LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ENTEROBACTER SAKAZAKII TRONG SỮA BỘT

Trong đó Vi khuẩn Enterobacter sakazakii là nguyên nhân gây ra các bệnh như viêm màng não, viêm ruột hoại tử để lại nhiều di chứng nghiêm trọng về thần kinh và có thể gây chết người.. N

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ENTEROBACTER

SAKAZAKII TRONG SỮA BỘT

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : VƯƠNG MINH ĐẠTMSSV: 0811110013 Lớp: 08CSH1

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của tôi, với sự hỗ trợ

từ Giáo viên hướng dẫn Những số liệu trong các bảng biểu và hình ảnh phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi trong phần tài liệu tham khảo Ngoài ra, còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả, cơ quan tổ chức khác, và đề tài cũng được thể hiện trong phần tài liệu tham khảo Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng, cũng như kết quả khóa luận của mình

TP.HCM, ngày 4 tháng 7 năm 2011

Sinh viên

Vương Minh Đạt

LỜI CẢM ƠN

Trải qua ba năm học dưới mái trường đại học kỹ thuật công nghệ, được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, nay đã hoàn thành bài khóa luận tốt nghiệp Nhờ trong quá trình làm bài khóa luận, mà em đã học được nhiều kiến thức mà trước đó

em chưa hề biết

Em xin chân thành cám ơn các thầy cô khoa Môi trường và công nghệ sinh học, đã giúp đỡ em tận tình trong ba năm học vừa qua để hoàn thành khóa học Em xin cám ơn giáo viên hướng dẩn đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình làm bài khóa luận tốt nghiệp

Một điều không thể thiếu, đó chính là gia đình, cha mẹ đã động viên em, giúp em có thêm tinh thần, vượt qua được khó khăn về tinh thần, cũng như về vật chất Nhờ vậy, mà em có thể hoàn thành khóa học và hoàn thành bài khóa luận tốt nghiệp này

Ngoài thầy cô và gia đình ra, một điều quan trọng không thể thiếu, đó chính

là tập thể các bạn lớp 08CSH trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Chính nhờ các bạn, giúp đỡ động viên rất nhiều trong quá trình học tập, cũng như trong đời sống

Em xin chân thành cám ơn!!! TP.HCM, ngày 4 tháng 7 năm 2011

Sinh viên

Vương Minh Đạt

MỤC LỤC

Danh mục các từ viết tắt v

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Giá trị dinh dưỡng của sữa bột 2

2.1.1 Đường lactose 2

2.1.2 Protein 2

2.1.3 Chất béo 3

2.1.4 Chất khoáng 5

2.1.5 Vitamin 5

2.1.6 Các hợp chất khác 6

2.2 Các vi sinh vật gây hại trong sữa bột 6

2.2.1 Listeria monocytogenes 6

2.2.1.1 Giới thiệu 6

2.2.1.2 Phân loại 6

2.2.1.3 Đặc điểm 7

2.2.1.4 Yếu tố độc lực 7

2.2.1.5 Khả năng gây bệnh 8

2.2.1.6 Các thực phẩm liên quan 9

2.2.2 Escherichia Coli 9

2.2.2.1 Giới thiệu 9

2.2.2.2 Phân loại 9

2.2.2.3 Hình thái, cấu trúc 10

2.2.2.5 Khả năng gây bệnh 11

2.2.2.6 Các thực phẩm liên quan 12

2.3 Tổng quan về Enterobacter sakazakii 13

2.3.1 Lịch sử phát hiện 13

2.3.2 Phân loại 13

2.3.3 Đặc điểm 14

2.2.3.1 Đặc điểm chung .14

2.2.3.2 Đặc điểm sinh hóa 16

2.3.4 Cấu trúc 16

2.3.4.1 Thành tế bào 17

2.3.4.2 Màng sinh học 18

2.3.4.3 Tiên mao 19

2.3.5 Yếu tố độc lực 20

2.3.6 Cơ chế gây bệnh 21

2.2.6.1 Các nguồn nhiễm bệnh 21

2.2.6.2 Triệu chứng 21

2.2.7 Các biện pháp phòng và xử lí bệnh 22

2.2.7.1 Các biện pháp phòng bệnh 22

2.2.7.2 Xử lí bệnh 22

2.2.8 Tình hình nhiễm E sakazakii trong sữa bột 22

2.2.8.1 Việt Nam 22

2.2.8.2 Thế giới 23

CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ENTEROBACTER SAKAZAKII 3.1 Phương pháp truyền thống 25

3.1.1 Nguyên tắc 25

3.1.2 Môi trường nuôi cấy 25

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ 25

3.1.4 Lấy mẫu 25

3.1.5 Chuẩn bị mẫu thử 27

3.1.6 Quy trình phân tích 28

3.1.7 Cách tiến hành 29

3.1.7.1 Phần mẫu thử 29

3.1.7.2 Tiền tăng sinh 29

3.1.7.3 Tăng sinh chọn lọc 29

3.1.7.4 Phân lập Enterobacter sakazakii giả định 29

3.1.7.5 Khẳng định 30

3.1.8 Phân lập Enterobacter sakazakii trên môi trường vi sinh Brilliance Enterobacter sakazakii Agar 31

3.1.9 Phân lập Enterobacter sakazakii trên môi trường MacConkey 32

3.1.10 Khẳng định sinh hóa 33

3.1.10.1 Môi trường và thuốc thử trong thử nghiệm sinh hóa 33

3.1.10.2 Phép thử Oxydase 34

3.1.10.3 Phép thử L-Lysin decarboxylase, L-Ornithin decarboxylase 34

3.1.10.4 Phép thử L- arginin dihydrolase 34

3.1.10.5 Phép thử lên men các loại đường khác nhau 34

3.1.10.6 Phép thử chỉ sử dụng Citrate 34

3.1.10.7 Thử nghiệm Nitrate 35

3.1.10.8 Thử nghiệm ONPG 36

3.1.10.9 Thử nghiệm tính di động trên thạch mềm 37

3.1.9.10 Thử nghiệm VP (voges-proskauer) 38

3.2 Các phương pháp hiện đại 39

3.2.1 Phương pháp PCR 39

3.2.1.1 lịch sử phát triển 40

3.2.1.2 Nguyên tắc 40

3.2.1.3 Các thành phần tham gia vào quá trình PCR 41

3.2.1.4 Phương pháp xác định Enterobacter sakazakii bằng phản ứng PCR 43

3.2.2 Phương pháp real time PCR 46

3.2.2.2 Khái niệm và nguyên lí hoạt động 47

3.2.2.3 Phương pháp tiến hành 49

CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 52

4.2 Kiến nghị 53

Tài liệu tham khảo 55

PHỤ LỤC 56

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ATVSTP: An toàn Vệ sinh thực phẩm

FDA : Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ

TCVN: Tiêu chuẩn việt nam

PCR: Polymerase Chain Reaction

BPW: Buffered Pepton Water

mLST: Canh thang tryptoza lauryl sulfat cải biến

ESIATM : Môi trường phân lập Enterobacter sakazakii giả định

TSA: Tryptone Soya Agar

EE: Enrichment Enterobacteriaceae

ONPG: O-Nitrophenyl-p-D-galactopyranoside

MR-VP: Methyl red – Voges Proskauer

KIA: Kligler Iron Agar

TSI: Triple Sugar Iron Agar

PCR: Polymerase Chain Reaction

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Khối lượng đường lactose trong các loại sữa bột

Bảng 2.2 Thành phần chất béo có trong sữa bò

Bảng 2.3 Thành phần chất khoáng có trong sữa bột

Bảng 2.4 Các thành phần vitamin trong sữa

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Vi khuẩn Listeria monocytogenes

Hình 2.2: Vi khuẩn Escherichia Coli

Hình 2.3: Trẻ em bị viêm màng não do sử dụng sữa bột nhiễm E sakazakii Hình 2.4: E.sakazakii dưới kính hiển vi

Hình 2.5: Tế bào vi khuẩn E sakazakii

Hình 2.6: Cấu trúc tế bào Gram –

Hình 2.7: 5 bước phát triển của màng sinh học

Hình 2.8: Cấu trúc tiên mao

Hình 2.9: Hai loại sữa điển hình nhiễm E sakazakii

Hình 3.1: E sakazakii trong môi trường ESIA

Hình 3.2: E sakazakii trên môi trương thạch TSA

Hình 3.3: Khuẩn lạc Enterobacter sakazakii trên môi trường Brilliance

Enterobacter sakazakii Agar

Hình 3.4: E sakazakii trên môi trường Macconkey

Hình 3.5: Kết quả thử nghiệm nitratase (+) khi xuất hiện màu đỏ

Hình 3.6: Kết quả thử nghiệm ONPG (+) ống nghiệm màu vàng

Hình 3.7: Kết quả thử nghiệm VP ( Voges-Proskauer)

Hình 3.8: Cơ chế của phản ứng PCR

Hình 3.9: Kết quả sau khi điện di

Hình 3.10: Sơ đồ phát quang của Taqman-probe

Hình 3.11: Kết quả được đọc bằng máy real time 7500

Hình 3.12: Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của mồi và mẫu dò trên

gene OmpA của E sakazakii

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Trong xã hội hiện nay tình trạng ngộ độc thực phẩm ở trên thế giới và Việt Nam là rất cao Tình trạng này chưa có dấu hiệu dừng lại và càng ngày càng tăng Qua kiểm tra cho thấy hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm này là do vi sinh vật gây

ra Đây là điều đã được cảnh báo và đã có cách thức phòng ngừa nhưng vẫn xảy ra các vụ ngộ độc tập thể gây nguy hiểm và có thể dẫn đến tử vong

Trong đó Vi khuẩn Enterobacter sakazakii là nguyên nhân gây ra các bệnh

như viêm màng não, viêm ruột hoại tử để lại nhiều di chứng nghiêm trọng về thần

kinh và có thể gây chết người Tỷ lệ Enterobacter sakazakii gây tử vong ở bệnh

viêm màng não là 40-80% và viêm ruột hoại tử là 10-55% Nguyên nhân lây nhiễm

chủ yếu của loại vi khuẩn này là do sử dụng sữa bột bị nhiễm Enterobacter

Sakazakii

Xuất phát từ những lý do trên tôi đã tiến hành thực hiện bài khóa luận: “Qui

trình phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột” Để có cái nhìn tổng quan về

vi sinh vật này

1.2 Mục đích

Tìm hiểu về vi khuẩn Enterobacter sakazakii và qui trình phân lập và phát hiện E sakazakii trong sữa bột

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Tìm hiểu về giá trị dinh dưỡng của sữa bột và các mối nguy trong sữa bột

- Tìm hiểu tổng quan về E sakazakii

- Các qui trình phân lập E sakazakii

CHƯƠNG II : TỔNG QUAN 2.1 Giá trị dinh dưỡng của sữa bột

2.1.1 Đường lactose

Glucid của sữa là lactose hay còn gọi là đường sữa, trung bình mỗi 1 lít sữa bột có 50g Lactose là một disaccharide do một phân tử glucose liên kết với một phân tử galactose tạo thành, enzyme lactase phân hủy đường lactose thành monosacarit

Trong sữa đường lactose tồn tại dưới 2 dạng

 Dạng α-lactose mono hydrat C12H22O11H2O

 Dạng β-lactose anhydrous C12H22O11Ngoài ra trong sữa bò còn chứa các loại đường khác nhưng hàm lượng rất thấp

Bảng 2.1 khối lượng đường lactose trong các loại sữa bột[1]

Loại sữa bột Khối lượng lactose/100g bột

Enzyme do tuyến vú tiết ra hoặc do vi sinh vật trong sữa tổng hợp nên Sự

có mặt của enzyme là nguyên nhân gây ra biến đổi thành phần hóa học của sữa trong quá trình bảo quản, dẫn đến chất lượng sữa hư hỏng Nhưng một số loại enzyme trong sữa có khả năng kháng khuẩn như lactoperoxydase, lysozyme Hàm lượng vi sinh vật càng nhiều thì thành phần enzyme càng đa dạng, có 60 loại enzyme trong sữa

Lactoperoxidase: Enzyme này xúc tác phản ứng chuyển hóa oxy từ H2O2, đến các chất oxy hóa khác

Catalase: Enzyme này luôn có trong sữa do tuyến vú tiết ra, xúc tác phân hủy H2O2, thành nước và oxy tự do

Lipase: enzyme quan trọng nhất trong sữa,là một glycoprotein, xúc tác thủy phân liên kết ester trong cơ chất triglyceride

Protease: enzyme này xúc tác phân hủy protein Có 2 loại protease là : protease kiềm và protease axit

Ngoài ra còn có các loại enzyme khác như : phosphatase, phosphatase acid

2.1.3 Chất béo

Chất béo là một trong những thành phần quan trọng nhất của sữa Hàm lượng chất béo của sữa thay đổi trong một phạm vi khá rộng Có loại sữa ít

béo, khoảng 3g trong 100 ml sữa, có loại sữa nhiều chất béo khoảng 5-6g trong 100

ml sữa Đối với sữa bò hàm lượng béo khoảng 3.9%

Thông thường, chất béo chiếm khoảng 2,5 đến 6,0% thành phần sữa, tùy thuộc vào giống bò và chế độ dinh dưỡng Mỡ sữa tồn tại dưới dạng hạt nhỏ lơ lửng trong nước sữa

Trong thành phần chất béo của sữa có tới 20 loại acid béo khác nhau, trong đó 2/3 là acid béo no và còn lại là acid béo chưa no Trong số những acid béo trong sữa có khá nhiều acid béo dễ hòa tan trong nước (ví dụ acid caproic) Chất béo của sữa cũng dễ xảy ra những quá trình phân hủy làm thay đổi thành phần

và tính chất như quá trình thủy phân, quá trình oxy hóa,… làm giảm dần chất lượng của sữa và nhiều khi làm hỏng sữa

Ngoài chất béo thuộc nhóm lipid của sữa còn có phospholipide và một số chất khác nhưng hàm lượng không nhiều, phospholipide có khoảng 0.5-0.7g trong một lít sữa, trong đó chủ yếu là lexitin

Bảng 2.2 Thành phần chất béo có trong sữa bò

Thành phần

Hàm lượng

(% so với tổng khối lượng chất béo)

Ester của acid béo và cholesterol

Ester của acid béo và rượu cao phân tử

2.1.4 Chất khoáng

Hàm lượng chất khoáng trong sữa dao động từ 8-10g/l, các chất khoáng trong sữa dạng hòa tan hoặc dung dịch dạng keo dễ bị phá vỡ bởi nhiệt độ và pH các muối trong sữa đều ở dạng dễ đồng hóa

Các nguyên tố chiếm hàm lượng cao nhất là Ca, P, Mg, K,

Các nguyên tố khác như K, Na, Cl đóng vai trò là chất điện ly Và Zn, Al,

I, Cu, Mn, Ag… chúng cần thiết cho quá trình dinh dưỡng của con người

Bảng 2.3 Thành phần chất khoáng có trong sữa bột[1]

2.1.5 Vitamin

Tùy theo khả năng hòa tan trong nước hay trong chất béo ta tách vitamin trong sữa làm hai nhóm

 Vitamin hòa tan trong nước: B1, B2 B3 B5 B6 , C và H…

 Vitamin hòa tan trong chất béo A, D, E

Thành phần Khối lương/100g

Natri Muối Kali Magiê Canxi Photpho Kẽm Iôt Selen

560,0 mg 1426,9 mg 1710,0 mg 126,0 mg 1360,0 mg

980 mg 0,4 mg

130 µg

20 µg

Bảng 2.4 các thành phần vitamin trong sữa[1]

2.2.Các vi sinh vật gây hại trong sữa bột

2.2.1.Listeria monocytogenes

2.2.1.1 Giới thiệu

Trong vấn đề ngộ độc thực phẩm, bệnh Listeriosis do vi khuẩn Listeria

monocytogenes gây ra Nó là một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm

nguy hiểm nhất với 20-30% gây các bệnh nhiễm trùng dẫn đến tử vong

Ca đầu tiên bệnh Listeriosis phát hiện cách đây 70 năm, nhưng mãi đến

năm 1980 mới chính thức xác nhận bệnh do vi khuẩn Listeria monocytogenes gây ra

0,3 0,001 1,4 0,4 1,7 0,5

B6 B3 B5

C

H M

0,005

1

3

20 0,04 0,05

Hình 2.1 Vi khuẩn Listeria monocytogenes Các vi khuẩn chi Listeria bao gồm sáu loài khác nhau (L monocytogenes,

L ivanovii, L innocua, L welshimeri, L seeligeri, và L grayi) Cả hai L ivanovii

và L monocytogenes đều gây bệnh ở chuột, nhưng chỉ có L monocytogenes luôn

gắn liền với bệnh tật của con người

2.2.1.3 Đặc điểm

L monocytogenes là vi khuẩn gram dương (+), không sinh bào tử, yếm khí,

và có thể phát triển trong tế bào, có thể di chuyển thông qua các tiên mao ở nhiệt độ dưới 30oC nhưng trên 37oC thì không di chuyển được

Vi khuẩn L monocytogenes có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào

chủ (của bệnh nhân) và làm thay đổi một vài chức năng của tế bào trong chiều hướng có lợi cho vi khuẩn để chúng thoát khỏi hệ thống phòng vệ của cơ thể Nhờ vào chiến thuật này, vi khuẩn có thể dễ dàng vượt qua hàng rào của vùng ruột cũng như của một số bộ phận khác trong cơ thể

Nhóm khảo cứu Pháp cho biết vi khuẩn L monocytogenes sản xuất ra một

loại độc tố chuyên biệt có khả năng phá vỡ hệ thống SUMOYLATION tức là nguồn máy phòng vệ tối quan trọng của tế bào chủ

Ngày 15/2 trong tạp chí Thực nghiệm Y Khoa, tiến sĩ Laurel Lenz và đồng

sự đã công bố, đại thực bào bị Listeria xâm nhiễm phóng ra interferon αβ (IFN- αβ),

làm chúng và những tế bào miễn dịch lân cận không thể đáp ứng với các tín hiệu hoạt hóa Điều này làm giảm khả năng miễn dịch với vi khuẩn, gây ra hàng nghìn ca ngộ độc thực phẩm và hơn 500 người chết mỗi năm ở Mỹ

2.2.1.5 Khả năng gây bệnh

Bệnh do nhiễm khuẩn Listeria hay còn gọi là bệnh Listeriosis Đây là tình trạng nhiễm khuẩn do tiếp xúc hoặc ăn phải các loại thực phẩm bị nhiễm một loại vi

khuẩn có tên khoa học là Listeria monocytogenes Loại vi khuẩn listeria này được

Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào nhóm tác nhân sinh học có nguy cơ cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm

Hiện nay, chúng ta đã biết đến hai thể bệnh Listeriosis:

Listeriosis khu trú ở ruột: Bệnh chỉ khu trú ở hệ thống tiêu hóa Người bệnh sẽ trải qua các triệu chứng nhẹ giống như bị cúm thường như sốt và đau mỏi

cơ cũng như có hiện tượng tiêu chảy

Listeriosis thể xâm nhập và lan tỏa: Sự nhiễm bệnh không tập trung tại đường tiêu hóa mà còn xâm nhập vào máu gây tình trạng nhiễm trùng máu hoặc lan sang cả hệ thần kinh trung ương và não bộ gây viêm màng não Listeriosis lan tỏa là một bệnh lý khá nguy hiểm, đòi hỏi phải nhập viện ngay lập tức để được điều trị tích cực bằng các loại thuốc kháng sinh

Các trường hợp dễ nhiễm bệnh là trẻ sơ sinh dưới 1 tháng tuổi, người già trên 60 tuổi, Người đang trong giai đoạn dùng các phương pháp điều trị làm suy giảm chức năng miễn dịch như hóa-xạ trị, phụ nữ mang thai

2.2.1.6 Các thực phẩm liên quan

Hầu hết số ca mắc Listeriosis đều do dùng các loại thực phẩm đã bị nhiễm

khuẩn Listeria

Trong môi trường chế biến thực phẩm, sự xuất hiện của Listeria có thể gây

ô nhiễm cho các sản phẩm thực phẩm Ví dụ, sự nhiễm khuẩn có thể xảy ra sau khi thực phẩm đã được nấu chín nhưng trước khi nó được đóng gói hoặc vận chuyển đến nơi tiêu thụ, nó đã bị cầm nắm bởi tay người hoặc vật dùng nhiễm vi khuẩn Listeria

Các loại rau quả cũng có thể bị ô nhiễm nếu chúng được trồng ở những nơi

có nguồn đất và nước hoặc phân bón có Listeria, hoặc khi rửa các loại thực phẩm

này với nguồn nước bị ô nhiễm Các loại thịt và sản phẩm sữa hoặc từ sữa có thể bị

ô nhiễm nếu chúng được lấy từ các động vật đã bị nhiễm với Listeria

2.2.2 Escherichia Coli

2.2.2.1 Giới thiệu

Escherichia coli (thường được viết tắt là E coli) hay còn được gọi là vi

khuẩn đại tràng là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và động vật có vú) Vi khuẩn này cần thiết trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột Sự có mặt của

E coli trong nước ngầm là một chỉ thị thường gặp cho ô nhiễm phân E coli thuộc

họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và thường được sử dụng làm sinh vật mô hình cho

các nghiên cứu về vi khuẩn

E Coli đóng vai trò quan trọng trong y tế, nó được sử dụng như là một

công cụ để sản xuất các loại thuốc thông qua việc chuyển gen vào các plasmid

2.2.2.2 Phân loại

Hình 2.2 : Vi khuẩn Escherichia Coli

Escherichia Coli là một trong những vi khuẩn đa dạng nhất, 20% của bộ

gen là chung cho tất cả các chủng, và phân thành nhiều loài khác nhau

2.2.2.3 Hình thái, cấu trúc

Vi khuẩn thuộc loại trực khuẩn gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế bào, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul, loại không có độc lực không có capsul Kích thước trung bình (0,5µm x 1-3µm) hai đầu tròn Một số dòng có lông bám (pili)

Đặc tính sinh hóa: Nhiệt độ thích hợp là 37-38oC, pH: 7,2 - 7,4 Khuẩn lạc thay đổi theo môi trường nuôi cấy: trong môi trường NA : khuẩn lạc tròn, ẩm ướt, mặt láng, có nếp nhăn Trong môi trường EMB : khuẩn lạc có màu thâm tím hoặc đen Môi trường MacConkey: khuẩn lạc màu đỏ mận chín

2.2.2.4 Đặc điểm:

 E.coli thuộc họ Enterobacteraceae, gram âm, hình que, đường kính

khoảng 1mm Phần lớn di động và không sinh bào tử, chỉ có serotyp O.8 và O.9 tạo bào tử và bất động, hiếu khí hay kỵ khí tuỳ tiện

 Có khả năng lên men lactose cao

 Kích thước tế bào và khuẩn lạc phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy

 E.coli có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 7-50oC Nhiệt độ phát triển

tối ưu của E.coli là 37oC Riêng loài E.coli (ETEC) có thể phát triển ở 4oC

 Giá trị D của E.coli là 60oC trong 0,1 phút

 E.coli sống trong ruột già của động vật Theo phân người và động vật

ra ngoài thiên nhiên

 Bị ức chế bởi một số loại hóa chất như chlorine, mối mật, brillian green

 Có khả năng lên men được nhiều loại đường, sinh hơi Chúng có khả năng khử nitrate thành nitrit

 E.coli có enzyme trytophanase Nếu trong môi trường có trytophan,

chúng sẽ phân giải trytophan thành Indol

E.coli bám dính nhờ các yếu tố bám dính được ký hiệu là F4, F5, F6 và

F41.Yếu tố bám dính thay đổi theo điều kiện môi trường và khả năng biến dị của từng serotyp Chính yếu tố bám dính và độc tố tạo nên quá trình sinh bệnh của

E.coli

E.coli là vi khuẩn môi trường, nơi nào cũng có Bình thường, vi khuẩn

không gây tác hại trên ký chủ (103 cfu/g phân) Khi mật số tăng lên cao (106 – 109cfu/g phân) thì nó sẽ trở nên gây bệnh

Tính bám dính: Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể heo chủ yếu qua đường

miệng Ở dạ dày, nếu pH không quá acid, E.coli sẽ sinh sôi phát triển thuận lợi hơn Khi đến ruột, E.coli sẽ chống lại cơ chế rửa trôi bằng tính bám dính vào niêm mạc

ruột và tác động lên nhung mao ruột

Nhiễm trùng huyết: bằng tính xuyên mạch, E coli xâm nhập vào máu, đi

đến các cơ quan nội tạng khác, tiết độc tố gây độc cho cơ thể, quan trọng nhất là làm viêm não

- Triệu chứng

Có nhiều loại E.coli, nhưng phần lớn chúng có thể nói là vô hại Tuy nhiên, một số E.coli có thể gây tiêu chảy, và loại phổ biến nhất trong nhóm E.coli

có hại này là E.coli O157:H7 Ở vài bệnh nhân, vi khuẩn này có thể gây rối loạn

máu và suy thận, thậm chí dẫn đến tử vong

Tiêu chảy ra máu là triệu chứng chính của nhiễm E.coli Người bị nhiễm

cũng có thể cảm thấy đau thắt bao tử và nôn ói Triệu chứng thường bắt đầu 3 hay 4

ngày sau khi bị phơi nhiễm vi khuẩn E.coli Phần lớn bệnh nhân hồi phục sau vài

ngày hay một tuần sau khi mắc bệnh Phần lớn bệnh nhân cũng chẳng cần đến bác

sĩ vì họ không biết mình bị nhiễm E.coli Ngoài ra, nhiều người bị nhiễm mà không

có triệu chứng và cũng không mắc bệnh

Khi bệnh nhân bị nhiễm E.coli nghiêm trọng (tức có thể làm rối loạn máu

và suy thận), một số triệu chứng sau đây thường được ghi nhận:

 Da trở nên xanh xao

 Cảm lạnh

 Cảm thấy yếu cơ

 Có những vết thâm tím trên người

 Đi tiểu rất ít nước tiểu

2.2.2.7 Các thực phẩm liên quan

Các thực phẩm bị nhiễm E coli là các loại thực phẩm từ động vật như các loài gia súc Nguồn E.coli trong ruột gia súc có thể được truyền qua quá trình chế

biến

Sữa chưa được tiệt trùng Vi khuẩn E.coli được truyền sang sữa qua các

thiết bị vắt hoặc từ vú của động vật

Nước bị ô nhiễm : phân người và động vật có thể gây ô nhiễm mặt đất và nguồn nước và nước tưới cây, trồng, uống hoặc sử dụng các nguồn nước này có thể

gây nhiễm E.coli

2.3 Tổng quan về Enterobacter sakazakii

2.3.1 Lịch sử phát hiện

1958 Enterobacter sakazakii được biết đến với sự mô tả như một sắc tố

màu vàng được Urmenyi và Franklin điều tra thông qua hai trường hợp nhiễm trùng huyết và viêm màng não gây tử vong ở bệnh viện Osterhills tại Anh

1980 E sakazaki được định danh là một loài mới của họ

Enterrobacteriaceae Đặt theo tên của Riichi Sakazakii nhà vi trùng học Nhật Bản

cho đóng góp quan trọng của ông về sự hiểu biết sinh học Vibrionaceae và

Enterobacteriaceae

1982 có 8 trường hợp bệnh viêm màng não ở trẻ sơ sinh gây ra bởi E.sakazaki được phát hiện ở Hà Lan

1994 một đợt bùng phát nhiễm trùng E sakazakii ở Pháp đã xảy ra trong

một khu vực chăm sóc trẻ sơ sinh trong đó có 17 trẻ sơ sinh bị nhiễm 7 trường hợp viêm ruột hoại tử, một trường hợp nhiễm trùng máu và một trường hợp gây viêm màng não

Chi Enterobacter bao gồm mười bốn loài, cụ thể là: E aerogenes, E

amnigenus, E asburiae, E cancerogenus (E tylorae), E cloacae, E cowanii, E dissolvens (Erwinia), E gergoviae,E hormaechei, E vật ở giưa, E kobei, E Nimipressuralis (Erwinia), E pyrinus (Erwinia) và E sakazakii Là tác nhân của

các bệnh nhiễm trùng

Enterobacter sakazakii ban đầu được xác định là một loài mới vào năm

1980 Sử dụng DNA- DNA lai tạo và các kiểm tra sinh hóa cho kết quả 53-54% liên

quan đến các loài trong hai chi, Enterobacter và Citrobacter Khi so sánh các chủng loại của các hai chi, E sakazakii có 41% liên quan đến C freundii và 51% liên quan đến E cloacae Do đó nó được đặt trong chi Enterobacter

Gần đây đã Dựa trên các phương pháp phân tích f-AFLP, trình tự gen 16S

ARN và phương pháp lai tạo DNA-DNA được áp dụng cho 210 chủng E.sakazakii

và dữ liệu của tất cả 16 biogroup (Iversen et al., 2007) Đã đưa ra đề xuất phân loại

các chủng thành 1 chi mới Cronobacter

Cronobacter spp được xem như là một chi mới của E sakazakii bằng các

phương pháp nêu trên nhiều loài đã được tìm ra như Cronobacter sakazakii; C

turicensis; C malonaticus; C muytjensii; and C dublinensis

2.3.3 Đặc điểm

Hình 2.4: E sakazakii dưới kính hiển vi

2.2.3.1 Đặc điểm chung

- Đặc điểm

E sakazakii là một vi khuẩn gram âm thuộc họ Enterobacteriaciae và đủ

tiêu chuẩn là một vi khuẩn Coliform, chiều dài khoảng 3 µm và chiều rộng

hình que, kị khí tùy nghi, các tế bào di chuyển bằng tiên mao Peritrichous

và không hình thành bào tử, có khả năng tạo màng sinh học

- Môi trường sống

E sakazakii không phải là dạng sinh vật cư trú trong đường ruột của con

người Ta có thể phân lập hàng loạt từ các mẫu môi trường (đất, nước), các loài gây

hại như (ruồi, chuột), từ thực phẩm và từ môi trường bệnh viện E sakazakii cũng

có thể được tìm thấy trong sữa bột, ngũ cốc, chocolate, bột mì và các khu vực sản xuất

- Nhiệt độ tăng trưởng

Enterobacter sakazakii có khoảng nhiệt độ rộng cho sự phát triển: nhiệt độ

tối thiểu là 5,5 - 8°C, tối đa là 45 - 46°C và nhiệt độ tối ưu để phát triển là 37-43°C

Ở nhiệt độ tăng trưởng tối thiểu như thế sẽ giúp E sakazakii phát triển trong tủ lạnh nhà từ 7 đến 10°C nếu có trong sữa bột dành cho trẻ em Còn khi E

sakazakii phát triển ở nhiệt độ lên tới 45-46°C có thể còn sống sót trong các thiết bị

sấy và máy trộn được sử dụng sản xuất sữa bột cho trẻ em

Thời gian cho một lần chu kì nhân đôi ở 10oC là khoảng từ 4-6 giờ Giảm còn 40 phút nếu ở nhiệt độ phòng

- pH

Tối thiểu 3,89

Tối ưu 5 - 9

- Khả năng chịu khô

E sakazakii được cho là có khả năng chống thẩm thấu, chịu được khô hạn

hơn so với các vi khuẩn khác như : Escherichia coli, Salmonella và các chủng khác của Enterobacteriaceae, Phân tích chỉ ra rằng khả năng chịu khô hạn rất có thể là

liên quan đến tích tụ trehalose trong các tế bào Một chất có khả năng giữ nước cao,

và được sử dụng trong thực phẩm và mỹ phẩm

- Môi trường nuôi cấy

Vi khuẩn có thể được nuôi trên môi trường lỏng có bổ sung các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn và đạt được mật độ tế bào cần thiết

(tế bào/ml) hoặc môi trường rắn có argar trong các đĩa petri để từng tế bào mọc thành khuẩn lạc để dễ quan sát

2.2.3.2 Đặc điểm sinh hóa

 E sakazakii có khả năng kháng kháng sinh macrolide, lincomycin,

clindamcin, steptogramins, rifampicin

 E sakazakii tham gia vào quá trình khử nitrate thành nitrite trong điều

kiện không có oxy phân tử, bên cạnh đó còn có vai trò súc tác sự thủy phân lactose nhờ β-galactosidase, chúng sử dụng glucose và lactose như một nguồn cacbon

 Thử nghiệm catalase : cho kết quả dương tính Nhằm xác định xem VSV có enzyme catalase để phân hủy H2O2

 Thử nghiệm oxidase : Cho kết quả âm tính Là một thử nghiệm được

sử dụng trong vi sinh để xác định một loại vi khuẩn sản xuất nhất định cytochromec oxidases

 Lên men các loại đường sản phẩm phụ là acid và sinh khí

 Voges-Proskauer : cho phản ứng dương tính

 Không lên men đường sorbitol

 Thử nghiệm decarboxylase : nhằm xác định khả năng của một vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme khử nhóm carboxyl hay tách hydrogen từ các aminoacid Cho kết quả lysine – âm tính , arginine – dương tính , ornithine - dương tính

2.3.4 Cấu trúc

Hình 2.5: Tế bào vi khuẩn E sakazakii

2.3.4.1 Thành tế bào

Thành tế bào (cell wall) giúp duy trì hình thái của tế bào, hỗ trợ sự chuyển động của tiên mao (flagellum), giúp tế bào đề kháng với áp suất thẩm thấu, hỗ trợ quá trình phân cắt tế bào, cản trở sự xâm nhập của một số chất có phân tử lớn, liên quan đến tính kháng nguyên, tính gây bệnh, tính mẫn cảm với Thực khuẩn thể (bacteriophage)

Cấu tạo gram âm : Vách tế bào Gram âm có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp

Trong cùng là một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và

tới lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm

Màng ngoài còn có thêm các protein:

+ Protein cơ chất: porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng

với chức năng cho phép một số loại phân tử đi qua chúng như dipeptide,

disaccharide, các ion vô cơ…

+ Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt

và đưa qua màng ngoài như: nucleotide, vitamin B12,…

+ Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài

Hình 2.6.Cấu trúc tế bào Gram –

2.3.4.2 Màng sinh học

Màng sinh học là tập hợp của các vi sinh vật Trong đó các tế bào dính lại với nhau trên một bề mặt Những tế bào này dính lại với nhau tạo ra một chất nền extracellular polymeric substance (EPS) là một chất dính cao phân tử bao gồm DNA, protein, polysaccharides, màng sinh học có thể hình thành trên bề mặt có thể lan truyền trong tự nhiên,

Màng sinh học được hình thành bắt đầu bằng các tế bào tự do trên một bề mặt nào đó, các tế bào bám vào nhau thông qua lực hút van der waals Nếu những tế bào này không tách rời ra chúng sẽ bám dính vĩnh viễn bằng kết dính tế bào hay cấu trúc tiêm mao và phát triển thành một khối trên bề mặt gọi là màng sinh học

Cuối cùng các màng sinh học sẽ phân tán Sự phân tán của các tế bào từ các màng sinh học là một giai đoạn cần thiết của vòng đời màng sinh học Cho phép phát tán màng sinh học để lây lan và xâm chiếm các bề mặt mới

- Có 5 bước phát triển màng sinh học

Bước 1: Các tế bào bắt đầu tham gia tạo màng

Bước 2: Các tế bào kết dính kho thể tách ra được Bước 3: Giai đoạn trưởng thành thứ nhất

Bước 4: Giai đoạn trưởng thành thứ hai Bước 5 : Sự phân tán

Hình 2.7 : Năm bước phát triển của màng sinh học

Hình 2.8: Cấu trúc tiên mao

2.3.5 Yếu tố độc lực[2].

Khả năng sinh độc tố của E sakazakii ít được biết đến Một thí nghiệm cho thấy khả năng sinh các hợp chất giống enterotoxin thí nghiệm trên 18 chủng E

sakazakii nhưng chỉ 4 trong số đó có khả năng sinh độc tố trên Độc tố enterotoxin

sau khi vào ruột nó có thể làm tăng tính thấm của biểu mô đường ruột ở trẻ sơ sinh, tồn tại trong ruột và gây ra viêm ruột dẫn đến hoại tử ruột hay có thể gây viêm màng não

Khả năng gây độc của các chủng E sakazakii (cronobacter spp ) một chi mới của E sakazakii đã được tìm hiểu dựa trên sự nhiễm trùng do nhiễm khuẩn là

di căn thông qua các bộ phận khác gây viêm màng não, viêm ruột hoại tử

Sự khác nhau về yếu tố độc lực của E sakazakii (cronobacter spp ) , đã

được nêu ra tại cuộc họp giữa các chuyên gia của các tổ chức FAO vào năm 2006

Từ đó các nghiên cứu được tiến hành Tiêm tế bào não chứa E sakazakii vào chuột

mới sinh ở các mao mạch của não trong của chuột đã được thực hiện Công việc chỉ

ra rằng E sakazakii (Cronobacter spp.) tồn tại và nhân rộng trong các đại thực bào

và cho thấy sự tham gia và di căn tại tế bào nội mô của người

Thí nghiệm được tiến hành với từng chủng E sakazakkii (cronobacter spp) cho thấy sự đa dạng của các đặc tính độc lực giữa các E sakazakii phân lập, và (Cronobacter spp.)

2.3.6 Cơ chế gây bệnh[3]

Cho đến nay cơ chế gây bệnh cụ thể của E sakazakii chưa được xác định

Do đó có thể hiểu E sakazakii như một tác nhân cơ hội gây nhiễm trùng Nghiên cứu cho rằng E sakazakii có một sự nhiễm bệnh giống nhau giữa độc tố của E.coli

và coliform Có một khả năng là các độc tố được truyền qua các sinh vật trong ruột người thông qua thể plasmid

2.2.6.1 Các nguồn nhiễm bệnh

 Người: lây nhiễm từ các mẫu của bệnh nhân như dịch não tủy, máu, đờm, họng, mũi, phân, ruột, vết thương, tủy xương, mắt, tai, dạ dày, bệnh phẩm qua đường hậu môn

 Động vật: Ruồi và động vật gặm nhấm được xem như các nguồn gây bênh mặc dù ở một tỷ lệ thấp (0,2%)

 Môi trường: từ nước, bụi, đất, vật liệu thực vật, bùn, máy hút bụi

 Thực phẩm : trong các loại sữa bột , rau củ quả, Pho mát, sản phẩm sấy khô các loại thảo mộc, gia vị, hạt giống lúa, rau diếp, thịt bò băm nhỏ, xúc xích thịt và rau quả, lên men tinh bột sắn, đậu xanh và mầm cỏ linh lăng, và thịt

 Các nguồn khác từ môi trường, các dụng cụ chế biến, các quy trình đóng gói …

2.2.6.2 Triệu chứng

 Ủ bệnh : hầu như không có triệu chứng nhất định, các triệu trứng như

ăn không ngon, khó chịu, vàng da, sốt cao, tiêu chảy, động kinh

 Gây bệnh: trường hợp trẻ sơ sinh, nhiễm trùng tiến triển đến viêm màng não (tình trạng viêm cấp tính của các màng của não và tủy sống), và phát triển cuối của là não úng thủy (bất thường gia tăng số lượng dịch não tủy trong khoang sọ) đặc trưng của bệnh nhiễm trùng hệ thống thần kinh trung ương

 Liều lượng: theo các nghiên cứu thì khả năng gây bệnh khi bị nhiễm khoảng 1000 tế bào sẽ gây ra nhiễm trùng, và trong sữa bột cho trẻ em có khoảng

< 3 cfu/100g sẽ gây nhiễm trùng

 Độ tuổi gây bệnh: ở mọi lứa tuổi đều có nguy cơ Nhiễm khuẩn E

sakazakii Nhưng nguy cơ cao nhất là ở các trẻ sơ sinh, trẻ sinh non có cân nặng nhỏ

hơn 2,5kg

 Di chứng: Gây ra các bệnh nhiễm trùng, viêm màng não, để lại những

di chứng thần kinh, chậm phát triển,… hoặc có thể gây tử vong

2.2.7 Các biện pháp phòng và xử lí bệnh

2.2.7.1 Các biện pháp phòng bệnh

Enterobacter sakazakii được tìm thấy chủ yếu trong sữa vì vậy phải đọc kĩ

hướng dẫn trước khi sử dụng sữa, không nên đễ sữa quá lâu sau khi chế biến (không quá 4 giờ), rửa tay sạch trước khi pha sữa

Nước dùng đễ pha sữa phải là nước nước đun sôi thật kĩ trước khi cho giảm nhiệt độ đến 72oC Làm sạch bình hay ly sữa bằng nước sôi Quậy thật đều hỗn hợp bột và nước

Thường xuyên tiêm phòng vaccine cho trẻ để tăng đề kháng

Người mẹ nên được hướng dẫn và tìm hiểu thông tin đầy đủ về cách pha chế và bảo quản các sản phẩm sữa bột cho trẻ

2.2.7.2 Xử lí bệnh

Hầu hết các loại nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra thuốc đặc trị là các loại

thuốc kháng sinh Riêng E sakazakii có khả năng kháng một số loại kháng sinh Vì

vậy uống thuốc đúng liều và đúng cách là cách trị bệnh hiệu quả và bảo vệ sức khỏe

Một số loại kháng sinh có hiệu quả trong việc điều trị bệnh do E sakazakii

như chloramphenicol, gentamicin-ampicilin hoặc ampicilin

2.2.8Tình hình nhiễm E sakazakii trong sữa bột

2.2.8.1 Việt Nam

Tình hình sữa nhiễm khuẩn E sakazakii tại Việt nam hiện nay chưa có

trường hợp nào được công bố Tuy nhiên các sản phẩm sữa bột nhập khẩu vẫn là mối đe dọa hiện nay

Để phát hiện trong sữa có vi khuẩn nhóm E sakazakii hay không thì phải

thực hiện thêm nhiều công đoạn xét nghiệm Vì vậy, đến thời điểm này, theo Cục

An toàn Vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) vi khuẩn E sakazakii chưa được định danh

để đưa vào danh mục các vi khuẩn cần giám sát

Theo các chuyên gia dịch tễ - vi khuẩn E sakazakii nói trên thuộc nhóm

Ecoli (gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em) Đây là một loại khuẩn hiếm gặp, có khả năng

làm suy giảm hệ thống thần kinh trung ương, gây bệnh tiêu chảy và hạn chế khả năng lưu thông máu đối với tất cả trẻ em Vi khuẩn này cũng có thể gây bệnh viêm màng não ở trẻ em và tỷ lệ tử vong khoảng 50%

2.2.8.2 Thế giới

Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) đã có thông báo liên quan

đến nhiễm khuẩn Enterobacter sakazakii ở trẻ sơ sinh nuôi bằng sữa bột dinh dưỡng Các cụm nhiễm E sakazakii đã được báo cáo một loạt các địa điểm trong vài năm

qua của các trẻ sơ sinh ăn sữa bột do các nhà sản xuất khác nhau sản xuất Một nghiên cứu kiểm tra sữa bột trẻ sơ sinh dựa trên công thức sản phẩm thu được từ

một số quốc gia khác nhau và thấy rằng E sakazakii có thể được thu hồi từ 20

(14%) trong 141 mẫu

Tổng Cục Kiểm tra Chất lượng và Kiểm dịch Trung Quốc đã công bố danh sách 852 loại thực phẩm, đồ uống và mỹ phẩm bị cấm bán ra thị trường do có chứa

vi khuẩn E sakazakii trong đó có cả rượu, thịt cá đông lạnh, nước và bánh quy của

Mỹ, Nhật, Tây Ban Nha và sữa bột Đài Loan

Ngoài sữa bột Đài Loan thì nhãn hiệu sữa Pauls do công ty Parmalat Australia sản xuất, một chi nhánh của tập đoàn thực phẩm của Ý cũng nằm trong 852 loại thực phẩm, đồ uống và mỹ phẩm bị cấm lưu hành vì có chứa vi khuẩn độc hại

Các cán bộ kiểm dịch đã tiến hành lấy mẫu xét nghiệm trên 9.624 tấn sữa

bột của công ty Đài Loan Wei Quan và phát hiện có Enterobacter sakazakii, một

loại vi khuẩn có thể gây bệnh viêm màng não cho trẻ nhỏ Đây là căn bệnh rất nguy hiểm và gây tỉ lệ tử vong cho tới 50% số trẻ mắc bệnh

Ngoài sữa bột Đài Loan thì nhãn hiệu sữa Pauls do công ty Parmalat Australia sản xuất, một chi nhánh của tập đoàn thực phẩm của Ý cũng nằm trong 852 loại thực phẩm, đồ uống và mỹ phẩm bị cấm lưu hành vì có chứa

Enterobacter sakazakii

Hình 2.9 : Hai loại sữa điển hình nhiễm E sakazakii

CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ENTEROBACTER

SAKAZAKII

3.1 Phương pháp truyền thống

3.1.1 Nguyên tắc

Mẫu sữa nghi ngờ có sự hiện diện của Enterobacter sakazakii đễ phát hiện

ta thông qua các bước

+ Tiền tăng sinh

+ Tăng sinh chọn lọc trên môi trường nuôi cấy đặc trưng

+ Khẳng định vi khuẩn bằng các thử nghiệm sinh hóa

3.1.2 Môi trường nuôi cấy

- Nước đệm pepton (BPW)

- Canh thang tryptoza lauryl sulfat cải biến (mLST)/môi trường vancomyxin

- Thạch phân lập Enterobacter Sakazakii (ESIATM)

- Thạch đậu tương trypton (TSA)

Dụng cụ chứa mẫu phải đủ lớn để chưa ¾ thể tích và cho phép trộn mẫu trước khi dùng phương pháp lắc, các vật chứa phải có nắp đậy

Các dụng cụ phải là các hợp kim chịu nhiệt ở 180oC hoặc các dụng cụ bằng chất dẻo sử dụng 1 lần Có thể khử trùng theo các phương pháp sau

 Phương pháp A : giữ trong không khí nóng từ 170-175oC kho dưới 2 giờ

 Phương pháp B : giữ trong luồng hơi nóng từ 121oC không dưới 20 phút (Autoclave)

 Phương pháp C : hơ trên ngọn lửa sao cho các dụng cụ tiếp súc trực tiếp với lửa

 Phương pháp D : nhúng các dụng cụ vào ethanol nồng độ ít nhất là 70%

Các dụng cụ sau khi khử trùng sẽ được bảo quản trong điều kiện vô trùng trước khi sử dụng

- Cách lấy

Lấy tối thiểu 100g sau khi lấy bảo quản trong điều kiện vô trùng ở 30oC

Luôn luôn lấy mẫu ở điều kiện vô trùng vì đây là lấy mẫu để kiểm tra vi sinh nên điều kiện vô trùng là cần thiết

Dùng dao hoặc thìa trộn vô trùng Loại bỏ lớp sản phẩm trên bề mặt của vùng lấy mẫu, lấy mẫu bằng ống xăm vô trùng Cắm ống xăm khô sạch vào sản phẩm nếu cần với những vật chứa nằm trên cạnh nó, cho khe cắm hướng xuống phía dưới với tốc độ xuyên đều khi ống xăm chạm tới đáy thùng xoay ống xăm 180orút ra và đổ sản phẩm vào vật chứa mẫu và đậy ngay nắp lại Nếu thấy có dấu hiệu không tốt về điều kiện của lớp bột phía trên thì có thể lấy riêng từng lớp khác nhau

Mẫu là các sản phẩm đóng gói chưa mở, có thể dùng các vật chứa thích hợp để lấy mẫu sao cho mẫu không dưới 100g