ADN khuôn
ADN khuôn (DNA template) hay còn gọi là ADN mục tiêu được sử dụng làm cái khuôn để các mồi PCR gắn vào vị trí bổ sung với nó, sau đó với sự tham gia
mới giống hệt đoạn ADN nằm giữa hai vị trí gắn mồi. Từ chu kỳ thứ hai trở đi, ngoài ADN khuôn ban đầu, những đoạn ADN vừa được tổng hợp cũng được sử
dụng làm khuôn cho những chu kỳ tổng hợp tiếp theo.
Mồi PCR
Việc lựa chọn primer rất quan trọng cho một phản ứng PCR. Đoạn mồi cần có kích thước hợp lí, từ 18-25 nucleotide, có trình tự bổ sung với trình tự 2 đầu
mạch khuôn. Mồi càng dài khả năng tổng hợp ADN càng chính xác. Ngược lại khi
mồi quá ngắn quá trình bắt cặp giữa mồi và khuôn không thuận lợi nên cho kết quả PCR kém độ chính xác có 2 loại mồi là mồi xuôi ( forward primer, kí hiệu là F), và mồi ngược (reverse peimer, kí hiệu là R) tham gia phản ứng PCR
Mồi xuôi bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 5’ 3’, mồi ngược bắt
cặp bổ sung gắn ở đầu 3’của mạch khuôn 3’ 5’. Mồi ảnh hưởng đến rất nhiều đến
phản ứng PCR, để đảm bảo hiệu quả phản ứng PCR cần chọn các mồi xuôi và
ngược có trình tự không bổ sung với nhau, tránh xảy ra hiện tượng các cặp mồi bắt
cặp nhau, có nhiệt độ nống chảy (tm) gần giống nhau.Nếu biết trình tự của các đoạn
gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng để thể hiện
PCR và tách chúng ra bằng kĩ thuật điện di. Hiệu quả PCR cao khi có mồi phù hợp
với khuôn và khoảng cách giữa mồi xuôi và ngược không qúa 1kb dNTP
dNTP (A, T, G, C là những “viên gạch” để xây dựng lên sợi ADN mới
trong phản ứng chuỗi. Nồng độ của dNTP thường sử dụng cho mỗi phản ứng là 200M. Nếu nồng độ dNTP quá cao nó sẽ liên kết với Mg2+, một ion rất cần cho sự
hoạt động của enzym tổng hợp, vì vậy mà sẽ ảnh hửng tới phản ứng tổng hợp.
dNTP rất nhậy cảm với sự thay đổi nhiệt độ, cứ sau 35 chu kỳ của PCR thì dNTP hầu như đã bị suy giảm, trong một môi trường acid nó sẽ chuyển hoá nhanh thành dNDP và dNMP. Do vậy mà dNTP là chất không bền, đặc biệt sử dụng cho PCR.
Là một thành phần quan trọng của phản ứng PCR. Trong điều kiện thích
hợp cùng với các thành phần cần thiết khác, enzym hoạt động tổng hợp nên ADN mới. Nồng độ sử dụng enzym phụ thuộc vào mỗi loại enzym và thuộc tính của nó,
có thể sử dụng từ 1 đến 2 đơn vị enzym sẽ cho hiệu quả tốt nhất với PCR có thể tích
25l. Nếu quá nhiều enzym có thể sẽ làm tăng nồng độ glycerol trong dung dịch
phản ứng, dẫn tới quá trình tổng hợp không đồng đều giữa các vị trí và tạo ra hình
ảnh điện di không rõ nét. Ngược lại, nếu quá ít sẽ thiếu enzym và kết quả nhận được
là sản phẩn tổng hợp không đầy đủ.
Dung dịch đệm PCR
Dung dịch đệm chung nhất của PCR bao gồm các thành phần KCl, MgCl2
và Tris. Muối KCl góp phần làm tăng hiệu quả của phản ứng, thông thường những
mồi cho sản phẩm PCR với kích thước lớn hơn thì hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối thấp hơn và ngựơc lại những đôi mồi cho sản phẩm PCR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ngắn hơn sẽ hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối cao hơn. MgCl2 là nhân tố cần thiết để enzym Taq hoạt động, nếu nồng độ MgCl2 thấp, sẽ ức chế sự
hoạt động của enzym Taq, tuy nhiên nếu nồng độ quá cao sẽ cho kết quả PCR không đặc hiệu. Tris có vai trò giữ cho pH dung dịch ổn định, sự thay đổi nồng độ
của Tris không ảnh hưởng nhiều đến kết quả phản ứng PCR.