Thiết bị khử trùng khô ( tủ sấy) , thiết bị khử trùng ướt (Autoclave)
Pipet Bể điều nhiệt Đĩa petri Tủ ấm Vòng cấy Ống nghiệm Máy đo pH 3.1.4 Lấy mẩu (TCVN 6400) - Dụng cụ
Dụng cụ chứa mẫu phải đủ lớn để chưa ¾ thể tích và cho phép trộn mẫu
trước khi dùng phương pháp lắc, các vật chứa phải có nắp đậy
Các dụng cụ phải là các hợp kim chịu nhiệt ở 180oC hoặc các dụng cụ bằng
chất dẻo sử dụng 1 lần. Có thể khử trùng theo các phương pháp sau
Phương pháp A : giữ trong không khí nóng từ 170-175oC kho dưới 2
giờ
Phương pháp B : giữ trong luồng hơi nóng từ 121oC không dưới 20
phút (Autoclave)
Phương pháp C : hơ trên ngọn lửa sao cho các dụng cụ tiếp súc trực
tiếp với lửa
Phương pháp D : nhúng các dụng cụ vào ethanol nồng độ ít nhất là 70%
Các dụng cụ sau khi khử trùng sẽ được bảo quản trong điều kiện vô trùng
trước khi sử dụng
- Cách lấy
Lấy tối thiểu 100g sau khi lấy bảo quản trong điều kiện vô trùng ở 30oC Luôn luôn lấy mẫu ở điều kiện vô trùng vì đây là lấy mẫu để kiểm tra vi sinh nên điều kiện vô trùng là cần thiết
Dùng dao hoặc thìa trộn vô trùng. Loại bỏ lớp sản phẩm trên bề mặt của
vùng lấy mẫu, lấy mẫu bằng ống xăm vô trùng. Cắm ống xăm khô sạch vào sản
phẩm nếu cần với những vật chứa nằm trên cạnh nó, cho khe cắm hướng xuống phía dưới với tốc độ xuyên đều khi ống xăm chạm tới đáy thùng xoay ống xăm 180o rút ra và đổ sản phẩm vào vật chứa mẫu và đậy ngay nắp lại. Nếu thấy có dấu hiệu
không tốt về điều kiện của lớp bột phía trên thì có thể lấy riêng từng lớp khác nhau
Mẫu là các sản phẩm đóng gói chưa mở, có thể dùng các vật chứa thích
3.1.5 Chuẩn bị mẩu thử (TCVN 6263)
- Nguyên tắc
Chuẩn bị mẫu thử bằng cách pha loãng các mẫu sản phẩm. Bằng các dung
dịch pha loãng ban đầu phù hợp với sản phẩm, nếu cần có có thể chuẩn bị pha loãng thập phân tiếp theo. Để giảm bớt số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích để thuận tiện cho việc kiểm tra vi sinh
- Cách làm
Các thao tác được thực hiện trong môi trường vô trùng, các dụng cụ thực
hiện là các dụng cụ và thiết bị dùng trong phòng thí nghiệm vi sinh
Trộn kỹ lượng sữa bột trong hộp kính bằng cách lắc đều và đảo liên tục,
nếu hộp quá đầy thì có thể chuyển qua hộp có kích thước to hơn để trộn đều. Mở (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nắp, dùng thìa xúc phần mẫu thử theo yêu cầu.
Hâm nóng lọ chứa 90ml dung dịch pha loãng thích hợp tới 45oC ± 1 trong nồi cách thủy
Cân 10g mẫu thử cho vào bình thủy tinh thích hợp và rót dần dung dịch
pha loãng vào
Để hòa tan, xoay tròn từ từ lọ này cho ướt bột sau đó lắc lọ 25 lần với
khoảng di động là 300mm trong khoảng 7 giây , có thể dùng máy trộn để thay cho
việc lắc
3.1.6 Qui trình phân tích (TCVN 7850:2008)
Chuẩn bị mẫu thử/tiền tăng sinh:
cân x g phần mẫu thử cho vào 9 lần x ml BPW
Ủ ở 37oC trong 18 giờ ± 2 giờ Ủ ở 44oC trong 24 giờ ± 2 giờ Ủ ở 44oC trong 24 giờ ± 2 giờ Ủ ở 25oC trong 48 giờ
Tăng sinh chọn lọc trong môi trường vancomyxin/mLST
Chuyển 0.1 ml từ BPW đã cấy vào 10 ml môi trường vancomyxin/mLST
Phân lập thạch sinh màu chọn lọc
Cấy vạch một vòng đầy dịch cấy từ môi trường vancomyxin/mLST lên Thạch sinh màu (ESIATM) trong đĩa petri
Khẳng định: sinh màu vàng
chọn năm khuẩn lạc điển hình cấy vạch lên đĩa chứa môi trường TSA
Khẳng định:sinh hóa
Chọn một khuẩn lạc màu vàng từ đĩa TSA để thử sinh hóa
3.1.7 Cách tiến hành
3.1.7.1 Phần mẫu thử
Để chuẩn bị cho dung dịch pha loãng ban đầu, lấy một lượng x gam phần
mẫu thử cho vào môi trường tiền tăng sinh BPW với thể tích lớn gấp 9 lần. Sao cho thu được tỷ lệ phần mẫu thử với môi trường tiền tăng sinh được qui định trong phương pháp này.
Để yên cho các mẫu khô tan trong môi trong dịch lỏng mà không cần
khuấy trộn nếu sau 30 phút không tan hết thì có thể trộn nhẹ nhàng
3.1.7.2 Tiền tăng sinh
Ủ mẫu đã cấy trong môi trường PBW tiền tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ. E. sakazakii trong môi trường ban đầu ít hay bị tổn thương. Môi trường này giúp các vi sinh vật phục hồi và tăng số lượng trước khi đi cấy
3.1.7.3 Tăng sinh chọn lọc
Sau khi ủ trong môi trường tiền tăng sinh, dùng pipetman chuyển 0,1 ml
dịch cấy thu được từ môi trường BPW vào 10ml môi trường vancomyxin/mLST là (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
môi trường tăng sinh E. sakazakii nó .ủ ở 44 oC trong 24 giờ
Nên sử dụng nồi cách thủy hoặc tủ ấm để đảm bảo rằng nhiệt độ tối đa
44,5oC
3.1.7.4 Phân lập Enterobacter sakazakii giả định
Sau khi ủ ở môi trường vancomyxin/mLST, tiếp tục cấy ria một vòng đầy
khoảng 0,1µl lên bề mặt đĩa thạch môi “trường phân lập Enterobacter sakazakii giả định (ESIATM)” ủ ở 44oC trong 24 giờ
Sau khi ủ kiểm tra đỉa thạch sinh màu về sự có mặt hay không có mặt của
các khuẩn lạc điển hình của Enterobacter sakazakii giả định
Các khuẩn lạc điển hình có màu xanh cây đến xanh lục, cỡ nhỏ từ 1 – 3 mm các khuẩn lạc không điển hình thường hơi trong suốt và có màu tím
Hình 3.1 : E. sakazakii trong môi trường ESIA
3.1.7.5 Khẳng định
Chọn từ 1 đến 5 khuẩn lạc E. sakazakii giả định điển hình đã được kiểm tra trên đĩa thạch ủ.
Cấy vạch các khuẩn lạc đã chọn trong môi trường ESIATM lên môi trường
TSA sao cho khi ủ quan sát được các khuẩn lạc tách biệt. Ủ đĩa này ở 25oC từ 44
giờ đến 48 giờ sau khi ủ quan sát các khuẩn lạc sinh màu vàng.
Một vài chủng đặc biệt của E. sakazakii có thể không sinh màu vàng trong
các điều kiện thử nghiệm qui định. Hoặc mất sắc tố do cấy truyền. Trong trường
hợp này thì các khuẩn lạc như thế sẽ bị bỏ sót
3.1.8 Phân lập Enterobacter sakazakii trên môi trường vi sinh Brilliance
Enterobacter sakazakii Agar[7].
- Nguyên tắc
Brilliance™ Enterobacter sakazakii Agar (công thức chuẩn Chromogenic
Enterobacter sakazakii Agar) là môi trường sử dụng cho việc phân lập và đếm
Enterobacter sakazakii từ mẫu thực phẩm
Brilliance Enterobacter sakazakii Agar dựa trên phản ứng anpha- glucosidase, phản ứng này dựa trên sự kết hợp chặt chẽ giữa cơ chất chromogenic
5-bromo-4-chloro-3indolyl-anpha-D-glucopyranoside có mặt trong môi trường.
Enzyme anpha-glucosidase, hiện diện trong Enterobacter sakazakii, cơ chất
hydrolyses sinh ra khuẩn lạc màu xanh trên đĩa môi trường màu vàng xám.
Proteus vulgaris cũng có hoạt tính anpha-glucosidase dương tính yếu và cũng có thể phát triển để sinh ra những khuẩn lạc có màu tương tự như E. sakazakii.
Tuy nhiên trên môi trường này, Proteus spp mọc lên những khuẩn lạc màu xám: chúng sản sinh ra hydrogen sulphide trong sự hiện diện của ferric ions hình thành nên ferrous sulphide. Desoxycholate có tác dụng làm ẩn đi sự phát triển của (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hầu hết vi sinh vật Gram dương .
- Môi trường
EE broth
Brilliance Enterobacter sakazakii Agar
-Cách tiến hành
Các mẫu được giữ ấm trong nước qua đêm, sau đó được làm giàu trong
môi trường EE broth
Dùng một que cấy vòng lấy 10µl từ canh thang đã được giữ ấm EE broth
và trải đều lên bề mặt của thạch Brilliance Enterobacter sakazakii Agar pleate. Giữ ấm đĩa thạch ở 35-37°C trong 24 giờ, và quan sát khuẩn lạc màu xanh lá cây
Xác định số khuẩn lạc bằng phương pháp đếm hoặc bằng phương pháp sinh
Kết quả : Dương tính các khuẩn lạc có màu xanh lá cây
Hình 3.3: Khuẩn lạc Enterobacter sakazakii trên môi trường Brilliance
Enterobacter sakazakii Agar
3.1.9 Phân lập Enterobacter sakazakii trên môi trường MacConkey
- Nguyên tắc
Thạch MacConkey là môi trường chọn lọc cho các vi khuẩn thuộc họ vi
khuẩn đường ruột và các trực khuẩn gram âm khác có trong một quần thể hỗn tạp và phân biệt chúng có lên men lactose hay không men lactose. Muối mật và tinh thể
màu tím ức chế hầu hết các vi khuẩn gram dương nhưng cho phép các thực khuẩn
gram âm mọc được. Đường lactose như là nguồn carbonhydrat duy nhất. Trực
khuẩn gram âm, nếu lên men sẽ sinh ra khuẩn lạc màu hồng hoặc màu đỏ. Ngược
lại, nếu không lên men lactose thì khuẩn lạc không có màu hoặc khuẩn lạc có màu trong.
- Phương pháp thực hiện
Sử dụng môi trường MacConkey, và các vi khuẩn được cấy lên môi trường này. Đặt vào tủ ấm 35oC từ 18-24 giờ. Vi khuẩn có thể lên men lactose mạnh hay
yếu trong 24 giờ nuôi cấy sinh ra các khuẩn lạc có màu hoặc xuất hiện màu hồng
nhẹ 24-48 giờ không nuôi cấy quá 48 giờ như thế sẽ làm đảo lộn kết quả.
E. sakazakii có màu xanh
Hình 3.4: E. sakazakii trên môi trường Macconkey sau 24 giờở 36oC, khuẩn
lạc có màu hồng
3.1.10 Khẳng định sinh hóa
3.1.10.1 Môi trường và thuốc thử trong thử nghiệm sinh hóa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thuốc thử phát hiện oxidase
- Môi trường Lysine decarboxylase
- Môi trường Ornithin decarboxylase - Môi trường Arginin dehydrolase
- Môi trường để lên men hydrat carbon (Nước peptone có phenol, D- sorbitol, L-rhamnose, D- sucrose và amygdalin)
- Môi trường lên men carbohyrat hoàn chỉnh + Môi trường cơ bản
+ Dung dịch hydrat carbon ( D- sorbitol, L- rhamnose, D-sucrose, D- melibiose và amygdalin ) 80 mg/ml
+ Môi trường carbohyrat hoàn chỉnh
- Môi trường simmons citrate
- Môi trường ONPG borth
3.1.10.2 Phép thử Oxydase
Dùng kim cấy sử dụng một lần hoặc que cấy bằng thủy tinh lấy 1 phần của
mỗi khuẩn lạc đặc trưng đã chọn
Ria cấy lên giấy lọc được làm ẩm bằng thuốc thử oxydase. Không sử dụng
vòng cấy hoặc que cấy bằng niken/crom
Nếu màu của giấy lọc không đổi sang màu tím hoa cà màu tím hoặc màu
xanh đậm thì phản ứng được coi là âm tính
3.1.10.3 Phép thử L-Lysin decarboxylase, L-Ornithin decarboxylase
Dùng que cấy, que cấy hoặc đũa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngay dưới bề mặt môi trường lỏng Lysine decarboxylase và Ornithin decarboxylase ủ các ống này ở 30o C từ 24 giờ
Sau khi ủ có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính màu vàng chứng tỏ âm
tính
3.1.10.4 Phép thử L- arginin dihydrolase
Dùng que cấy hoặc đũa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngay
dưới bề mặt môi trường lỏng Arginin dehydrolase ủ các ống này ở 30o C từ 24 giờ
Sau khi ủ có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính màu vàng chứng tỏ âm
tính
3.1.10.5 Phép thử lên men các loại đường khác nhau
Dùng que cấy hoặc đũa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngay
dưới bề mặt môi trường lỏng lên men Hydrat carbon ủ các ống này ở 30oC từ 24
giờ
Sau khi ủ có màu vàng chứng tỏ phản ứng dương tính màu đỏ chứng tỏ âm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
tính
3.1.10.6 Phép thử chỉ sử dụng Citrate
Dùng vòng cấy hay que cấy lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy lên bề mặt
nghiêng của môi trường Simmons citrate ủ các ống nghiêng này ở 30oC từ 24h
3.1.10.7 Thử nghiệm Nitrate
- Nguyên tắc
Phương pháp này nhằm xác định vi sinh vật có nitratase để khử nitrate
thành nitrite hay không
VSV nào có khả năng khử nitrate thành nitrite Đó là các vi sinh vật hiếu
khí tùy nghi
Các vi sinh vật có khả năng khử nitrate tổng hợp hệ enzyme nitratase xúc
tác sự khử nitrate thành nitrite và nitơ phân tử. Sự khử nitrate còn được gọi là sự
phản nitrate hóa, diễn ra trong điều kiện không có oxy phân tử . Đây là cách biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp kị khí
Sản phẩm cuối cùng của sự khử này có thể là nitrite (NO2-), amoniac (NH3), nitơ phân tử (N2), hydroxylamine (NH2OH) hay nitric oxide (NO)
Hoạt tính nitratase được định tính dựa trên sự tạo thành nitrite và sự cạn
kiệt nitrate
Nitrite được tạo ra từ nitrate sẽ phản ứng với sulphanilamide và N- napthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho hợp chất màu hồng
Tuy nhiên do nhiều vi sinh vật tiếp tục chuyển hóa nitrite thành các hợp
chất khác nên mặc dù có sự hiện diện của nitratase nhưng môi trường cũng không
xuất hiện màu hồng. Trường hợp này tiến hành kiểm chứng sự cạn kiệt của nitrate
bằng bụi kẽm kim loại, nitrate sẽ phản ứng với bụi kẽm tạo màu hồng.
- Phương pháp tiến hành
Có thể thực hiện bằng một số cách sau
+ Cách 1: môi trường sử dụng là ống môi trường lỏng Nitrate Broth.
Cấy sinh khối chủng thuần và ủ ở 37oC qua đêm
+ Cách 2 : Dùng que cấy vòng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc chủng
thuần, khuếch tán dày đặc chủng vật thử nghiệm (E. sakazakii) vào ống nghiệm
chứa dung dịch sodium nitrate 0,01M trong đệm phosphate 20 Mm, pH= 7 ủ ở 37oC trong 24 giờ
+ Cách 3 : nhỏ vài giọt dung dịch sodium nitrate 1% vào dịch nuôi
cấy đã nuôi cấy ở cuối pha log. Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 4 giờ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau thời gian ủ, acid hóa môi trường bằng cách bổ sung vài giọt HCl 1N sau đó bổ sung 0,5ml dung dịch sulphanilamide 0,2% và 0,5ml N-
napthylethylenediamine hydrochloride được bảo quản trong tủ lạnh để định tính
nitrite. Khi phản ứng định tính nitrate (-) thì bổ sung một lượng nhỏ bụi kẽm để định tính nitrate
- Đọc kết quả
Thử nghiệm nitratase là (+) khi có sự xuất hiện màu hồng
Trường hợp không xuất hiện màu hồng, tiếp tục định tính nitrate bằng bụi
kẽm. Nếu phản ứng định tính nitrate cho màu hồng ( do sự hiện diện của nitrate ) thì thử nghiệm nitratase là (-), ngược lại nếu không chuyển màu thì thử nghiệm
nitratase là (+)
Hình 3.5 : Thử nghiêm nitratase (+) khi xuất hiện màu đỏ
3.1.10.8 Thử nghiệm ONPG
- Nguyên tắc
Các vi khuẩn chỉ lên men lactose khi có sự tổng hợp trong tế bào của
enzyme là β-galactosidase có vai trò xúc tác sự thủy phân lactose vào bên trong tế
bào. Một số vi khuẩn không có gen mã hóa enzyme β -galactosidase nên không thể
lên men lactose
Hoạt tính của enzyme này có thể được xác định dựa vào cơ chất tổng hợp
Sự thủy phân của cơ chất đường này bởi β -galactosidase sẽ phóng thích o- nitrophenol có màu vàng
- Phương pháp tiến hành
Môi trường dùng cho thử nghiệm này là ONPG Broth chứa 0,6% o- nitrophenyl-D-galactopyranoside trong dung dịch Na2HPO4 1mM
Môi trường được khử trùng bằng màng lọc vô trùng với kích thước lỗ 0,45 µm và được phân thành các dung tích 2ml vào trong các ống nghiệm vô trùng
Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần vào ống môi trường. Ủ ở 37oC qua đêm
- Đọc kết quả
Thử nghiệm ONPG là (+) khi có sự chuyển vàng trong ống dung dịch nuôi
cấy, là (-) khi không có sự chuyển màu của môi trường
Hình 3.6 : Kết quả thử nghiệm ONPG (+) ống nghiệm màu vàng
3.1.10.9 Thử nghiệm tính di động trên thạch mềm
- Nguyên tắc
Vi sinh vật di động nhờ cấu trúc protein gọi là tiên mao có nhiều ở vi
khuẩn hình que, một số vi khuẩn hình cầu
Khả năng di động là một trong những căn cứ có thể dùng để phân biệt vi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
sinh vật. Khả năng này có thể được quan sát dựa vào sự tăng trưởng và di động của
vi sinh vật vào bên trong môi trường thạch mềm
Sử dụng thạch mềm chứa 0,5% agar. Môi trường được đun tan, phân phối
thành dung tích 5ml vào các ống nghiệm vô trùng, và được hấp khử trùng ở nhiệt độ
121oC trong 15 phút các ống môi trường này được làm nguội ở trạng thái đứng và bảo quản ở 4 – 10oC .
Dùng que cấy thẳng thu sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần sau khi ủ ở