- Khái niệm
Real - time PCR là phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn
ADN chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang. Trong phản ứng Real - time PCR, quá trình nhân bản ADN đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo
dõi trực tiếp
Real - time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản ADN bằng
phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn ADN tạo
thành.
- Nguyên lí của phương pháp real-time PCR
Real-time PCR kiểm soát lượng huỳnh quang giải phóng ra trong phản ứng
từ đó có thể biết được lượng sản phẩm PCR trong từng thời điểm (chu kỳ) của quá
trình khuếch đại, trái ngược với PCR truyền thống chỉ biết được lượng sản phẩm được khuếch đại ở thời điểm cuối cùng của phản ứng khuếch đại. Real-Time PCR là một phản ứng động. Cho phép phát hiện “Huỳnh quang phát ra nhờ sự khuếch đại
của sản phẩm PCR” tại mỗi chu kỳ của phản ứng PCR.
Phân tích kết quả phản ứng PCR mà không cần bước điện di trên gel. Phân tích kết quả huỳnh quang phát ra theo thời gian tại mỗi chu kỳ phản ứng PCR bằng
máy tính
Kỹ thuật real- time PCR sử dụng taqman probe: trong kỹ thuật này, ngoài 2 thành phần cơ bản của real-time PCR còn có thêm 2 thành phần quan trọng để probe
có thể phát huỳnh quang được khi có sự hiện diện của các sản phẩm khuếch đại đặc
Taqman-probe là những oligonucleotise có trình tự bổ sung với một
trình tự đặc hiệu trên DNA đích. Probe này được đánh dấu ở đầu 5’ bằng chất
nhuộm chỉ thị huỳnh quang – fluorescent reporter dye (gọi là reporter) và chất hấp
thụ – quencher ở đầu 3’. Reporter và quencher có phổ kích thích và phát quang trùng nhau. Nhờ đó tín hiệu huỳnh quang được hấp thu. Khi ADN đích tích lũy,
probe gắn vào ADN đích nhưng chưa phát quang. Khi mạch bổ sung với mạch
khuôn mà probe bắt cặp được kéo dài,
Enzyme Taq ADN polymerase tiến tới đầu 5’ của probe. Hoạt tính
5’3’ exonuclease của Taq ADN polymerase sẽ phân cắt đầu 5’ đã được đánh dấu
huỳnh quang của probe. Do đó chất chỉ thị huỳnh quang - reporter được phóng thích
ra khỏi sự bắt cặp của chất hấp thụ – quencher và tín hiệu huỳnh quang tăng lên. Mức độ huỳnh quang tương ứng với số ADN chuyên biệt mong đợi. Khác với
SYBR Green I, primer dimer và các sản phẩm ADN khuếch đại không đặc hiệu sẽ
không cho tín hiệu huỳnh quang.
Như vậy, tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận trong giai đoạn kéo dài. Độ
mạnh tín hiệu huỳnh quang tích lũy tăng dần
Chất phát huỳnh quang được chọn làm reporter phải có phổ phát (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
sáng tách biệt với quencher
Reporter phát sáng trong khoảng kích thích của quencher.
Quencher phải nằm gần reporter để hấp thụ hiệu quả.
Reporter là chất gắn vào đầu 5’ của taqman probe, có khả năng phát huỳnh
quang khi nhận được nguồn sáng kích thích
Quencher là chất có khả năng hấp thụ được ánh sáng huỳnh quang phát ra
từ reporter khi reporter nhận được ánh sáng kích thích, nó sẽ chuyển ánh sáng hấp
thụ được thành ánh sáng, do vậy quencher sẽ pháy ra huỳnh quang nhưng bị cản lại
Hình 3.10 : Sơ đồ phát quang của Taqman-probe
3.2.2.3 Phương pháp tiến hành
Hỗn hợp phản ứng real time PCR là 50µl bao gồm
- 1x dung dịch đệm PCR
- 0,4 µM/L mồi và mẩu dò, 1µl DNA
- 200 µmol/L mổi loại dATP, dGTP, dCTP, dTTP
Hoặc sử dụng các bộ kít có chứa sẵn các thành phần của phản ứng ta chỉ
cần thêm vào lượng DNA mẫu cần thiết
Hình 3.11: Kết quả được đọc bằng máy real time 7500. Hệ thống Real - time PCR gồm máy luân nhiệt được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính
Các điều kiện phản ứng là 94oC trong 2 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ của
94oC trong 30s, 58oC trong 30s và 72oC trong 30s một bước mở rộng để kéo dài chuỗi là 72oC trong 7 phút
Đoạn mồi và đoạn probe
Primer and probe Sequentie (5’- 3’)
OmpA-F OmpA-R OmpA-probe GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT GCGCCTCGTTATCATCCAAA CCCGGAAAGCGCATGGCC Đọc kết quả
Biểu đồ khuếch đại của Real-time PCR có: trục tung (Y) là cường độ huỳnh
quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, còn trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt.
Hình 3.12 : Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của mồi và mẫu dò trên gene OmpA của E. sakazakii
CHƯƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 kết luận
Sữa bột là thức ăn dinh dưỡng cho trẻ em nó chứa hầu hết các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của trẻ sơ sinh như protein, glucid, lipid, vitamin, các muối khoáng. Những hợp chất này rất cần thiết cho khẩu phần ăn hằng ngày của
trẻ sơ sinh. Do đó sữa đóng vai trò quan trọng đối với nhu cầu dinh dưỡng của trẻ
em. Bên cạnh đó cũng là môi trường thuận lợi cho việc phát triển của vi sinh vật (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
gây bệnh
Enterobacter sakazakii là một vi khuẩn Gram (-) hình que, có tiên mao và kị khí tùy nghi có đầy đủ tiêu chuẩn là một colifrom và các đặc điểm chịu nhiệt ở 5- 8oC nên khả năng sống sót của chúng rất cao. Là nguyên nhân gây ra các bệnh nguy
hiểm cho trẻ sơ sinh như viêm màng não và viêm ruột hoại tử để lại nhiều di chứng
nguy hiểm và có thể gây chết người. Sữa bột được xem là nguồn lây nhiễm E. sakazakii sang người nhiều nhất. Đa số các trường hợp nhiễm bệnh đều do sử dụng
các loại sữa nhiễm khuẩn E. sakazakii.
Các phương pháp phân lập để phát hiện E. sakazakii đã được nghiên cứu
rất nhiều, trong bài tiểu luận này tôi xin đề cập đến một số phương pháp phân lập và phát hiện loại vi khuẩn độc hại này gồm có :
Phương pháp nuôi: cấy dựa vào đặc điểm sống của E. sakazakii sử
dụng môi trường thạch để tăng sinh sau đó sử dụng các kiểm nghiệm sinh hóa để
khẳng định
- Ưu điểm: dễ thực hiện chi phí cho phòng thí nghiệm thấp, thu được
sinh khối vi sinh vật.
- Nhược điểm: Tốn thời gian, cần sử dụng nhiều loại hóa chất, hiểu rỏ
về đặc điểm sinh hóa của vi sinh vật. Dễ bị nhầm lẫn với các chủng vi sinh vật khác,
và dễ bị nhiễm các loại vi sinh vật khác trong qúa trình nuôi cấy.
Phương pháp PCR : Là một phương pháp hiện đại dựa vào quá trình tru trình nhiệt để khuếch đại đoạn DNA đặc trưng cho vi khuẩn E. sakazakii
- Ưu điểm: phương pháp PCR được xem như là một phương pháp mới
cho kết quả tốt hơn so với các phương pháp truyền thống. Những lợi thế của phương pháp này là độ nhạy, độ chính xác và tin cậy cao và được tự động hóa bằng
các thiết bị công nghệ cao
- Nhược Điểm : Mặc dù kỹ thuật PCR phát hiện nhanh với độ nhạy cao nhưng vẫn cần 18 – 36 giờ cho một xét nghiệm. Kỹ thuật này không có khả năng định lượng chính xác số bản sao của tác nhân cần kiểm tra trong mẫu. Do sử dụng
các thiết bị công nghệ cao nên chi phí đầu tư cho phòng thí nghiệm là rất cao
Phương pháp Real-time PCR là một phương pháp cải tiến của phương
pháp PCR thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang
- Ưu điểm và nhược điểm Không cần điện di sau khi thực hiện phản ứng Real - time PCR, quy trình đơn giản, tiến trình thực hiện nhanh, rút ngắn thời
gian cho kết quả, độ nhạy cao, độ đặc hiệu cao, ống phản ứng PCR luôn luôn đóng, tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Tuy nhiên Real - time PCR đòi hỏi phòng thí nghiệm
phải có trang thiết bị máy hiện đại, giá thành khá cao.
4.2 Kiến nghị
Sau khi hoàn thành bài khóa luận này, tôi đã nhận thấy Enterobacter sakazakii là một vi sinh rất nguy hiểm đặc biệt là đối với trẻ sơ sinh. Bên cạnh đó
các yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E. sakazakii chưa được nghiên cứu rõ. Sự tồn tại của vi khuẩn này rất khó được phát hiện bằng các phương pháp thông thường sẽ dễ gây hiện tượng dương tính giả. Dễ nhầm lẫn với các vi sinh vật
khác, gây khó khăn trong việc chuẩn đoán (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Do đó Tôi có đề nghị là nên có những biện pháp phòng ngừa và phòng tránh hạn chế các rủi ro do Enterobacter sakazakii gây ra. Cụ thể như sau : Nên
nuôi con bằng sữa mẹ vì sữa mẹ chứa những yếu tố quan trọng trong hệ miễn dịch
của trẻ nhỏ. Đối với các loại sữa bột nên được kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh bằng các phương pháp có độ chính xác cao để phát hiện các yếu tố gây bệnh trước khi đến tay người tiêu dùng . Trong quá trình pha chế sữa bột cần làm đúng các chỉ dẫn của
nhà sản xuất. Tuyên truyền về những tác hại của Enterobacter sakazakii cho mội người để hạn chế đến mức thấp nhấp những tổn hại do vi sinh vật này gây ra
Thông qua bài tiểu luận này, hy vọng sẽ góp phần nào đó giúp mọi người
hiểu rõ hơn về nguy cơ gây bênh của các vi sinh vật trong các sản phẩm dinh dưỡng
hiện nay đặc biệt là tác hại của Enterobacter sakazakii gây ra cho con người. Góp
phần hiểu rõ tầm quan trọng của việc đánh giá chất lượng thực phẩm và việc giữ vệ sinh môi trường sống, bảo quản và pha chế thực phẩm đúng tiêu chuẩn để bảo vệ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
Cấu trúc tế bào vi khuẩn Vietsciences - Nguyễn Lân Dũng- 05/10/2005
Phương pháp phân tích vi sinh – Trần Linh Thước – nhà xuất bản giáo dục
TCVN (7850:2008) : Sữa và sản phẩm sữa - Phát hiện Enterobacter
sakazakii
TCVN 6400 : Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẩn lấy mẩu
TCVN (6263:1997): sữa và sản phẩm sữa - Cách chuẩn bị mẩu thử
Tài liệu tiếng Anh
[1].www.fineli.fi/food.php?foodid=672&lang=en [2].http://www.foodsafety.govt.nz/elibrary/industry/cronobacter.pdf [3].http://www.ugacfs.org/faculty/Erickson/EBWhitePaper.mpd.PDF [4].http://scholar.sun.ac.za/bitstream/handle/10019.1/3097/Kemp,%20F.pd f?sequence=1 [5].http://aem.asm.org/cgi/content/full/72/4/2539 [6].http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1449048/ [7].http://nguyenanhvn.com/san-pham/moi-truong-vi-sinh-brilliance- enterobacter-sakazakii-agar-cong-thuc-dfi--1847.html
PHỤ LỤC
Thành phần môi trưởng
1. Nước đệm peptone (BPW)
Thành phần
Dịch thủy phân casein bằng enzyme
Natri clorua (NaCl)
Natri hydro phosphat ngậm 12 phân tử nước
Kali dihydro phosphat (KH2PO4)
Nước 10,0 g 5,0 g 9,0 g 1.5 g 1 000 ml Chuẩn bị
Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh
pH đến 7,0 ± 0,2 ở 25oC nếu cần, cho dung dich vào bình cầu hoặc ống nghiệm theo
nhu cầu phân tích và khử trùng 15 phút ở 121oC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Canh thang tryptoza lauryl sunfat cải biến (mLST)/môi trường vancomyxin
a. Canh thang tryptoza lauryl sunfat cải biến (mLST)
Thành phần
Natri Clorua
Dịch thủy phân mô động vật và thực vật bằng Enzyme Lactoza (C12H22O11)
Kali hydro phosphat (H2HPO4) Dikali hydro phosphat (K2HPO4) Natri lauryl sunfat (C12H25NaO5S)
Nước 34,0 g 20,0 g 5,0 g 2,75 g 2,75 g 0,1 g 1000 ml Chuẩn bị
Hòa tan từng thành phần trong nước, bằng cách đun nóng nếu cần, chỉnh về
pH 6,8 ± 0,2 ở 25oC, phân phối 10ml mLST vào các ống nghiệm, khử trùng 15 phút o
b. Dung dịch vanomyxin Thành phần Vancomyxin Nước 10 mg 10 ml Chuẩn bị
Hòa tan vancomyxin vào nước cất trộn và lọc khử trùng
c. Môi trường vancomyxin/mLST
Cho 0,1 ml vancomyxin vào 10 ml dung dịch mLST đển thu được nồng độ 10µg trên ml mLST
Môi trường vancomyxin/mLST có thể bền đến 1 ngày khi được bảo quản
từ 0-5oC
3. Thạch phân lập Enterobacter Sakazakii (ESIATM) Thành phần
Peptone pancreatic của casein
Dịch chiết nấm men
Natri Clorua NaCl Natri desoxycholat
5-brom-4-cloro α-D glucopyranosit (C14H15BrCINO6) Tím tinh thể Thạch agar Nước 7,0 g 3,0 g 5,0 g 0,6 g 0,15 g 2 mg 12-18 g 1000 ml Chuẩn bị
Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH đến 7,0
± 0,2 ở 25o C, khử trùng 15 phút ở 121oC
Làm nguội đến nhiệt độ 44-47oC. Rót 15 ml môi trường này vào các đỉa Petri vô trùng và để cho đông đặc trên mặt phẳng ngang. Môi trường có thể bền đến
15 ngày nếu bảo quản từ 0-5oC
4. Thạch đậu tương trypton TSA
Dịch thủy phân casein bằng Enzym
Dịch thủy phân đậu tương bằng Enzym
Natri Clorua Thạch Nước 15,0 g 5,0 g 5,0 g 9-18 g 1 000 ml Chuẩn bị
Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun sôi chỉnh pH đến 7,3 ±
0,2 ở 25oC , khử trùng 15 phút ở 121oC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Làm nguội đến nhiệt độ 44-47oC. Rót 15 ml môi trường này vào các đỉa Petri vô trùng và để cho đông đặc trên mặt phẳng ngang
5. Môi trường EE borth ( Enterobacteriaceae Enrichment broth )
Peptone Glucose
Disodium hydrogen phosphate Potassium dihydrgen phosphate Ox bile Brilliant green Water 10g 5g 6,45g 2g 20g 0,0135g 1000 ml pH t 7,2 ± 0,2 25oC
6. Môi trường vi sinh Brilliance Enterobacter sakazakii Agar
Thành phần
Công thức * gm/lít
Tryptone 15.0
Soya peptone 5.0
Sodium chloride 5.0
Ferric ammonium citrate 1.0
Sodium thiosulphate 1.0 Chromogen 0.1 Agar 15.0 pH t 7,3± 0,2 25oC Chuẩn bị
Cân 43.1g Brilliance Enterobacter sakazakii Agar đổ vào một lít nước cất.
Lắc đều và đun sôi đến khi hòa tan hoàn toàn. Thanh trùng bằng nồi hấp ở 121°C
trong vòng 15 phút , làm nguội đến 50°C. Trộn đều và đổ vào đia Petri.
7. Môi trường MacConkey
Peptone Lactose Mật khô hoặc Desoxychorate Neutral red Crystal violet NaCl Agar Nước 20g 10g 1,5g 2,0g 0,03g 0,0001g 5,0g 14g 1000 ml
8. Môi trường và thuốc thử về đặc tính sinh hóa
8.1 Thuốc thử phát hiện Oxidaza
Thành phần
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine dihydro clorua (C10H16N2.2HCl)
Nước
1,0 g
100 ml Chuẩn bị
8.2 Môi trường Lysine decarboxylase, Ornithin decarboxylase, tách nhóm
cacboxyl (decarboxylation ) và Môi trường Arginin dehydrolase cộng 2 hydro
Thành phần L-lysin monohydroclorua C6H14N2O2.HCl Dịch chiết nấm men Glucoza C6H12O6 Bromocresol tía Nước 5,0 g 3,0 g 1,0 g 0,015 g 1000 ml L-lysin monohydroclorua C6H12N2O2.HCl Dịch chiết nấm men Glucoza C6H12O6 Bromocresol tía Nước 5,0 g 3,0 g 1,0 g 0,015 g 1000 ml L-Arginin monohydroclorua C5H14N4O2.HCl Dịch chiết nấm men Glucoza C6H12O6 Bromocresol tía Nước 5,0 g 3,0 g 1,0 g 0,015 g 1000 ml Chuẩn bị
Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun nóng, chỉnh pH sao cho
sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25oC , phân phối 5 ml mổi loại môi trường L – lysine decarboxylation, L- Ornithin decarboxylation và L- Arginin dihydrolation sang các ống nghiệm và khử trùng các ống nghiệm 15 phút ở 121oC
8.3 Môi trường để lên men hydrat cacbon ( nước peptone có phenol red, D- sorbitol, L-rhamnoza, D-sucroza, D-melibioza và amygdalin ) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thành phần
Dịch thủy phân casein bằng
Enzym
Natri Clorua (NaCl)
Đỏ phenol Nước 10 g 5g 0,02 g 1000 ml Chuẩn bị
Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun nóng, chỉnh pH sao cho
sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25oC. phân phối vào các bình cầu có dung tích
phù hợp khử trùng môi trường này 15 phút ở 121oC
b. Dung dịch Hydrat cacbon (D-sorbitol, L-rhamnoza, D-sucroza, D- melibioza và amygdalin ) 80mg/ml Thành phần Hydrat cacbon Nước 8 g 100 ml Chuẩn bị
Hòa tan riêng bốn thành phần Hydrat cacbon trong nước để thu được 4
dung dịch hydrat cacbon lọc và khử trùng
c. Môi trường lên men Hydrat cacbon hoàng chỉnh
Thành phần
Môi trường cơ bản
Dung dịch hydrat cacbon
875 ml 125 ml
Chuẩn bị
Đối với từng loại Hydrat cacbon, them dung dich Hydrat cacbon đã chuẩn
bị ở trên vào môi trường cơ bản,một cách vô trùng và trộn. Phân phối 10 ml môi trường hoàng chỉnh của từng hydrat cacbon vào các ống nghiệm
Thành phần
Natri xitrat Na3C6H5O7 Natri Clorua NaCl