4. Phương pháp nghiên cứ u
3.2.2.Phương pháp PCR
3.2.2.1. Nguyên tắc
Phản ứng PCR bao gồm một chuỗi những chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ thường gồm 3 giai đoạn:
• Giai đoạn biến tính : Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nĩng chảy (Tm) của phân tử, thường là 94 - 950C trong vịng 30 giây – 1 phút, làm cho phân tử
DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn, chính hai mạch đơn này đĩng vai trị là mạch khuơn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới.
• Giai đoạn lai : Trong bước này, nhiệt độđược hạ thấp (thấp hơn nhiệt độ nĩng Tm của các mồi), cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuơn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ
này tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng, dao động từ 40 – 700C, kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
• Giai đoạn kéo dài : Tổng hợp mạch DNA mới nhờ sự hoạt động của DNA polymerase, nhiệt độđược tăng lên đến 720C, là nhiệt độ tối ưu cho Taq DNA polymerase
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 31
hoạt động. Thời gian tổng hợp tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích sẽ được nhân bản thành hai bản sao, và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 – 40 lần thì từ một DNA đích sẽ được nhân bản thành 230 - 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao.
3.2.2.2 Các thành phần trong phản ứng PCR
a) Enzyme
Ngày nay cĩ rất nhiều Emzyme polymerase chịu nhiệt khác nhau đã được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên biệt hay hồn thiện hơn.
Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn sống ở các suối nước nĩng – Thermus aquaticus. Enzyme này khơng bị phá hủy ở nhiệt
độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từđầu đến cuối quá trình phản ứng. b) Dung dịch đệm (PCR buffer)
Dung dịch đệm cĩ tác dụng cung cấp lực ion (inonic strength) cần thiết cho phản
ứng xảy ra, tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR. Nồng độ, pH của dung dịch đệm cũng như nồng độ KCl tối ưu thường tùy thuộc vào nguồn DNA polymerase sử dụng, khơng cĩ một quy luật chung cho vấn đề này.
c) MgCl2
Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Mg2+ là Co–factor của Taq polymerase nên nếu lượng Mg2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ khơng thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài, hạn chế quá trình kéo dài. Ngược lại, nếu nồng độ quá cao dễ gây khuếch đại ký sinh. Do đĩ, nồng độ MgCl2 sử dụng cần được tối ưu hĩa cho từng hệ thống PCR cụ thể. Thơng thường, MgCl2được sử dụng ở nồng độ từ 1,5 mM – 4 mM.
d) Nồng độ các dNTP (deoxynucleotide triphotphat)
Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20 – 200 µM/mỗi loại. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”, làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR. Nếu nồng độ các loại nucleotide khơng đồng đều mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm gia tăng khả năng sao chép sai lệch của DNA polymerase.
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 32
e) Mồi
Mồi là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả
cũng nhưđộ chuyên biệt của phản ứng PCR. Do đĩ, cơng việc thiết kế mồi sẽđĩng vai trị then chốt quyết định sự thành cơng của quy trình PCR.
f) DNA mạch khuơn
Phản ứng PCR cần lượng DNA ban đầu đưa vào thường khơng quá cao, thậm chí chỉ cần một phân tử DNA ban đầu cho một phản ứng. Tuy nhiên, nồng độ DNA tốt nhất sử dụng trong phản ứng PCR ở khoảng 105 bản sao/ phản ứng.