã tách chiết và tinh sạch đƣợc DNA tổng số của 18 mẫu dó bầu trong đó có 3 loài của Lào, 4 mẫu thu tại Phú Quốc và 11 mẫu thu tại Hà Tĩnh.
- Đã nhân bản thành công các đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, ITS bằng phƣơng pháp PCR từ DNA tổng số của 18 mẫu dó bầu.
- Đã xác định đƣợc trình tự nucleotide của 4 đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, trnL
của 18 mẫu dó bầu.
- Xuất hiện đƣợc những sai khác ở 4 gen này tuy nhiên gen trnH-psbA và rpoB khó có thể sử dụng để phân loại vì những sai khác này là do quá trình nhân bản.
- Với rbcL gen và ITS đã tìm đƣợc những sai khác có tính hệ thống và có giá trị trong việc sử dụng để phân loại.
2. Kiến nghị
- Tiếp tục sử dụng phƣơng pháp DNA bacode trong phân loại và xác định loài ở Việt Nam.
- Sử dụng gen rbcL và ITS vào việc xác định các loài dó bầu ở Việt Nam đồng thời tiến hành nghiên cứu với các mồi barcode khác để tìm ra các dấu hiệu xác định loài khác nhằm phân loại một cách chính xác và cụ thể hơn.
59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
`1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2002), Báo cáo tổng kết đề tài:
“Nghiên cứu xác định phƣơng pháp tạo trầm bằng tác nhân vi sinh trên cây dó bầu Aquilaria crassna”, Nha Trang.
2. Hoàng Cảnh (2006), Trầm hương và loại cây tạo ra trầm hương, lợi ích, thách thức và triển vọng. Hội trầm hƣơng Việt Nam.
3. Danh lục các loài thực vật Việt Nam, tập II, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Trung tâm nghiên cứu tài nguyên môi trƣờng, NXB Nông nghiệp.
4. Bùi Công Khánh (2007), Bước đầu tìm hiểu các chất tạo trầm nhân tạo trên cây dó bầu Aquilaria crassnatại Việt Nam, Nha Trang.
5. Thái Thành Lƣợm (2000), “Bảo vệ nguồn gen và khai thác kết qủa tạo trầm nhân
tạo trên cây trầm hƣơng”, Tạp chí khoa học phổ thông - Liên hiệp các hội khoa học kỹ thuật TP HCM, số 518.
6. Đào Sỹ Sành, Nguyễn Huy Sơn, Cao Văn, “Báo cáo kết quả ánh giá sơ bộ về tiềm năng sản xuất bột giấy của cây dó bầu”, Trung tâm nghiên cứu Lâm đặc sản, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Viện Công nghiệp giấy và Cenlulose.
7. Phạm Hồng Sơn (2006), Giáo trình kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử , Nhà xuất bản Đại học Huế, Huế.
8. Lê Duy Thành, Tạ Toàn, Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2005), Di truyền học, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
9. Anton L. (2007), Investigation of seed longevity and viability and cutting propagation for Aquilaria crassna, School of Marine and Tropical Biology James Cook University, Cairns.
60
Diana M. P., Mehrdad Hajibabaei, Spencer C. H. B. (2008), “Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well”. PLoS ONE, 3(7), pp. 2802.
11. Barden A., Awang A.N., Mulliken T., Song M. (2000),“Heart of the matter: agarwood use and trade and CITES implementation for Aquilaria malaccensis”.
12. Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W. (2003),
“Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, J. Evol. Biol, (6), pp. 558-576.
13. Chakrabarty K., Kumar A., Menon V. (1994) “Trade in Agarwood. TRAFFIC- India Publications, New Delhi”, published by Avenash Dutta.
14. Chase M. W., Nicolas S., Mike W., James M. D., Rao P. K., Nadia H., and
Vincent S. (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and long- term goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp. 1889-1895.
15. CITES (2004), “Thirteenth Meeting of the Conference of the Parties.
Amendments to Appendices I and II of CITES”. Bangkok, Thailand, 3-14 October 2004 unpublished.
16. Gonzalez M. A., Baraloto C., Engel J., Mori S. A., Pe´tronelli P. (2009),
“Identification of Amazonian trees with DNA barcodes”, PLoS ONE 4(10), pp. 7483.
17. Harvey M., Botha F.C., (1996), “Use of PCR-based methodologies for the
determination of DNA diversity between Saccharum varieties”, Euphytica, (89), pp. 257-265.
18. Kiet L., Kessler PJA. and Eurlings M. (2005), “A new species of Aquilaria
(Thymelaceaceae) from Vietnam”, Blumea, (50), pp. 135-141.
19. Kress W. J., Erickson D. L. (2008), “DNA barcodes: Genes, genomics, and
bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp. 2761-2762.
20. Michiho I., Ken I. O., Toru Y., Gisho H., Fumiyuki K., Yasuo S. (2005)
61
sinensis cell suspension culture”, Journal of Essential Oil Research, 17(2), pp. 175-180.
21. Nurita T. M., Dewi R., Anidah (2009), “ Genetic variations among aquilaria species and gyrinops vetseegii using amplified fragment length polymorphism markers” Biotropia, Vol. 16 (No.2), pp. 88 - 95.
22. Ole S. and Gitte P. (2009), “How many loci does it take to DNA barcode a
crocus?”, PLoS ONE, 4(2), pp. 4598.
23. Qi S. H., He M. L., Lin D. L., Zhang C. H., Hu. L .J., and Zhang H. Z. (2005).”
Production of 2-(2-phenylethyl) chromones in cell suspension cultures of
Aquilaria sinensis”. Biomedical and Life Science , 83(2), pp.217-221.
24. Roman B., Alfaro C., Torres A. M., Moreno M. T., Satovic Z., Pujadas A.,
Rubiales D. (2003) , “Genetic relationships among Orabache species as revealed by RAPD analysis”, Annals of Botany, (91), pp. 637-642.
25. Savolainen V., and Chase M. W. (2003), “A decade of progress in plant
molecular phylogenetics”, Trends Genet, (19), pp. 717-724.
26. Shaw J., Lickey E.B., Schilling E. E., Small R.L. (2007),” Comparison of whole
chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III. Amer. J. Bot, (94), pp. 275-288.
27. Shiou Y. L., Jean W., Rozi M. (2011), “Genetic variation and molecular
authentication of slected Aquilaria species from natural population in Malaysia using RAPD and SCAR markers”, Asian journal of Plant Sciences,
10(3), pp. 204 - 210.
28. Storchova H., M. S. Olson (2007), “The architecture of the chloroplast psbA-
trnH non coding region in angiosperms”. Plant systematic and evolution. Biomedical and life sciences, Vol 268, No 1-4, pp. 235-256.
29. Taberlet P., Eric C., François P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V.,
Gérard C., Christian B., and Eske W. (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res,
62 35(3), pp14.
30. Taberlet P., Gielly L., Pautou G., Bouvet J. (1991), “Universal primers for
amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA”, Plant Molecular Biology (17), pp. 1105-1109.
31. TRP Agarwood Projectinformationand conference Website- http://wwwtherainforestproject.net 2007
32. Van den Berg C., Higgins W. E., Dressler R. L., Whitten W. M., Soto Arenas
M. A., Culham A., Chase M. W. (2000), “A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (ITS) of ribosomal DNA”, Lindleyana (15), pp.96114.
33. Valentini A., Miquel C., Nawaz M. A., Bellemain E. V. A., Coissac E., (2009),
“New perspectives in diet analysis based on DNA barcoding and parallel pyrosequencing: the trnL approach”, Molecular Ecology Resources (9), pp. 51-60.
34. Valentini A, Miquel C, Taberlet P (2010) “DNA barcoding for
honeybiodiversity”, Diversity 2, pp. 610-617.
35. Van DeWiel C. C. M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J. L., Duistermaat C.
H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091.
36. Vijayan K. and Tsou C. H. (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a
new perspective”, Current science, vol. 99, pp. 1530 - 1540.
37. Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R. (2010) “DNA barcoding
of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology (10), pp.205.
38. Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S. D. (2006),
“Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single- copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics (174),
63 pp. 1407-1420.
39. Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J. (2010), “Use of ITS2 region as
theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102.
40. Yong H. L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L. and Hui Y. (18
December, 2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol. 4(24), pp. 2706-2709.
Tài liệu Internet
41. http://nonglamdong.com/dobau.htm 42. http://www.ioop.org.vn/vn/NCTK/Thanh-Tuu-Cua-Vien/Ban-Tin-Khoa-Hoc- Cong-Nghe/Cay-Do-Bau/ 43. http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/ky-thuat-trong-cay-do-bau-tao-tram huong 44. http://www.tramhuongvietnam.com 45. http://www.barcoding.si.eu).