LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

Trong những năm 70-80 công tác phòng chống và ựiều trị lao ựã trở nên không hữu hiệu do có sự xuất hiện của các chủng lao kháng thuốc khó chữa trị và có nguy cơ lây lan nhanh và ựã làm c

TRƯỜNG ðẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC

PHÂN TỬ

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- Tự thực hiện khóa luận tốt nghiệp

- Không sao chép khóa luận tốt nghiệp dưới bất cứ hình thức nào

- Các số trích dẫn trong khóa luận tốt nghiệp là trung thực

Tôi chịu trách nhiệm hoàn toàn về lời cam ñoan này

ii Danh mục các hình 2

iii Danh mục các bảng, biểu ñồ, sơ ñồ 3

CHƯƠNG MỞ ðẦU 4

1 Tính cấp thiết của ñề tài 5

2 Mục ñích nghiên cứu 5

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 5

4 Phương pháp nghiên cứu 5

5 Các kết quả ñạt ñược của ñề tài 6

Chương 1: TỒNG QUAN BỆNH LAO 7

1.1 Bệnh lao 8

1.1.1 Lịch sử bệnh lao 8

1.1.2 Khái niệm về bệnh lao 8

1.2 Tình hình dịch tễ bệnh lao 8

1.2.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới 8

1.2.2 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam 9

1.3 Phân loại và ñặc ñiểm vi khuẩn lao 10

1.3.1 Phân loại 10

1.3.2 ðặc ñiểm 11

1.3.3 Bộ gen của vi khuẩn lao 12

1.4 Nguồn lây, ñường xâm nhiễm và diễn biến bệnh 13

1.4.1 Nguồn lây 13

1.4.2 ðường xâm nhiễm 13

1.4.3 Diễn biến nhiễm bệnh 13

Chương 2 : BỆNH LAO KHÁNG THUỐC 15

2.1 Lịch sử bệnh lao kháng thuốc 16

2.2 Tình hình bệnh lao kháng thuốc 16

2.2.1 Trên thế giới 16

2.4 Vi khuẩn lao kháng thuốc 20

2.4.1 ðặc điểm giúp vi khuẩn lao cĩ khả năng kháng thuốc 20

2.4.1 Vi khuẩn lao đột biến gen kháng thuốc 21

Chương 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BỆNH LAO 25

3.1 Các phương pháp chuẩn đốn bệnh lao cổ điển 26

3.1.1 Chuẩn đốn lâm sàng 26

3.1.2 Phương pháp nhuộm soi đàm 26

3.1.3 Phương pháp nuơi cấy tìm vi khuẩn lao 26

3.1.4 Phương pháp X-quang phổi 26

3.1.5 Phương pháp thử phản ứng Tuberculin 27

3.2 Các phương pháp chuẩn đốn bệnh lao hiện đại 27

3.2.1 Phương pháp ELISA 27

3.2.2 Phương pháp PCR 29

3.2.3 Phương pháp Real-time PCR 32

Chương 4: QUY TRÌNH PHÁT HIỆN LAO KHÁNG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR 35

4.1 Giới thiệu quy trình 36

4.2 Vật liệu, thiết bị và hĩa chất 36

4.2.1 Vật liệu sinh học 36

4.2.2 Mồi và mẫu dị 36

4.2.3 Thiết bị, dụng cụ 38

4.2.4 Hĩa chất 39

4.3 Quy trình phát hiện lao kháng thuốc bằng phương pháp real-time PCR 4.3.1 Mẫu 41

4.3.1.1 Thu mẫu 41

4.3.1.2 Xử lý mẫu 41

4.3.2 Tách chiết DNA 41

4.3.5 Nhận xét quy trình 46

Chương 5: KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 : Hình ảnh vi khuẩn lao chụp dưới kính hiển vi 11

Hình 1.2 : Hình ảnh Mycobacterium tuberculosis hiển vi ñiện tử quét 11

Hình 1.3 : Bộ gen của Mycobacterium tuberculosis 12

Hình 2.1 : Tình hình bệnh lao kháng thuốc trên thế giới 17

Hình 2.2 : Tình hình bệnh lao ở Việt Nam 18

Hình 2.3 : Hình ảnh vách tế bào vi khuẩn lao 20

Hình 2.4 : ðột biến trong vùng 81 bp codon 507-533 gen rpoB 21

Hình 2.5 : Vùng khả năng bị ñột biến 22

Hình 2.6 : ðột biến trong codon Ser95 22

Hình 3.1 : Hình ảnh lao chụp x-quang 26

Hình 3.2 : Phương pháp ELISA gián tiếp 27

Hình 3.3 : Các bước trong phương pháp Sandwich ELISA 29

Hình 4.1 : Các thiết bị và dụng cụ trong quy trình 38

Hình 4.2 : Primer thiết kế hướng dẫn của CDS 44

Hình 4.3 : Chu trình nhiệt Phát hiện Mycobacterium tuberculosis (MTB) kháng thuốc bằng kỹ thuật real-time PCR 45

Hình 4.4 : ðường biểu diễn khuyếch ñại mẫu thử nghiệm 46

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỀU ðỒ, SƠ ðỒ

Trang

Bảng 1.1 : Thống kê tình hình bệnh lao trên thế giới năm 2009 9

Bảng 4.1 : Các mồi và mẫu dò ñược sử dụng 37

Biểu ñồ 2.1 : Tỷ lệ kháng thuốc trong các ca ñã trải qua ñiều trị và nhiễm mới 18

Biểu ñồ 3.1 : Biểu ñồ ñường biểu diễn khuếch ñại 34

CHƯƠNG MỞ ðẦU

1 Tắnh cấp thiết của ựề tài

Bệnh lao ựã xuất hiện hàng nghìn năm nay và là căn bệnh khó chữa trị Hiện nay

có khoảng 1/3 dân số trên thế giới ựã nhiễm lao, mỗi năm có khoảng 3 triệu người chết vì

lao Nguyên nhân gây bệnh lao là vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis đây là vi khuẩn

hình que, dài từ 3-5ộm, rộng từ 0,3 - 0,5ộm, không có tiêm mao, hai ựầu tròn, tế bào có hạt

Trong những năm 70-80 công tác phòng chống và ựiều trị lao ựã trở nên không hữu hiệu do có sự xuất hiện của các chủng lao kháng thuốc khó chữa trị và có nguy cơ lây lan nhanh và ựã làm cho số người mắc bệnh, tử vong tăng cao Những người mắc chủng

vi khuẩn lao mới này phải ựiều trị trên 2 năm so với ựiều trị 6- 8 tháng như trước kia và chi phắ tăng lên gấp 100 lần Tổ chức Y tế thế giới ước tắnh, ựến nay ựã có 2700 ca bệnh lao kháng thuốc ở 41 quốc gia Việc ựiều trị cho bệnh nhân lao kháng thuốc hết sức nghiêm ngặt và cần phải theo dõi liên tục

Vi khuẩn lao có thời gian sinh sản và tăng trưởng chậm nên các phương pháp như: nuôi cấy truyền thống, nhuộm soi ựàm mất nhiều thời gian, chậm trễ trong phát hiện và ựiều trị bệnh lao Chắnh vì vậy một phương pháp phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc nhanh chóng và chắnh xác là ựiều cần thiết nhất đề tài thực hiện nhằm tìm hiểu về quy

trình phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc bằng một số kỹ

thuật sinh học phân tử nhằm cung cấp thêm một số thông tin về vấn ựề này

2 Mục ựắch nghiên cứu

Tìm hiểu về quy trình chẩn ựoán bệnh lao kháng thuốc phương pháp sinh học phân

tử, giúp phát hiện bệnh nhanh chóng và chắnh xác ựể ựiều trị kịp thời

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

Tìm hiểu về quy trình phát hiện lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

đánh giá ựược ựộ nhạy và chắnh xác của quy trình

4 Phương pháp nghiên cứu

Thu thập tài liệu

Tìm hiểu các quy trình phát hiện khuẩn lao

Xác ựịnh quy trình về mặt lý thuyết

Dự ựoán ựánh giá quy trình ựề xuất

5 Các kết quả ựạt ựược của ựề tài

Tìm hiểu thành công về quy trình phát hiện lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử, ựiều quan trọng ở ựây là việc tách chiết và tinh sạch DNA của vi khuẩn lao

ựể tránh trường hợp dương tắnh giả có thể xảy ra

đánh giá ựược ựộ nhạy và chắnh xác của quy trình

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH LAO

1.1 Bệnh lao

1.1.1 Lịch sử bệnh lao [4]

Theo phát hiện di tích bộ xương người cổ ñại cho thấy những tổn thương ñặc trưng của bệnh lao, chứng tỏ bệnh lao xuất hiện cách ñây 4000 năm trước công nguyên Nhiều loại thuốc phục vụ cho việc ñiều trị bệnh lao cũng ñã xuất hiện cách ñây 7000 năm ở Ấn

ðộ và 5000 năm ở Trung Quốc

1.1.2 Khái niệm về bệnh lao [6]

Lao là một bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis gây

nên Bệnh lao có thể gặp ở tất cả các bộ phận cơ thể, trong ñó lao phổi là thể lao phổ biến nhất (chiếm 80-85%) và là nguồn lây nhiễm chính

1.2 Tình hình dịch tễ bệnh lao

1.2.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới

Hiện nay trên thế giới có khoảng 1/3 dân số (hơn 2,2 tỉ người) ñã nhiễm lao Thống

kê cho thấy cứ 3 người trên thế giới, có một người bị nhiễm vi khuẩn lao ðến năm 2005,

có 8,8 triệu ca lao mới (tỷ lệ: 140/100000 dân), trong ñó thì 3,9 triệu trường hợp nhiễm

lao mới (62/100000dân) Số người chết do lao khoảng 1,7 triệu (28/100000) [23]

Năm 2008, số người chết ñược thống kê là 1,1-1,2 triệu người, số người mới nhiễm

là 8,9-9,9 triệu người, trung bình mỗi ngày có khoảng 48 nghìn người chết Tỉ lệ này chiếm ña số trong các trường hợp tử vong do vi khuẩn lao thuộc các nước ñang phát triển, ñặc biệt là ở Châu Á (chiếm hơn ½ trong tổng số trường hợp) Tỉ lệ nhiễm lao tính trên toàn cầu ñang có xu hướng giảm, nhưng rất chậm dưới 1%

Năm 2009, có 1,7 triệu người chết vì lao, tương ñương với 4700 ca tử vong mỗi ngày và có9,4 triệu ca nhiễm lao mới Tỷ lệ mắc ước tính trên toàn cầu năm 2009 giảm

xuống 137 ca/100000 dân Tỷ lệ này vẫn ñang giảm nhưng rất chậm [22]

Hàng năm vùng Tây Thái Bình Dương có 2 triệu ca lao mới Số trường hợp nhiễm lao ở vùng này chiếm 1/3 tổng số ca lao trên toàn cầu, trong ñó 70% ca lao ở ñộ tuổi 15 –

54 Năm 2005 vùng này có 990000 ca lao ñược báo cáo, trong ñó 455000 ca là nguồn lây 9/10 ca lao trong vùng ñược tìm thấy tại 7 quốc gia: Campuchia, Trung Quốc, Lào, Mông

Cổ, Papua New Guinea, Philippines và Việt Nam

Bảng 1.1: Thống kê tình hình bệnh lao trên thế giới năm 2009

1.2.2 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam

Trong giai ñoạn từ 1997 – 2002 phát hiện 530 nghìn bệnh nhân lao các thể, ñã ñiều trị 260 nghìn bệnh nhân lao phổi với tỷ lệ khỏi là 92% So với khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam chiếm 12% bệnh nhân nhiễm lao các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi mới

Tính ñến thời ñiểm tháng 7 năm 2006, Việt Nam xếp thứ 13 trong 22 nước có số lượng bệnh nhân lao cao nhất thế giới Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam ñứng thứ 3 sau Trung Quốc và Philippin

Theo kết quả ñiều tra dịch tễ học toàn quốc năm 2006 - 2007, tình hình bệnh lao ở nước ta cao hơn ước tính trên thế giới của WHO 1,6 lần Số bệnh nhân ñược phát hiện muộn hoặc không ñược phát hiện ngoài cộng ñồng còn chiếm tỷ lệ cao Thực tế tỷ lệ phát hiện bệnh nhân mắc lao là khoảng 55%

ðến năm 2008, Việt Nam có tỷ lệ bệnh nhân tái phát và ñiều trị thất bại tăng (năm

2004 là 6,4%, năm 2008 là 7,7%) ðặc biệt lao ñang có xu hướng giảm ở lứa tuổi già và

có xu hướng tăng ở lứa tuổi trẻ Ở lứa tuổi 15 -24, tỷ lệ phát hiện lao phổi mới (tính trên

100 nghìn dân), tăng từ 19,5 (2000) lên 37,5 (2008) ñối với nam giới, còn nữ giới là từ 16,9 lên 42,8 Ước tính tử vong do lao ở nước ta là 20000 ca /năm Tỷ lệ dân số bị nhiễm

lao ở nước ta là 44% Số bệnh nhân lao ước tính mỗi năm Số mới mắc các thể: 154000 người.Trong ñó bệnh nhân lao phổi 69000 người [23]

Nhiều nguyên nhân ñã ñược ñưa ra là dịch vụ y tế chăm sóc sức khỏe công cộng của Việt Nam chưa tốt, ñặc biệt là ở vùng sâu vùng xa, tình trạng tự ñiều trị lao của người dân, hay ñiều trị chưa triệt ñể ñã làm xuất hiện các thể lao kháng thuốc

Mục ñích của chương trình chống lao quốc gia tại Việt Nam là giảm tỷ lệ mắc, chết

và lây truyền bệnh trong cộng ñồng, bao gồm cả ảnh hưởng về tâm lý- xã hội gây ra bởi bệnh lao và phòng ngừa bệnh lao kháng thuốc nhằm góp phần vào chiến lược xóa ñói

giảm nghèo và tăng trưởng của Việt Nam [25]

1.3 Phân loại và ñặc ñiểm vi khuẩn lao [6]

1.3.1.Phân loại

Giới: Monera Ngành: Bacteria Lớp: Actinobacteria Bộ: Actinomycetales Họ: Mycobacteriaceae

Chi: Mycobacterium Loài: Mycobacterium tuberculosis

Phân loại dựa vào ñối tượng gây bệnh cho người và các vật, vi khuẩn lao bao gồm:

- Vi khuẩn lao người - Mycobacterium tuberculosis homonis

- Vi khuẩn lao bò - Mycobacterium bovis

- Vi khuẩn lao chim - Mycobacterium avium

- Vi khuẩn lao chuột - Mycobacterium microti

Phân loại dựa trên ñoạn gen IS6110 chiều dài 1361 bp nằm trong cấu trúc DNA

của vi khuẩn thì chỉ có ở 4 loài Mycobacteria là M.tuberculosis, M.bovis, M microti, M.africanum (gọi chung là M.tuberculosis complex), mà không có ở các Mycobacteria

khác Tại khoa vi sinh của Bệnh viện Lao- Phổi Trung ương, các nhà nghiên cứu nhận thấy 71% các chủng vi khuẩn lao hiện nay có từ 5 ñoạn IS6110 trở xuống, trong khi vi khuẩn cổ ñiển tỷ lệ này là 10%

Vi khuẩn lao có khả năng tồn tại lâu ở môi trường bên ngoài cơ thể vật chủ Trong ñiều kiện tự nhiên, vi khuẩn có thể tồn tại 3-4 tháng, chết sau 1,5h dưới ưới ánh sáng mặt trời Vi khuẩn lao ngừng phát triển ở 420 C, chết sau 10 phút ở 800 C, có thể sống ñược trong 3 phút với cồn 90 ñộ và sống ñược 1 phút trong acid phenic 5%

Vi khuẩn phát triển tốt nhất ở pH từ 6,2-7,2 và có thể phát triển tốt nhất ở pH acid (5,5) hoặc ở pH kiềm (8,0) Trong phòng thí nghiệm, có thể bảo quản vi khuẩn lao trong nhiều năm Trong ñàm của bệnh nhân lao ñặt trong phòng tối, ẩm sau 3 tháng vi khuẩn lao vẫn tồn tại và giữ ñược ñộc lực

Vi khuẩn lao là loại vi khuẩn hiếu khí, khi phát triển vi khuẩn cần đủ oxy, cũng chính vì vậy vi khuẩn lao ở phổi là chiếm tỷ lệ lớn nhất

Vi khuẩn lao sinh sản chậm, trong điều kiện bình thường, trung bình 20-24 giờ sinh sản một lần và cĩ khi hàng tháng chúng mới sinh sản, thậm chí cĩ thể nằm ở vùng tổn thương rất lâu mà khơng sinh sản hay hoạt động khi gặp điều kiện thuận lợi thì chúng phát triển trở lại

1.3.3 Bộ gen của vi khuẩn lao

Bộ gen của vi khuẩn lao đã được giải trình tự vào năm 1998, cĩ chiều dài 4411522

bp trong đĩ cĩ 3924 bp trình tự được dự đốn là mã hĩa protein, tỷ lệ G + C chiếm đến 65,6% Bộ gen của vi khuẩn lao cĩ chứa tới 90,8 % trình tự mã hĩa protein và chỉ cĩ 6

gen giả [20]

Gen IS6110 phân bố rải rác nhiều nơi trong bộ gen ðây là đoạn gen cĩ tính bảo

tồn cao Các phương pháp PCR, real-time PCR phát hiện vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis đều dựa trên tín hiệu khuếch đại vùng gen này

Hình 1.3: Bộ gen của Mycobacterium tuberculosis

“Nguồn: http:/www.Clcbio.com”

1.4 Nguồn lây, ñường xâm nhiễm và diễn biến bệnh

1.4.1 Nguồn lây [6]

Tất cả các bệnh nhân lao ñều có thể là nguồn lây, nhưng mức ñộ rất khác nhau ðối với các thể lao ngoài phổi (lao màng não, lao màng bụng, xương khớp…) ñược gọi là các thể lao “kín”, vi khuẩn ít có khả năng lây nhiễm Ngược lại, lao phổi là thể bệnh dễ ñưa vi khuẩn ra bên ngoài Vì vậy lao phổi là nguồn lây quan trọng nhất Nhưng ngay ñối với bệnh lao phổi thì khả năng lây bệnh cũng khác nhau tùy thuộc vào lượng vi khuẩn trong ñàm Những bệnh nhân lao phổi trong ñàm có nhiều vi khuẩn gây bệnh khác nhau

có thể phát hiện bằng phương pháp nhuộm soi trực tiếp thì khả năng lây cho người khác gấp 2-10 lần các bệnh nhân lao phổi phải nuôi cấy mới phát hiện ñược vi khuẩn Những bệnh nhân này ñược xem là nguồn lây nguy hiểm nhất hay là nguồn lây chính Bệnh lao ở trẻ em không phải là nguồn lây quan trọng vì có tới 95% trẻ em mắc bệnh thì không tìm thấy vi khuẩn lao trong các mẫu bệnh phẩm

1.4.2 ðường xâm nhiễm [6]

Bệnh nhân lao phổi khi ho (hoặc hắt hơi) bắn ra các hạt rất nhỏ lơ lửng trong không khí, phân tán xung quanh người bệnh, người lành khi hít các hạt này khi thở có thể

bị bệnh Ngoài ra vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể bằng ñường tiêu hóa gây lao ruột, ñường da gây lao da, niêm mạc gây lao mắt nhưng ít gặp Vi khuẩn lao cũng có thể lây nhiễm sang thai nhi bằng ñường máu qua tĩnh mạch rốn nếu mẹ bị lao cấp tính, hoặc nước

ối khi chuyển dạ ðường lây quan trọng nhất vẫn là ñường hô hấp

1.4.3 Diễn biến nhiễm bệnh [6]

Bệnh lao diễn biến qua hai giai ñoạn: nhiễm lao và bệnh lao

+ Nhiễm lao

Khi vikhuẩn xâm nhập vào phổi ñến phế nang sẽ kích thích các tế bào miễn dịch của cơ thể - chủ yếu là ñại thực bào vì ñộc lực cao nên sự tương tác giữa vi khuẩn và ñại thực bào không tiêu diệt ñược tất cả vi khuẩn, vi khuẩn tiếp tục phát triển nhân lên trong các tế bào này Sự thay ñổi về hình thể và chức năng của một số tế bào tại vùng bị tổn thương dần dần hình thành mang lao Trong ña số trường hợp tổn thương có thể tự khỏi (có hiện tượng lắng ñọng calci, hình thành nốt vôi) và không có biểu hiện lâm sàng Phản

ứng da với tuberculin bắt ñầu dương tính từ tuần thứ 3, sau khi vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể, nhưng miễn dịch ñầy ñủ của cơ thể chống lại bệnh lao phải sau 2-3 tháng

Như vậy nhiễm lao là giai ñoạn ñầu tiên khi vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể gây những tổn thương ñặc hiệu ða số trường hợp không có biểu hiện lâm sàng, cơ thể hình thành dị ứng và miễn dịch chống lao

+ Bệnh lao [6]

ðây là giai ñoạn vi khuẩn ñã vào máu và gây ra tổn thương tại các cơ quan trong

cơ thể Vi khuẩn lao có thể gián tiếp theo mạch bạch huyết ñến các nốt bạch huyết ở cuống phổi hoặc vùng trung thất và sau ñó theo hệ thống ống dẫn ở lồng ngực vào trong dòng máu, hoặc trực tiếp vào dòng máu từ hệ thống mạch máu ở vùng phổi có các u lao Khi ñã xâm nhập thành công vào dòng máu, chúng lan tỏa khắp cơ thể, tạo vô số ổ nhiễm, với biểu hiện là củ lao màu trắng ở mô

Khi vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể, chúng có thể sống tiềm ẩn, khi sức ñề kháng của cơ thể suy yếu thì chúng mới phát triển và tấn công gây bệnh Việc chuyển từ nhiễm lao sang bệnh lao phụ thuộc vào ba yếu tố chính: số lượng và ñộc tính của vi khuẩn lao, sức ñề kháng của cơ thể

Chương 2 BỆNH LAO KHÁNG THUỐC

2.1 Lịch sử bệnh lao kháng thuốc

Bệnh lao kháng thuốc lần ựầu tiên ựược xác ựịnh trong năm 2006 Bệnh ựược phát hiện ở 57 quốc qia và gây khó khăn ựiều trị Bệnh lao kháng thuốc phổ biến ở đông Âu, Liên Xô cũ, Trung Quốc và Ấn độ và ựang tăng lên ở châu Phi MDR-TB là viết tắt của nhiều bệnh lao kháng thuốc, nó kháng với hai trong số các loại thuốc bệnh lao hiệu quả nhất dòng ựầu tiên Lao XDR- kháng thuốc diện rộng bệnh lao, mô tả một hình thức cao

gây chết người của bệnh lao kháng thuốc [32]

2.2 Tình hình bệnh lao kháng thuốc

2.2.1 Trên thế giới

Tổ chức Y tế Thế giới mở cuộc khảo sát dựa vào số liệu của các phòng thắ nghiệm chuẩn trên thế giới Trong số 17.690 mẫu phân lập ựược từ năm 2000-2004 và từ nhiều quốc gia có 20% chủng kháng nhiều thuốc (MDR-TB), 2% chủng kháng thuốc diện rộng (XDR-TB) Lao kháng thuốc diện rộng xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới, nhiều nhất ở Hàn Quốc là nơi có ựiều tra dịch tễ về ựộ nhạy của vi khuẩn, đông Âu và Tây Á châu

Bệnh nhân bị lao kháng thuốc diện rộng có tỉ lệ tử vong cao hơn bệnh nhân khác [31]

Ở Hoa kỳ trong 169654 trường hợp lao từ năm 1993 ựến 2004 có 1.6% vi khuẩn kháng nhiều thuốc, 0,04% là kháng thuốc diện rộng Tuy bệnh lao ở Hoa kỳ giảm, số lao kháng nhiều thuốc tăng từ 113 trong năm 2003 lên 128 trong năm 2004 Tuy các con số ghi nhận ựược chưa thực sự phản ảnh tình hình lao kháng thuốc diện rộng vì các phòng thắ nghiệm Tại các quốc gia (trừ Hoa Kỳ, Hàn Quốc và Latvia) không thường xuyên xét nghiệm ựộ nhạy của vi khuẩn ựối với tất cả các thuốc trị lao loại 2, các phương pháp xét nghiệm lại khác nhau [31]

Hình 2.1: Tình hình bệnh lao kháng thuốc trên thế giới năm 2007

“Nguồn: www.thefullwiki.org”

Năm 2007 có 289000 ca lao kháng thuốc trong những ca nhiễm mới (chiếm 3.1% tổng số ca nhiễm lao mới) và 221000 ca lao kháng thuốc ñã từng ñiều trị trước ñó (chiếm 19% tổng số ca qua ñiều trị)

Riêng ở khu vực Tây Thái Bình Dương tỷ lệ kháng ña thuốc trong số những bệnh nhân nhiễm lao mới dao ñộng trong khoảng 0% ñến 10.8%

ðối với bệnh lao kháng thuốc thì người ta phân làm 2 nhóm: nhóm nhiễm mới, trải qua ñiều trị,

♦ Tỷ lệ kháng thuốc trong các ca nhiễm mới: kháng bất kỳ thuốc nào 17%, kháng isoniazid là 10.3% và MDR là 2.9%

♦ Tỷ lệ kháng thuốc trong các ca ñã trải qua ñiều trị: kháng bất kỳ thuốc nào 35%, kháng isoniazid là 27.7% và MDR là 15.3%

Ước tính trung bình

trên 100000 dân

Chưa thống kê

Biểu ñồ 2.1: Tỷ lệ kháng thuốc trong các ca ñã trải qua ñiều trị và nhiễm mới

100% cho 100000 dân

Theo số liệu bệnh nhân lao đăng ký điều trị lao tại TP HCM năm 2008, với tỷ lệ kháng đa thuốc (kháng ít nhất với Rifampicin và Isoniazid) vào khoảng 3.8% trong số bệnh nhân mới và trên 22% ở bệnh nhân lao tái điều trị

2.3 Tình hình nghiên cứu bệnh lao kháng thuốc

► Nghiên cứu thành cơng bộ kit đa mồi phát hiện lao kháng thuốc: [28]

Trên thế giới đã cĩ một số kít thương phẩm chẩn đốn nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc do nước ngồi sản xuất nhưng vì chưa cĩ dữ liệu nào về đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở Việt Nam nên khơng cĩ cơ sở để sử dụng Hơn nữa, các bộ kít do nước ngồi sản xuất hiện giá thành khá cao Do đĩ, việc nghiên cứu và phát triển kít chẩn đốn lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử là nhu cầu cấp thiết Tại Việt Nam trải qua một thời gian dài nghiên cứu, vào tháng 5 năm 2011, PGS-TS Nguyễn Thái Sơn, chủ nhiệm Bộ mơn Vi sinh Y học Bệnh viện 103 (Học viện Quân y - Bộ Quốc Phịng) và các cộng sự đã nghiên cứu thành cơng bộ kít đa mồi cĩ tên mPCR, giúp nâng cao hiệu quả chẩn đốn vi khuẩn lao Bộ kít đa mồi cĩ chứa các cặp mồi dùng phát hiện 3 gen đặc hiệu (IS6110, IS1081, 23S rDNA) của vi khuẩn lao trong cùng một phản ứng, trong khi kít nhập ngoại chỉ phát hiện một gen (IS6110) Do đĩ, kít đa mồi khơng bỏ sĩt chẩn đốn, đồng nghĩa với việc hạn chế nguy cơ lây nhiễm vi khuẩn lao ra cộng đồng, hạn chế biến chứng ở người bệnh và giúp kiểm sốt bệnh lao được tốt hơn Mặt khác giá thành dự kiến của bộ kit này chỉ bằng 1/2 so với kit nhập ngoại Với bộ kit này, các cơ sở

y tế cĩ thể phát hiện vi khuẩn lao trong vịng 24 giờ vì chúng đạt độ nhạy, độ đặc hiệu đến trên 90%

► Xét nghiệm bệnh lao phổi trong vịng 100 phút: [29]

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã đưa vào sử dụng trên tồn cầu thiết bị xét nghiệm mới cho phép chẩn đốn và phát hiện nhanh, chính xác bệnh lao phổi trong vịng 100 phút Giá thành thiết bị này sẽ được giảm 75% cho 116 nước thu nhập trung bình và thấp trên thế giới, mở ra triển vọng điều trị và kiểm sốt bệnh lao phổi hiệu quả ở cả những nước nghèo và chậm phát triển nhất thế giới

Xét nghiệm mới này được gọi là "xét nghiệm khuếch đại axít nucleic" (Nucleic acid amplification tests) được thử nghiệm lâm sàng trong 18 tháng đã chứng tỏ hiệu quả

chính xác trong chẩn đốn phát hiện sớm bệnh lao phổi, bệnh lao kháng nhiều thuốc (MDR-TB) và bệnh lao bội nhiễm HIV rất khĩ phát hiện

Phương pháp xét nghiệm mới cĩ hiệu quả cao gấp 3 lần so với xét nghiệm hiện hành, đặc biệt đối với các bệnh lao kháng thuốc và gấp 2 lần đối với bệnh lao bội nhiễm HIV Xét nghiệm Nucleic acid amplification tests kết hợp với cơng nghệ DNA hiện đại hồn tồn tự động và dễ sử dụng nên cĩ thể sử dụng bên ngồi các phịng xét nghiệm thơng thường

2.4 Vi khuẩn lao kháng thuốc

2.4.1 ðặc điểm giúp vi khuẩn lao cĩ khả năng kháng thuốc

Hình 2.3: Hình ảnh vách tế bào vi khuẩn lao

“Nguồn: http://en.wikipedia.org”

Vi khuẩn lao cĩ cấu trúc vỏ khá hồn hảo, giúp chống chịu tốt với nhiều điều kiện bất lợi Thành tế bào gồm các mycolic acid, chất sáp và các glycolipid chuỗi đơn Các mycolic acid cĩ cấu tạo mạch nhánh rất dài (C60 đến C90) gắn với các muramic acid của lớp peptidoglycan bằng những liên kết phosphodiester và liên kết với arabinogalactan bởi các nối glycolpid Mycolic acid đem lại nhiều chức năng cho vi khuẩn lao, giúp vi khuẩn

cĩ sức chịu đựng cao, làm tăng kháng thuốc do làm hư hại các hố chất, khử nước và ngăn chặn hiệu quả hoạt động của kháng sinh Nĩ làm cho vi khuẩn phát triển được bên trong đại thực bào và ẩn tránh hệ thống miễn dịch của chủ thể Hai thành phần quan trọng

Lipid

Polysaccharides

Phosphatidylinositol mannoside

Màng plasmaPeptidoglycan

Mycolic Lipoarabinomanna

Thành tế bào

xương

khác của tế bào là trehalose diumcolate (còn ñược gọi là yếu tố ràng buộc) và các sulfolipd Chúng ñóng vai trò khả năng sinh ñộc tính của vi khuẩn Bên cạnh hai yếu tố này, còn có thành phần lipoarabinomannan cũng tham gia vào khả năng sinh bệnh của vi khuẩn lao

Những khả năng ñặc biệt của thành tế bào vi khuẩn lao là chống mất nước, kháng acid và kiềm Khả năng kháng acid và kiềm này rất hữu ích trong việc cô lập các vi khuẩn lao từ các mẫu ñàm Xử lý mẫu ñàm bằng acid sulfuric hoặc sodium hydroxide sẽ cho phép vi khuẩn lao phát triển trên môi trường nuôi cấy mà không có các vi khuẩn ñường

hô hấp khác kèm theo

2.4.1 Vi khuẩn lao ñột biến gen kháng thuốc

Khả năng này xảy ra do ñột biến gen Vi khuẩn kháng rifampicin ñột biến ở gen proB mã hóa tổng hợp RNA-polymerase Vi khuẩn kháng iosoniazid ñột biến gen KatG, InhA, ahpC Vi khuẩn kháng srteptomycin và các amynoglycozid, ñột biến ở gen rrS, rpsL hoặc cả 2 gen này Vi khuẩn kháng pyrazinamid ñột biến ở gen pncA

Hình 2.4: ðột biến trong vùng 81 bp codon 507-533 gen rpoB

“Nguồn: http://www.cdc.gov”

Hơn 90% ñột biến trong vùng 81 bp codon 507-533 gen rpoB Ba dạng phổ biến nhất: Ser531 Leu, His526 Tyr, Asp516 Val

Hình 2.5 : Vùng khả năng bị ñột biến

“Nguồn: http://www.cdc.gov”

Một loại amino acid thay thế trong 81 bp khu vực lõi của gen chịu trách nhiệm trao rpoB rifampicin (RIF) kháng (chèn và xóa bỏ mà trao kiểu hình RIF kháng không mô tả) Axit amin là ñại diện với tên viết tắt chữ cái Thay ñổi codon Ser531 và tài khoản His526 hơn 70% của các ñột biến kháng với RIF (Hình 2.5)

Hầu hết các ñột biến ñược xác ñịnh là giới hạn cho một vùng lõi 81-bp và ñược thống trị bởi những thay ñổi ñơn nucleotide, kết quả là thay thế acid amin ñơn lẻ, mặc dù xóa bỏ inframe và chèn cũng xảy ra ở tần số thấp hơn Thay ñổi trong codon Ser531 và His526 ñã ñược ghi nhận trong hơn 70% của các phân lập RIF kháng Một số rất ít ñột biến trong RIF chống phân lập bản ñồ không trong khu vực này 81 bp cốt lõi

Hình 2.6 ðột biến trong codon Ser95

“Nguồn: http://www.cdc.gov”

Một amino acid thay thế chịu trách nhiệm trao kháng fluoroquinolones (fq) ðột biến trong codon Ser95 (thể hiện trong hộp chấm), quan sát thấy trong cả hai fq nhạy cảm

và fq chống phân lập (Hình 2.6)

Gen KatG và tính kháng thuốc isoniazid ở vi khuẩn lao

Gen katG là một ñoạn DNA có kích thước 2223 bp, nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao và chịu trách nhiệm mã hóa cho enzyme catalase -peroxidase Người ta nhận thấy có khoảng 95% các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid có ñột biến trên gen này

[20]

Gen katG mã hóa cho enzyme catalase-peroxidase Enzyme này hoạt hóa isoniazid bằng cách kết hợp axyl isonicotinic với NADH ñể tạo thành phức hệ axyl isonicotinic- NADH Phức hệ này liên kêt chặt chẽ với enzyme ketoenoylreductase (mã hóa bởi gen InhA), theo ñó làm ngăn cản cơ chất enoyl- AcpM Quá trình này làm ức chế sự tổng hợp axit mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao Cơ chế phân tử của tính kháng isoniazid chủ yếu có liên quan tới ñột biến thêm ñoạn/mất ñoạn hoặc các ñột biến nhầm nghĩa/vô nghĩa, trong ñó chủ yếu diễn ra tại codon 315 và 463 (S315T) cả gen katG mã hóa catalase-peroxidase Nếu có sự biến dạng hay ñột biến ở base thứ 2 tạicodon 315 cả gen katG (AGC biến thành ACC hay ACA) sẽ dẫn ñến làm giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính cả enzyme catalase-peroxidase do ñó vi khuẩn lao sẽ trở thành kháng thuốc isoniazid

[11]

Gen rpoB của vi khuẩn lao khả năng ñề kháng rifampin (RIF)

Các nghiên cứu nhiều năm gần ñây cho thấy khả năng ñề kháng rifampin (RIF),một trong các thuốc trị lao chính, liên quan ñến gene rpoB của vi khuẩn lao, chính xác là các ñột biến trên vùng lõi gồm 81 bp của gen rpoB RIF ngăn cản quá trình phiên mã bằng cách gắn lên RNA polymerase RNA polymerase gồm có 4 tiểu phần khác nhau (α, β, β’

và σ).Các tiểu phần này ñược mã hóa bởi các gene rpoA, rpoB, rpoC và rpoD RIF gắn lên tiểu phần β của RNA polymerase và bằng cách này RIF giết chết vi khuẩn Trên 95% khả năng kháng rifampin liên quan ñến các ñột biến trong vùng lõi gồm 81 bp của gen rpoB ở các vi khuẩn lao, tại codon 507 ñến codon 533 với sự thay ñổi thường nhất là ở

codon 516: Asp-516-Val (GAC thành GTC) [12],[13]

Gen emb của vi khuẩn lao khả năng ñề kháng Ethambutol (EMB) là một thuốc thay thế cho streptomycin và thường ñược dùng kết hợp vớI 3 loại thuốc quan trọng khác

là isoniazid, rifampin and pyrazinamide