4. Phương pháp nghiên cứ u
2.4.1 Vi khuẩn lao đột biến gen kháng thuố c
Khả năng này xảy ra do đột biến gen. Vi khuẩn kháng rifampicin đột biến ở gen proB mã hĩa tổng hợp RNA-polymerase. Vi khuẩn kháng iosoniazid đột biến gen KatG, InhA, ahpC. Vi khuẩn kháng srteptomycin và các amynoglycozid, đột biến ở gen rrS, rpsL hoặc cả 2 gen này. Vi khuẩn kháng pyrazinamid đột biến ở gen pncA.
Hình 2.4: ðột biến trong vùng 81 bp codon 507-533 gen rpoB
“Nguồn: http://www.cdc.gov”
Hơn 90% đột biến trong vùng 81 bp codon 507-533 gen rpoB. Ba dạng phổ biến nhất: Ser531 Leu, His526 Tyr, Asp516 Val.
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 22
Hình 2.5 : Vùng khả năng bịđột biến “Nguồn: http://www.cdc.gov”
Một loại amino acid thay thế trong 81 bp khu vực lõi của gen chịu trách nhiệm trao rpoB rifampicin (RIF) kháng (chèn và xĩa bỏ mà trao kiểu hình RIF kháng khơng mơ tả). Axit amin là đại diện với tên viết tắt chữ cái. Thay đổi codon Ser531 và tài khoản His526 hơn 70% của các đột biến kháng với RIF (Hình 2.5).
Hầu hết các đột biến được xác định là giới hạn cho một vùng lõi 81-bp và được thống trị bởi những thay đổi đơn nucleotide, kết quả là thay thế acid amin đơn lẻ, mặc dù xĩa bỏ inframe và chèn cũng xảy ra ở tần số thấp hơn. Thay đổi trong codon Ser531 và His526 đã được ghi nhận trong hơn 70% của các phân lập RIF kháng. Một số rất ít đột biến trong RIF chống phân lập bản đồ khơng trong khu vực này 81 bp cốt lõi.
Hình 2.6. ðột biến trong codon Ser95 “Nguồn: http://www.cdc.gov”
Một amino acid thay thế chịu trách nhiệm trao kháng fluoroquinolones (fq). ðột biến trong codon Ser95 (thể hiện trong hộp chấm), quan sát thấy trong cả hai fq nhạy cảm và fq chống phân lập (Hình 2.6).
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 23
Gen KatG và tính kháng thuốc isoniazid ở vi khuẩn lao
Gen katG là một đoạn DNA cĩ kích thước 2223 bp, nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao và chịu trách nhiệm mã hĩa cho enzyme catalase -peroxidase. Người ta nhận thấy cĩ khoảng 95% các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid cĩ đột biến trên gen này.
[20]
Gen katG mã hĩa cho enzyme catalase-peroxidase. Enzyme này hoạt hĩa isoniazid bằng cách kết hợp axyl isonicotinic với NADH để tạo thành phức hệ axyl isonicotinic- NADH. Phức hệ này liên kêt chặt chẽ với enzyme ketoenoylreductase (mã hĩa bởi gen InhA), theo đĩ làm ngăn cản cơ chất enoyl- AcpM. Quá trình này làm ức chế sự tổng hợp axit mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao. Cơ chế phân tử của tính kháng isoniazid chủ yếu cĩ liên quan tới đột biến thêm đoạn/mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/vơ nghĩa, trong đĩ chủ yếu diễn ra tại codon 315 và 463 (S315T) cả gen katG mã hĩa catalase-peroxidase. Nếu cĩ sự biến dạng hay đột biến ở base thứ 2 tạicodon 315 cả
gen katG (AGC biến thành ACC hay ACA) sẽ dẫn đến làm giảm hoặc mất hồn tồn hoạt tính cả enzyme catalase-peroxidase do đĩ vi khuẩn lao sẽ trở thành kháng thuốc isoniazid.
[11]
Gen rpoB của vi khuẩn lao khả năng đề kháng rifampin (RIF)
Các nghiên cứu nhiều năm gần đây cho thấy khả năng đề kháng rifampin (RIF), một trong các thuốc trị lao chính, liên quan đến gene rpoB của vi khuẩn lao, chính xác là các đột biến trên vùng lõi gồm 81 bp của gen rpoB. RIF ngăn cản quá trình phiên mã bằng cách gắn lên RNA polymerase. RNA polymerase gồm cĩ 4 tiểu phần khác nhau (α, β, β’ và σ).Các tiểu phần này được mã hĩa bởi các gene rpoA, rpoB, rpoC và rpoD.RIF gắn lên tiểu phần β của RNA polymerase và bằng cách này RIF giết chết vi khuẩn. Trên 95% khả năng kháng rifampin liên quan đến các đột biến trong vùng lõi gồm 81 bp của gen rpoB ở các vi khuẩn lao, tại codon 507 đến codon 533 với sự thay đổi thường nhất là ở
codon 516: Asp-516-Val (GAC thành GTC). [12],[13]
Gen emb của vi khuẩn lao khả năng đề kháng Ethambutol (EMB) là một thuốc thay thế cho streptomycin và thường được dùng kết hợp vớI 3 loại thuốc quan trọng khác là isoniazid, rifampin and pyrazinamide.
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 24
Emb ở vi khuẩn lao gồm 3 gene sắp xếp theo trật tự embC– embA– embB mã hĩa cho 3 enzyme arabinosyl transferases tương đương. Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng đột biến trên gen emb, đặc biệt tại codon 306 (embB306) đĩng vai trị chính cho sự
kháng EMB. Cĩ 5 đột biến khác nhau đã được xác định ở codon emb306 và chúng thường chỉ xảy ra ở base đầu tiên và base thứ 3 của codon này (ATG thành GTG, CTG, ATA, ATC hoặc ATT) và kết quả là Met306 cĩ thể bị thay thế bởi Val, Leu hay Ile. [16], [19],
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 25 Chương 3
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 26
3.1. Các phương pháp chẩn đốn bệnh lao cổđiển
3.1.1 Chẩn đốn lâm sàng
Là bước đầu tiên trong chẩn đốn bệnh lao, thơng qua xem xét và các biểu hiện như: sốt nhẹ về chiều, ra mồ hơi đêm, chán ăn, mệt mỏi, gầy sút cân, ho, khạc đàm, ho ra máu, đau ngực, khĩ thở. Song các dấu hiệu trên khơng đặc trưng cho bệnh lao, cần tiến hành thêm các phương pháp chẩn đốn khác để xác định chính xác.
3.1.2. Phương pháp nhuộm soi đàm
Thơng thường phương pháp này tiến hành lấy mẫu bệnh phẩm như: 1 mẫu tại chỗ,1 mẫu vào sáng sớm hơm sau và 1 mẫu tại chỗ khi đã đem 2 mẫu kia đến. Mẫu được tiến hành nhuộm với thuốc nhuộm cĩ chứa fucshin.
Cĩ 2 phương pháp nhuộm fucshin: Ziehl-Nielson và Kinyoun. Chỉ cĩ các tế bào AFB bắt màu với thuốc nhuộm fucshin (màu đỏ với phương pháp ziehl-Nielson và màu vàng với phương pháp Kinyoun). Kết quả được quan sát dưới kính hiển vi.
Phương pháp này giúp phát hiện khuẩn lao nhanh chĩng. Tuy nhiên, nĩ tỏ ra khơng đặc hiệu vì khơng chỉ các tế bào vi khuẩn lao bắt màu với thuốc nhuộm mà tất cả
các lồi kháng acid, cồn đều cĩ khả năng bắt màu tương tự.
3.1.3. Phương pháp nuơi cấy tìm khuẩn lao
Mẫu bệnh xử lý bằng N-Acetyl-L-Cystein (NALC) và NaOH sau đĩ cấy vào mơi trường chọn lọc, tùy theo yêu cầu mà ta chọn mơi trường đặc hay lỏng Mycobacteria
Growth Indicator Tube (MGIT). Nuơi cấy trong mơi trường đặc cho kết quả 6-8 tuần, nuơi cấy trong mơi trường lỏng cho kết quả nhanh hơn là khoảng 10 ngày.
Phương pháp này cĩ nhược điểm tốn thời gian hơn các phương pháp khác.
3.1.4. Phương pháp X-quang phổi
Hình 3.1: Hình ảnh lao chụp X-quang “Nguồn: http://www.michigan.gov”
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 27
Hiện thị thâm nhiễm, nốt, xơ hang, hay co kéo ở nửa trên của phế trường, cĩ thể 1 bên hay 2 bên. Với hình ảnh X-quang phổi, giúp bác sĩ nhận định bệnh lao dễ và cho thấy tình trạng bệnh.
Phương pháp này cĩ khuyết điểm là thể nhầm lẫn với các thể bệnh phổi.
3.1.5. Phương pháp thử phản ứng Tuberculin
Tuberculin là hỗn hợp protid, polysarcharid, lipid và các acid nucleiotid. Cĩ nhiều kỹ thuật làm phản ứng Tuberculin như rạch da, đâm nhiều mũi qua da, dán trên da…Sau
đĩ, tiêm 0,1 ml dung dịch Tuberculin vào trong da. Sau 72 giờ, đo đường kính nốt sần hình thành. Nếu kết quả lớn hơn 10mm trở lên coi là dương tính.
Tuy nhiên phương pháp này dễ cho kết quả dương tính giả do ảnh hưởng nhiều yếu tố như: cơ thể suy kiệt, nhiễm virus, dùng corticoid hoặc thuốc ức chế miễn dịch.
3.2. Các phương pháp chuẩn đốn bệnh lao hiện đại
3.2.1. Phương pháp ELISA
Dựa trên kết hợp đặc hiệu của kháng nguyên (KN) và kháng thể (KT), người ta sử
dụng kháng nguyên của vi khuẩn lao nhằm phát hiện kháng thể lao cĩ trong huyết thanh hoặc dịch não tủy của bệnh nhân.
Phương này cĩ độ nhạy và độ đặc hiệu tương đối cao nhưng cĩ khả năng xảy ra phản ứng chéo với Mycobacteria khơng điển hình.
Gồm 3 phương pháp chính: ELISA gián tiếp, Sandwich ELISA, ELISA cạnh tranh
3.2.1.1. ELISA gián tiếp
Gồm các bước chính:
Hình 3.2 : Phương pháp ELISA gián tiếp “Nguồn: http://tusach.thuvienkhoahoc.com”
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 28
- Cố định kháng nguyên đã biết lên các đĩa. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết.
- Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên chưa biết được hịa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu kháng nguyên chuẩn.
- Thêm dung dịch protein khơng tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bị (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh cĩ tác dụng ngăn cản sự hấp phụ
của các protein khác lên bề mặt của đĩa.
- Rửa bề mặt đĩa sau đĩ chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà khơng kết hợp với protein của huyết thanh.
- Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một kháng thể cịn dư (bước này cĩ thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện kháng nguyên đã gắn với enzyme).
- Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme cịn dư sẽđược loại bỏ.
- Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hĩa học (enzyme cĩ tác dụng như yếu tố khuyếch đại).
● Nhược điểm cơ bản: Bước cố định kháng nguyên khơng cĩ tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy kháng thể (cĩ nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của đĩa. Sandwich ELISA hạn chếđược nhược điểm này.
3.2.1.2. Sandwich ELISA:
Phương pháp được sử dụng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau:
(1) Chuẩn bị bề mặt cĩ gắn kháng thể.
(2) Khĩa tất cả những vị trí gắn kết khơng đặc hiệu trên bề mặt. (3) Phủ mẫu chứa kháng kháng nguyên cần xác định.
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 29
(5) Thêm các kháng thểđặc hiệu cho kháng nguyên cần chẩn đốn. (6) Thêm kháng thể thứ cấp đã được gắn với enzyme.
(7) Rửa đĩa, phần khơng gắn kết sẽ bị rửa trơi.
(8) Thêm cơ chất, enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu điện hĩa.
(9) ðo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hĩa... qua đĩ xác
định sự cĩ mặt và hàm lượng kháng thể.
♦ Các bước thường được thực hiện trong Sandwich ELISA: (1) Phủđĩa bằng kháng thể.
(2) Thêm mẫu cần xác định kháng nguyên, kháng nguyên (nếu cĩ) sẽ gắn với kháng thể.
(3) Kháng thể dùng để phát hiện được thêm vào và kết hợp với kháng nguyên. (4) Thêm kháng thể thứ cấp liên kết với enzyme. Kháng thể thứ cấp sẽ gắn với kháng thểđể phát hiện.
(5) Thêm cơ chất. Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu cĩ thể phát hiện và đo được.
Hình 3.3 : Các bước trong phương pháp Sandwich ELISA “Nguồn: http://tusach.thuvienkhoahoc.com”
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 30
3.2.1.3. ELISA cạnh tranh:
(1) "Ủ" kháng thể khơng được đánh dấu với kháng nguyên.
(2) ðưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm cĩ chứa kháng nguyên.
(3) Rửa đĩa, kháng thể khơng được gắn kết sẽ bị rửa trơi. Lượng kháng nguyên càng lớn, lượng kháng thể gắn thành cơng với kháng nguyên trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh".
(4) Thêm kháng thể thứ cấp (kháng thể của kháng thểở bước 1). Kháng thể thứ cấp gắn với enzym.
(5) Thêm cơ chất. Lượng enzym cịn dư sẽ giải phĩng tín hiệu hỳnh quang hay tín hiệu màu.
Trong phương pháp này, hàm lượng kháng nguyên gốc càng cao, tín hiệu sản sinh càng yếu.
Một số trường hợp, enzym được gắn với kháng nguyên chứ khơng phải kháng thể.
3.2.2. Phương pháp PCR [33]
3.2.2.1. Nguyên tắc
Phản ứng PCR bao gồm một chuỗi những chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ thường gồm 3 giai đoạn:
• Giai đoạn biến tính : Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nĩng chảy (Tm) của phân tử, thường là 94 - 950C trong vịng 30 giây – 1 phút, làm cho phân tử
DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn, chính hai mạch đơn này đĩng vai trị là mạch khuơn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới.
• Giai đoạn lai : Trong bước này, nhiệt độđược hạ thấp (thấp hơn nhiệt độ nĩng Tm của các mồi), cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuơn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ
này tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng, dao động từ 40 – 700C, kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
• Giai đoạn kéo dài : Tổng hợp mạch DNA mới nhờ sự hoạt động của DNA polymerase, nhiệt độđược tăng lên đến 720C, là nhiệt độ tối ưu cho Taq DNA polymerase
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 31
hoạt động. Thời gian tổng hợp tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích sẽ được nhân bản thành hai bản sao, và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 – 40 lần thì từ một DNA đích sẽ được nhân bản thành 230 - 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao.
3.2.2.2 Các thành phần trong phản ứng PCR
a) Enzyme
Ngày nay cĩ rất nhiều Emzyme polymerase chịu nhiệt khác nhau đã được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên biệt hay hồn thiện hơn.
Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn sống ở các suối nước nĩng – Thermus aquaticus. Enzyme này khơng bị phá hủy ở nhiệt
độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từđầu đến cuối quá trình phản ứng. b) Dung dịch đệm (PCR buffer)
Dung dịch đệm cĩ tác dụng cung cấp lực ion (inonic strength) cần thiết cho phản
ứng xảy ra, tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR. Nồng độ, pH của dung dịch đệm cũng như nồng độ KCl tối ưu thường tùy thuộc vào nguồn DNA polymerase sử dụng, khơng cĩ một quy luật chung cho vấn đề này.
c) MgCl2
Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Mg2+ là Co–factor của Taq polymerase nên nếu lượng Mg2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ khơng thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài, hạn chế quá trình kéo dài. Ngược lại, nếu nồng độ quá cao dễ gây khuếch đại ký sinh. Do đĩ, nồng độ MgCl2 sử dụng cần được tối ưu hĩa cho từng hệ thống PCR cụ thể. Thơng thường, MgCl2được sử dụng ở nồng độ từ 1,5 mM – 4 mM.
d) Nồng độ các dNTP (deoxynucleotide triphotphat)
Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20 – 200 µM/mỗi loại. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”, làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR. Nếu nồng độ các loại nucleotide khơng đồng đều mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm gia tăng khả năng sao chép sai lệch của DNA polymerase.
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 32
e) Mồi
Mồi là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả
cũng nhưđộ chuyên biệt của phản ứng PCR. Do đĩ, cơng việc thiết kế mồi sẽđĩng vai trị then chốt quyết định sự thành cơng của quy trình PCR.
f) DNA mạch khuơn
Phản ứng PCR cần lượng DNA ban đầu đưa vào thường khơng quá cao, thậm chí chỉ cần một phân tử DNA ban đầu cho một phản ứng. Tuy nhiên, nồng độ DNA tốt nhất sử dụng trong phản ứng PCR ở khoảng 105 bản sao/ phản ứng.