4. Phương pháp nghiên cứ u
3.2.3. Phương pháp Real-time PCR
3.2.3.1. Khái niệm phương pháp Real-time PCR
Trong những phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc, bằng cách điện di DNA trên gel agarose khi phản ứng kết
thúc. Ngược lai, real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuyếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra, đĩ là ý nghĩa của cụm từ “real-time”.
3.2.3.2. Nguyên tắc hoạt động
Hiện nay cĩ bốn kiểu phản ứng được sử dụng trong kỹ thuật real-time với độ
nhạy tương đương. Cả bốn phương pháp đều sử dụng chất nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye), cĩ sự kết hợp bước nhân bản và phát hiện sản phẩm PCR mục tiêu theo thời gian thật (real-time) của phản ứng. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng một chất hĩa học phát huỳnh quang cĩ khả năng gắn vào mọi phân tử DNA mạch đơi. Ba phương pháp cịn lại sử dụng các probe cĩ đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang để lai đặc hiệu với sản phẩm PCR mục tiêu.
Phản ứng real-time PCR được thực hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang báo hiệu sự gia tăng lượng DNA tỷ lệ với sự gia tăng lượng tín hiệu
huỳnh quang. Những hĩa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và
những trình tự gắn huỳnh quang liên kết với các đoạn oligonucleotide gọi là mẫu dị. Những máy luân nhiệt đặc biệt trang bị bộ phận phát huỳnh quang, được sử dụng kiểm
sốt tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuyếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang được
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 33
3.2.3.3. Biểu đồ khuyếch đại Real-time PCR [8]
Cường độ huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng bản sao DNA nên sẽ tăng gấp
đơi theo cấp số nhân của lượng bản sao DNA sau mỗi chu kỳ. Cĩ thể gọi đây là “giai
đoạn lũy thừa” về cường độ huỳnh quang.
Do phản ứng đến giai đoạn kết thúc thì dNTP sẽ cạn dần và enzyme polymerase sẽ khơng hoạt động nữa.
Chu kỳ ngưỡng là thời điểm máy ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang và bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền. Baseline là đường cắt ngang đi qua cường độ huỳnh quang nền.
Chu kỳ ngưỡng được xác định bẳng số chu kỳ mà ở đĩ đường nền (Baseline cắt
đường biểu diễn khuếch đại.
Biểu đồ 3.1: Biểu đồđường biểu diễn khuếch đại ““Nguồn:www.vietacorp.com”
Biểu đồđường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ các
eppendorf phản ứng khi nhận được ánh sánh kích thích vào mỗi chu kỳ nhiệt.
Cường độ huỳnh quang Giai đoạn ủ Pha lũy thừa Giai đoạn bình nguyên ðường biểu diễn khuyếch đại Cường độ huỳnh quang nền
ðường nền(base) line)
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 34
3.2.3.4. Ưu điểm và nhược điểm
- Ưu điểm:
Phương pháp này cho phép xác định số lượng bản sao khuơn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhạy cao. Kết quả real-time PCR cĩ thể là kết quả định tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự DNA) hay định lượng (số lượng bản sao DNA). Real-time PCR sử dụng định lượng được gọi là PCR định lượng, ngược lại PCR truyền thống chỉ được xem là bán định lượng. Thêm vào đĩ, dữ liệu real-time PCR cĩ thể được đánh giá mà
khơng cần phải điện di trên gel, giúp tiết kiệm thời gian và gia tăng số lượng thí nghiệm thưc hiện. Cuối cùng, việc tiến hành phản ứng và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống ống
đĩng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản ứng khuếch đại.
- Nhược điểm:
Phương pháp này cĩ nhược điểm là chi phí cho việc phát hiện bệnh và đầu tư trang thiết bị máy mĩc cao.
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 35 Chương 4
QUY TRÌNH PHÁT HIỆN LAO KHÁNG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 36
4.1. Giới thiệu quy trình
Kit phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc được xây dựng dựa trên phương pháp real- time PCR sử dụng mẫu dị (probe) Taqman đặc hiệu cho MTB nhằm phát hiện DNA của MTB trong mẫu đàm, mẫu dịch hoặc sinh thiết của bệnh nhân. Trong phương pháp này, mỗi bản sao của trình tự mục tiêu được nhân bản sẽ tương ứng với một tín hiệu huỳnh quang được đầu dị máy ghi nhận. như vậy, số lượng bản sao trình tự mục tiêu MTB tạo ra ở từng thời điểm sẽđược ghi nhận chính xác trong suốt quá trình PCR. Quy trình được thực hiện gồm 3 bước:
•Xử lý mẫu và tách chiết DNA
•Nhân bản DNA bằng real-time PCR
•ðọc kết quả
4.2. Vật liệu, hĩa chất và thiết bị
4.2.1. Vật liệu sinh học
- Mẫu chứng dương
- Ống cĩ chứa mẫu đàm, các chất sinh dịch, mẫu sinh thiết của người bệnh.
4.2.2. Mồi và mẫu dị
Các hệ mồi và mẫu dị nhằm phát hiện các kiểu đột biến: - KatG 315/AGC-> ACC là loại kháng isoniazid.
- RpoB 516/GAC-> GTC là loại kháng rifampicin.
- Emb 306/ATG->GTG/CTG/ATA/ATC/ATT là loại kháng Ethambutol(EMB) là một thuốc thay thế cho streptomycin và thường được dùng kết hợp với 3 loại thuốc quan trọng khác là isoniazid, rifampin and pyrazinamide được thống kê dưới bảng.
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 37 Bảng 4.1: Các mồi và mẫu dị được sử dụng “Nguồn:www.vietacorp.com” Tên Chức năng Trình tự Chiều dài (bp) Kích thước sản phẩm PCR (bp)
KatG 315F Mồi xuơi 5'-TGCTCCGCTGGAGCAGATG-3' 19 92
KatG 315R Mơi ngược 5'-ATACGACCTCGATGCCGG*-3' 18
KatG315 Mẫu dị
5'-FAM
AAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCG- TAMRA-3'
25
RpoB 516F Mồi xuơi 5'- GCTGAGCCAATTCATGGT**-3' 18
RpoB 516R Mơi ngược 5’- GCACGCTCACGTGACAGA-3’ 18 99
RpoB516 Mẫu dị 5'- FAM CCGCTGTCGGGGTTGACCCACA-
TAMRA-3' 23
Emb 306F1 Mồi xuơi 5'- ACGGCTACATCCTGGGCG* -3' 18 Emb 306F2 Mồi xuơi 5'- ACGGCTACATCCTGGGCC **-3' 18
Emb 306R12 Mơi ngược 5'- ATCCTCCGGGCTGCCGAA-3' 18 90
Emb306-12 Mẫu dị 5'- FAMCGCCGGCTACATGTCCAACTATTTC- TAMRA-3' 25 Emb 306F345 Mồi xuơi 5'- CCTGCTCTGGCATGTCATCG-3' 20
Emb 306R3 Mơi ngược 5'- GGTCGGCGACTCGGGCT ***-3' 17 74 Emb 306R4 Mơi ngược 5'- GGT CGG CGA CTC GGG CG ****-3' 17 74 Emb 306R5 Mơi ngược 5'- GGT CGG CGA CTC GGG CA*****-3' 17 74
emb
306- 345 Mẫu dị 5'-FAMCGTCGGACGACGGCTACATCCTG-
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 38
* Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến (G_C) tại codon 315 (gene katG) nằm trên
đầu 3' của mồi ngược.
** Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến (A_T) (gene rpoB) ) nằm trên đầu 3' của mồi xuơi.
* Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến (A_G) tại codon 306 (gene emb) nằm trên
đầu 3' của mồi xuơi.
** Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến (A_C) tại codon 306 (gene emb) nằm trên đầu 3' của mồi xuơi.
*** Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến (G_A) tại codon 306 (gene emb) nằm trên đầu 3' của mồi ngược.
**** Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến (G_C) tại codon 306 (gene emb) nằm trên đầu 3' của mồi ngược.
***** Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến (G_T) tại codon 306 (gene emb) nằm trên đầu 3' của mồi ngược.
Giải trình tự: ðoạn DNA của các gen katG 315/AGC-> ACC, rpoB516/GAC-> GTC và emb 306/ATG->GTG/CTG/ATA/ATC/ATT được khuếch đại bằng các đoạn mồi tương ứng. Sau đĩ sản phẩm sẽđem tới cơng ty tinh sạch và giải trình tự.
4.2.3. Thiết bị, dụng cụ
Các thiết bị dụng cụ
B. Máy Stratagene Mx3000P (máy real-time PCR) A. Máy ly tâm thu huyết thanh
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 39
E. Các loại eppendorf thơng dụng
G. Micropipette
Hình 4.1. Các thiết bị và dụng cụ trong quy trình
“Nguồn:www.vietacorp.com”
4.2.4. Hĩa chất
Hĩa chất cho tách chiết DNA:
• Dung dịch (1) (Trizol) gồm: phenol 38%, guanidine thyocianat 0.8M, glycerol 5%, pH 8.0.
• Dung dịch (2): Chlorofrom
• Dung dịch (3): Isopropanol tuyệt đối cĩ chứa chất trợ tủa.
• Dung dịch (4): Ethanol 70%.
• Dung dịch (5): dung dịch TE 1X (Tris 0.1M – EDTA 0.001M).
Hĩa chất trong real-time PCR:
C. Máy vortex C. Máy ly tâm
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 40
• Real-time PCR mix. Thành phần của 1 phản ứng real-time PCR 25µl gồm: dung dịch đệm (buffer) 1X, dNTP 200µM, Taq DNA polymerase 0.625 unit,
MgCl2 1.5mM, DNA bản mẫu, nước cất vơ trùng, mồi và mẫu dị. Chứng dương: 100µl
Chứng âm: 1.5ml