Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng cà định dạng của tập đoàn cây dó bầu ( aquilaria SP ) tại hà tĩnh

Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng cà định dạng của tập đoàn cây Dó Bầu ( Aquilaria SP.) tại Hà Tĩnh Hoàng Đăng Hiếu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Sinh học Luận văn Thạc sĩ ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70 Người hướng dẫn: PGS.TS. Chu Hoàng Hà Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Tổng quan về cây dó bầu; phương pháp sử dụng trong việc định danh loài và xác định quan hệ di truyền; DNA barcode - quan điểm mới trong phân loại; locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở thực vật; tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật. Tìm hiểu một số kết quả trong nghiên cứu về cây dó bầu tại Việt Nam và trên thế giới, Nghiên cứu thu thập 18 mẫu lá các cây dó dầu tại Hà Tĩnh, Phú Quốc và tại Lào, tách chiết tinh sạch DNA. Sử dụng phương pháp PCR để nhân bản đoạn gen quan tâm với mồi đặc hiệu. Tách dòng đoạn gen và xác định trình tự gen. Đưa ra kết quả và thảo luận: kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số; tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu của phản ứng PCR; nhân bản gen với các cặp mồi; kết quả tách dòng gen; xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA chỉ thị. Keywords. Di truyền học; Cây dó dầu; Sinh học phân tử Content 1. Đặt vấn đề Cây dó bầu (Aquilaria sp) là một trong những loài thực vật đặc hữu của nước ta, cây dó bầu mang lại giá trị kinh tế rất lớn với mục đích chủ yếu là khai thác trầm hương, một mặt hàng có giá trị kinh tế cao sử dụng trong công nghiệp mỹ phẩm, trong dược liệu, trong tôn giáo, chế tác đồ thủ công mỹ nghệ. Tuy nhiên, hiện nay các loài dó bầu ở Việt Nam bị lai tạp rất nhiều, công tác lựa chọn giống đưa vào trồng dựa chủ yếu vào quan sát hình thái, theo kinh nghiệm của mỗi cá nhân, dẫn đến năng suất và chất lượng trầm thu được không ổn định. Do vậy, việc chọn lọc giống cây ban đầu để đưa vào triển khai là hết sức quan trọng và là nhiệm vụ cấp thiết trong công tác bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen quý. Hiện nay phương pháp DNA barcode là một trong những công cụ phục vụ định danh loài chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng DNA chuẩn hay còn gọi là chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode). Việc xác định loài bằng DNA chỉ thị có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài thực vật trong đó có dó bầu ở Việt Nam khi những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để định danh hoặc phân biệt loài. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Gồm 18 mẫu lá cây dó bầu được thu thập tại Hà Tĩnh, Phú Quốc và tại Lào Chủng vi khuẩn Escherichia coli (DH5α) sử dụng cho mục đích tách dòng do Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học cung cấp. Các bước nghiên cứu: - Thu thập mẫu lá ở các cây dó bầu - Tách chiết tinh sạch DNA tổng số từ 18 mẫu dó bầu - Sử dụng phương pháp PCR để nhân bản đoạn gen quan tâm với mồi đặc hiệu - Tách dòng đoạn gen quan tâm - Xác định trình tự gen và phân tích kết quả 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA Các mẫu dó bầu sau khi thu thập được tiến hành ách triết DNA theo phương pháp CTAB T1 T2 T3 T4 T6 T7 T8 T9 T10 T11 Hình 1. Kết quả điện di DNA tổng số của một số mẫu dó bầu nghiên cứu Kết quả sau khi điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm bằng Ethidium bromide (hình 1) cho thấy DNA thu được sau khi tách có chất lượng tốt, DNA không bị đứt gẫy, các băng vạch đều sáng rõ. 3.2. Tìm nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu của phản ứng PCR Bốn cặp mồi chúng tôi tiến hành nghiên cứu được thiết kế dựa theo Vijayan và Tsou (2010). Chúng tôi tiến hành thử nghiệm nhiệt độ gắn mồi của 4 cặp mồi và kiểm tra kích thước nhân bản thực tế của 4 gen này với 18 mẫu dó bầu. Sau quá trình thử nghiệm với các dải nhiệt độ gắn mồi khác nhau, đã xác định được nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu cho 4 cặp mồi nghiên cứu và kích thức nhân bản của 4 gen này so với dự đoán ban đầu có sự thay đổi thể hiện trên bảng 1. Bảng 1 Nhiệt độ bắt mồi và kích thước gen của các cặp mồi nghiên cứu STT Vùng gen nhân bản Ký hiệu mồi Kích thước đoạn gen nhân bản Nhiệt độ bắt cặp mồi lý thuyết Nhiết độ bắt cặp mồi thực tế 1 rbcL P2F 750 bp 53 54 P2R 60 2 rpoB P5F 500 bp 59 54 P5R 60 3 psbA-trnH P10F 450 bp 57 56 P10R 72 4 ITS P12F 800 bp 74 57 P12R 76 3.3. Kết quả nhân bản gen với các cặp mồi nghiên cứu Sau khi tối ưu được nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu chúng tôi đã tiến hành nhân bản bằng phản ứng PCR với 4 cặp mồi nghiên cứu. Kết quả cho thấy 18 mẫu dó bầu nhân bản tốt với 4 cặp mồi nghiên cứu. Hình 2. Kết quả PCR gen ITS Hình 3. Kết PCR gen psbA – trnH Hình 4. Kết quả PCR gen rpoB Hình 5. Kết quả PCR gen rbcL 3.4. Kết quả tách dòng gen 3.4.1 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel) Sản phẩm PCR thu được sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất như mồi, đệm PCR, các nucleotide, còn dư, và đôi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình tách dòng, do vậy cần tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tiến hành quá trình đưa gen vào vector tách dòng. Các đoạn gen sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8% để kiểm tra chất lượng và xác định sơ bộ hàm lượng DNA tinh sạch, kết quả thể hiện ở hình 6. Hình 6. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR gen rpoB M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4, T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch ở hình 6 cho thấy chỉ có một băng vạch có kích thước tương ứng với đoạn gen được nhân lên bằng mồi barcode tương ứng. Các băng vạch rõ nét chứng tỏ các DNA không bị đứt gãy trong quá trình tinh sạch, có thể tiến hành phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng tiếp theo. Tương tự với các sản phẩm PCR của các gen còn lại cũng đã được tiến hành tinh sạch và cho kết quả tốt tương tự gen rpoB. 3.4.2. Kết quả chuyển gen vào vector tách dòng Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch, chạy điện di kiểm tra và tính toán hàm lượng DNA để dùng cho phản ứng ghép nối vào vector tách dòng pBT. Phản ứng ghép nối là phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa base Adenin ở đầu 5 ’ của sản phẩm PCR với base Thymine ở đầu 3 ’ của vector tách dòng nhờ hoạt tính nối của enzyme T4 ligase. 3.4.3. Kết quả biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E. coli Sản phẩm của quá trình chuyển gen vào vector pBT sẽ được biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α, sau đó được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung carbenicilin 50 mg/l, 500 bp X-gal 0,004% và IPTG 100μM. Kết quả của quá trình này sẽ là sự xuất hiện của những khuẩn lạc xanh và trắng, trong đó khuẩn lạc trắng là những khuẩn lạc chúng ta quan tâm. Hình 7. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến Hình 7 cho thấy kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến có kết quả tốt, trên đĩa nuôi cấy xuất hiện những khuẩn lạc xanh và trắng mật độ và số lượng tương đối lớn đủ để qúa trình chọn lọn khuẩn lạc diễn ra dễ dàng. 3.4.4 Kết quả chọn lọc dòng tế bào mang gen tái tổ hợp Để xác định chính xác khuẩn lạc nào mang vector gắn đoạn DNA quan tâm chúng tôi tiến hành phản ứng colony - PCR. Với phương pháp này giúp chúng ta phát hiện nhanh những dòng khuẩn lạc nào mang gen đích, giảm chi phí và tiết kiệm thời gian. Tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc trắng trên đĩa khuẩn lạc, sau đó thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi vector pUC-18. Hình 8. Kết quả điện di sản phẩm PCR - clony khuẩn lạc mồi rbcL M : thang Marker 1Kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 : Các khuẩn lạc. Mồi pUC18 được thiết kế nằm trên vector pBT và ở hai phía đối với đoạn cắt đa điểm. Khoảng cách giữa 2 mồi trên vector vào khoảng 200 bp. Do đó khi tiến hành phản ứng clony - PCR các khuẩn lạc trắng do vector tự đóng vòng sẽ thu được băng có kích thước khoảng 200 bp, còn với plasmid tái tổ hợp còn các plasmid tái tổ hợp nhận được đoạn gen sẽ có kích thước bằng kích thước gen cộng thêm 200 bp. Mồi rbcL nhân lên đoạn gen barcodes có kích thước vào khoảng 750 bp, kết quả điện di trên hình 3.8 xuất hiện các băng vạch duy nhất có kích thước vào khoảng hơn 900 bp. Như vậy bước đầu cho thấy các dòng khuẩn lạc đều mang gen quan tâm trừ dòng số 1, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12, 17, 24 vì những dòng khuẩn lạc này không có băng vạch chúng ta quan tâm. Các mồi còn lại cũng được tiến hành tương tự và đã thu được các dòng khuẩn lạc mang gen cần quan tâm. 3.4.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp Sau khi các dòng khuẩn lạc chứa đoạn gen ở trên được lựa chọn sẽ được nuôi trong 3 ml môi trường LB lỏng có bổ sung carbenicillin 50 mg/l, lắc 200 vòng/phút qua đêm, sau đó tiến hành tách plasmid sau đó plasmid được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8%. Hình 9. Kết quả điện di plasmid tách chiết M : thang maker 1kb; T1,T2,T3,T4,T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14, M1, Qx, G1, PQ64 : các plasmid của mồi rbcL Qua kết quả điện di plasmid hình 9 ta thấy các plasmid tái tổ hợp đều có 3 băng rõ nét không bị đứt gẫy. Để kiểm tra chính xác sự có mặt của DNA đã được biến nạp chúng tôi tiến hành xử lý plasmid thu được bằng enzyme cắt giới hạn BamHI. 3.4.6. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp Các plasmid sau khi tách chiết cần tiến hành cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI để khẳng định plasmid có mang đoạn gen quan tâm hay không. Theo lý thuyết sau khi xử lý plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn sẽ thu được 2 phân đoạn có DNA: i) đoạn DNA đã được biến nạp và ii) phần plasmid còn lại sau khi đã mất đoạn DNA. 2500 bp 750 bp Hình 10. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI mồi rbcL. M : thang Marker 1Kb; T1, T2, T3, T4, T6, T7, T8 : Các sản phẩm cắt của các plasmid được tách dòng đoạn gen rbcL Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng BamHI ở các mẫu(T1,T2, T3, T4, T6, T7, T8)từ các plasmid được tách dòng đoạn gen rbcL cho thấy các mẫu plasmid đều phân thành hai băng trong đó có băng DNA kích thước 750 bp quan tâm. Với các mẫu còn lại của mồi rbcL và 3 mồi còn lại chúng tôi cũng thu được kết quả tương tự. 3.5. Xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA chỉ thị Các đoạn DNA sau khi được tách dòng thành công sẽ được gửi đọc trình tự tại công ty Macrogen (Công ty tham gia vào dự án giải trình tự bộ gen người). Trình tự được xác định trên máy đọc trình tự tự động theo nguyên lý của Sanger. Sau khi xử lý trình tự bằng phần mềm Bioedit và đối chiếu với những thông tin trên ngân hàng GenBank, chúng tôi đã tiến hành phân tích kết quả với cả 4 mồi nghiên cứu kết quả thu được như sau : 3.5.1. Kết quả xác định và phân tích trình tự gen trn-psbA Trình tự đoạn gen phân tích được có kích thước 440 bp đúng so với kích thước dự đoán là 450 bp trong đó có một số những sai khác ở các vị trí của 18 mẫu dó bầu nghiên cứu tuy nhiên những sai khác này là chưa đủ để xác định phân loại giữa các mẫu nghiên cứu. Phân tích trình tự đoạn gen trnH-psbA cho thấy độ tương đồng khi so sánh 18 mẫu Dó bầu nghiên cứu và trình tự A.sinensis đã được đăng trên ngân hàng GenBank có độ tương đồng rất cao (99,1-100%). Điều này cho thấy hệ gen lục lạp ở dó bầu có tính bảo thủ rất cao giữa các cá thể ở các khu vực cách xa nhau về mặt địa lý (Hà Tĩnh, Phú Quốc, Lào). Hơn nữa, theo bản chất của hệ gen lục lạp thì đây là hệ gen rất ít có những biến động giữa các cá thể thuộc các loài gần nhau. 3.5.2. Kết quả xác định và phân tích trình tự gen rpoB Trình tự đoạn gen phân tích được có kích thước 510 bp trong đó có một số vị trí sai khác giữa 18 mẫu nghiên cứu, tuy nhiên những sai khác này là những sai khác điểm nhỏ lẻ có thể bắt nguồn từ sự sai khác trong quá trình PCR vì emzym Taq polymerase không có hoạt tính sửa chữa trong quá trình PCR. Phân tích trình tự đoạn gen rpoB cho thấy độ tương đồng khi so sánh 18 mẫu dó bầu nghiên cứu và trình tự A.sinensis đã được đăng trên ngân hàng GenBank có độ tương đồng rất cao (99,0 - 100%). Điều này càng khẳng định tính bảo thủ của hệ gen lục lạp ở thực vật. 3.5.3. Kết quả xác định và phân tích trình tự vùng gen lục lạp rbcL Đoạn gen phân tích được có kích thước 734 bp phù hợp với kích thước ban đầu, trong kết quả phân tích trình tự thấy xuất hiện những vị trí sai khác của 18 mẫu dó bầu nghiên cứu đặc biệt ở vị trí 43 có sự thay đổi nucleotit A bằng G của với 6 mẫu Dó bầu nghiên cứu là AL2, AL6, AL8, M1, Qx, PQ64 so với 12 loài dó bầu còn lại. Đây là hai nhóm có xuất xứ cách xa nhau về mặt địa lý, các mẫu AL2, AL6, AL8, M1, Qx, PQ64 có xuất xứ từ Lào và Phú Quốc, các mẫu còn lại có xuất xứ từ Hà Tĩnh. Đây có thể coi là một dấu hiệu để bước đầu phân biệt 18 cá thể dó bầu mà chúng ta nghiên cứu dù hệ số tương đồng của 18 mẫu vẫn rất cao ( 99,0 - 100% ). 3.5.4. Kết quả xác định và phân tích trình tự gen ITS Kết quả phân tích trình tự cho thấy gen ITS có kích thước 655 bp, hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu vẫn cao ( 91,1 - 100%) tuy nhiên trong trình tự xác định được xuất hiện nhiều sai khác có giá trị có thể sử dụng để phân loại đặc biệt là ở các vị trí 196, 455, 536, 596 611, 612. Một số sai khác được liệt kê trong bảng 2. Với những sai khác ở những vị trí trên đã bổ xung thêm cơ sở để xác định phân loại 18 mẫu dó bầu nghiên cứu. Bảng 2. Các vị trí sai khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng ITS STT Tên mẫu Vị trí dùng để phân loại 113 131 196 217 239 455 536 596 616 617 1 AL 02 C T T C C G A A G T 2 AL 06 C T T C C G A A G T 3 AL 08 C T T C C G A A G T 4 G 1 C T T C C G A A G T 5 T 1 T T C T T C G G A C 6 T 2 C T T C C G G G A C 7 T 3 T T C T T C G G A C 8 T 4 T C C T T C G G A C 9 T 6 C T T C C G A A G T 10 T 7 C T T C C G A A G T 11 T 8 C T T C C G A A G T 12 T 9 C C T C C C A A G T 13 T 10 C T T C C G A A G T 14 T 11 C T T C C G A A G T 15 T 14 T C C T T C G G A C 16 PQ64 C T T C C G A A G T 17 Qx C T T C C G A A G T 18 M1 C T T C C G A A G T T7 QX A crassna AY920326 M1 Al8 A crassna AY920327 T11 T8 A sinensis FJ980392 A sinensis EF645836 G1 PQ64 Al6 Al2 A sinensis GQ891956 A sinensis EF645834 A sinensis EF645833 T6 T10 T9 T2 A yunnanensis EF645835 A rugosa AY920328 A rugosa AY920330 T1 T4 T3 T14 51 40 100 99 99 51 94 86 82 64 83 47 38 25 0.005 Hình 10. Cây phân loại giữa trên kết quả mồi ITS Nhìn trên cây phân loại ta nhận thấy 18 mẫu dó bầu nghiên cứu có thể chia thành 2 nhóm lớn, với chỉ số bootstrap 80,5. Nhóm thứ nhât bao gồm các mẫu AL2, AL6, AL8, G1, Qx, PQ64, M1, T6, T7, T8, T9, T10, T11 cùng với A.crassna và A. sinensis, nhóm thứ hai bao gồm các 5 mẫu còn lại. Các mẫu T1, T2, T3, T4, T14 phân thành 1 nhóm phân loại riêng với so với các loài A.crassna, A.sinensis, A.rugosa, A.yunasensis với chỉ số bootstrap 99,9%, có thể kết luận các mẫu này không thuộc 4 loài trên. Ở Việt Nam hiện nay ngoài 4 loài trên còn có 2 loài Dó Bà Nà (A.banacensis) và Dó Mã Lai (A. malacensis), tuy nhiên trình tự hai loại này chưa được nghiên cứu. Nhiều khả năng các mẫu này là một trong hai loài trên. vì vậy cần sử dụng thêm các chỉ thị khác và các mồi barcode khác để có thể có kết luận chính xác hơn. Trình tự đoạn ITS của các mẫu T6, T7, T8, T9, T10, T11, các mẫu M1, QX, PQ64, G1 thu thập tại Phú Quốc và 3 mẫu thu thập ở Lào không có khác biệt tin cậy (25-47%) so với trình tự này của các loài A crassna và A. sinensis. Từ kết quả phân tích chúng tôi nhận thấy rằng mối tương quan di truyền giữa 18 mẫu dó bầu được nghiên cứu là tương đối cao, Chỉ số tương đồng di truyền khoảng (91,1-100%). Các mẫu dó bầu có mức độ đa dạng di truyền thấp, tính bảo thủ cao điều này đã được chứng minh rõ ràng khi chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số chỉ thị đối với hệ gen lục lạp như trên. 3. Kết luận và kiến nghị 4.1. Kết luận - Đã tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số của 18 mẫu dó bầu trong đó có 3 loài của Lào, 4 mẫu thu tại Phú Quốc và 11 mẫu thu tại Hà Tĩnh. - Đã nhân bản thành công các đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, ITS bằng phương pháp PCR từ DNA tổng số của 18 mẫu dó bầu. - Đã xác định được trình tự nucleotide của 4 đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, trnL của 18 mẫu dó bầu. - Xuất hiện được những sai khác ở 4 gen này tuy nhiên gen trnH-psbA và rpoB khó có thể sử dụng để phân loại vì những sai khác này là do quá trình nhân bản. - Với rbcL gen và ITS đã tìm được những sai khác có tính hệ thống và có giá trị trong việc sử dụng để phân loại. 4.2. Kiến nghị - Tiếp tục sử dụng phương pháp DNA bacode trong phân loại và xác định loài ở Việt Nam. - Sử dụng gen rbcL và ITS vào việc xác định các loài dó bầu ở Việt Nam đồng thời tiến hành nghiên cứu với các mồi barcode khác để tìm ra các dấu hiệu xác định loài khác nhằm phân loại một cách chính xác và cụ thể hơn. References Tài liệu tiếng Việt `1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2002), Báo cáo tổng kết đề tài: “Nghiên cứu xác định phương pháp tạo trầm bằng tác nhân vi sinh trên cây dó bầu Aquilaria crassna”, Nha Trang. 2. Hoàng Cảnh (2006), Trầm hương và loại cây tạo ra trầm hương, lợi ích, thách thức và triển vọng. Hội trầm hương Việt Nam. 3. Danh lục các loài thực vật Việt Nam, tập II, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Trung tâm nghiên cứu tài nguyên môi trường, NXB Nông nghiệp. 4. Bùi Công Khánh (2007), Bước đầu tìm hiểu các chất tạo trầm nhân tạo trên cây dó bầu Aquilaria crassnatại Việt Nam, Nha Trang. 5. Thái Thành Lượm (2000), “Bảo vệ nguồn gen và khai thác kết qủa tạo trầm nhân tạo trên cây trầm hương”, Tạp chí khoa học phổ thông - Liên hiệp các hội khoa học kỹ thuật TP HCM, số 518. 6. Đào Sỹ Sành, Nguyễn Huy Sơn, Cao Văn, “Báo cáo kết quả ánh giá sơ bộ về tiềm năng sản xuất bột giấy của cây dó bầu”, Trung tâm nghiên cứu Lâm đặc sản, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Viện Công nghiệp giấy và Cenlulose. 7. Phạm Hồng Sơn (2006), Giáo trình kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử , Nhà xuất bản Đại học Huế, Huế. 8. Lê Duy Thành, Tạ Toàn, Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2005), Di truyền học, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. [...]... A., Pe´tronelli P (2 00 9), “Identification of Amazonian trees with DNA barcodes”, PLoS ONE 4(1 0), pp 7483 17 Harvey M., Botha F.C., (1 99 6), “Use of PCR-based methodologies for the determination of DNA diversity between Saccharum varieties”, Euphytica, (8 9), pp 257-265 18 Kiet L., Kessler PJA and Eurlings M (2 00 5), “A new species of Aquilaria (Thymelaceaceae) from Vietnam”, Blumea, (5 0), pp 135-141 19... among aquilaria species and gyrinops vetseegii using amplified fragment length polymorphism markers” Biotropia, Vol 16 (No. 2), pp 88 - 95 22 Ole S and Gitte P (2 00 9), “How many loci does it take to DNA barcode a crocus?”, PLoS ONE, 4(2 ), pp 4598 23 Qi S H., He M L., Lin D L., Zhang C H., Hu L J., and Zhang H Z (2 00 5). ” Production of 2 -(2 -phenylethyl) chromones in cell suspension cultures of Aquilaria. .. Chase M W (2 00 0), “A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (ITS) of ribosomal DNA”, Lindleyana (1 5), pp.96114 33 Valentini A., Miquel C., Nawaz M A., Bellemain E V A., Coissac E., (2 00 9), “New perspectives in diet analysis based on DNA barcoding and parallel pyrosequencing: the trnL approach”, Molecular Ecology Resources (9 ), pp... Erickson D L (2 00 8), “DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 10 5(8 ), pp 2761-2762 20 Michiho I., Ken I O., Toru Y., Gisho H., Fumiyuki K., Yasuo S (2 00 5) ,“Induction of sesquiterpenoid production by methyl jasmonate in Aquilaria sinensis cell suspension culture”, Journal of Essential Oil Research, 1 7(2 ), pp 175-180 21 Nurita T M., Dewi R., Anidah (2 00 9), “ Genetic... Biomedical and Life Science , 8 3(2 ), pp.217-221 24 Roman B., Alfaro C., Torres A M., Moreno M T., Satovic Z., Pujadas A., Rubiales D (2 00 3) , “Genetic relationships among Orabache species as revealed by RAPD analysis”, Annals of Botany, (9 1), pp 637-642 25 Savolainen V., and Chase M W (2 00 3), “A decade of progress in plant molecular phylogenetics”, Trends Genet, (1 9), pp 717-724 26 Shaw J., Lickey... Taberlet P (2 01 0) “DNA barcoding for honeybiodiversity”, Diversity 2, pp 610-617 35 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2 00 9), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f .), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources (9 ), pp.1086-1091 36 Vijayan K and Tsou C H (2 01 0), “DNA... equally well” PLoS ONE, 3(7 ), pp 2802 11 Barden A., Awang A.N., Mulliken T., Song M (2 00 0), “Heart of the matter: agarwood use and trade and CITES implementation for Aquilaria malaccensis” 12 Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2 00 3), “Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, J Evol Biol, (6 ), pp 558-576 13 Chakrabarty... clade”, Genetics (1 7 4), pp 1407-1420 39 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2 01 0), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5 ), pp.13102 40 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (1 8 December, 201 0) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(2 4), pp 2706-2709... a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 37 Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R (2 01 0) “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology (1 0), pp.205 38 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2 00 6), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative,... 717-724 26 Shaw J., Lickey E.B., Schilling E E., Small R.L (2 00 7), ” Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (9 4), pp 275-288 27 Shiou Y L., Jean W., Rozi M (2 01 1), “Genetic variation and molecular authentication of slected Aquilaria species from natural population in Malaysia using RAPD . Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng cà định dạng của tập đoàn cây Dó Bầu ( Aquilaria SP. ) tại Hà Tĩnh Hoàng. dó dầu; Sinh học phân tử Content 1. Đặt vấn đề Cây dó bầu (Aquilaria sp) là một trong những loài thực vật đặc hữu của nước ta, cây dó bầu mang lại