- Nguyên tắc
Phương pháp này nhằm xác định vi sinh vật có nitratase để khử nitrate
thành nitrite hay không
VSV nào có khả năng khử nitrate thành nitrite Đó là các vi sinh vật hiếu
khí tùy nghi
Các vi sinh vật có khả năng khử nitrate tổng hợp hệ enzyme nitratase xúc
tác sự khử nitrate thành nitrite và nitơ phân tử. Sự khử nitrate còn được gọi là sự
phản nitrate hóa, diễn ra trong điều kiện không có oxy phân tử . Đây là cách biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp kị khí
Sản phẩm cuối cùng của sự khử này có thể là nitrite (NO2-), amoniac (NH3), nitơ phân tử (N2), hydroxylamine (NH2OH) hay nitric oxide (NO)
Hoạt tính nitratase được định tính dựa trên sự tạo thành nitrite và sự cạn
kiệt nitrate
Nitrite được tạo ra từ nitrate sẽ phản ứng với sulphanilamide và N- napthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho hợp chất màu hồng
Tuy nhiên do nhiều vi sinh vật tiếp tục chuyển hóa nitrite thành các hợp
chất khác nên mặc dù có sự hiện diện của nitratase nhưng môi trường cũng không
xuất hiện màu hồng. Trường hợp này tiến hành kiểm chứng sự cạn kiệt của nitrate
bằng bụi kẽm kim loại, nitrate sẽ phản ứng với bụi kẽm tạo màu hồng.
- Phương pháp tiến hành
Có thể thực hiện bằng một số cách sau
+ Cách 1: môi trường sử dụng là ống môi trường lỏng Nitrate Broth.
Cấy sinh khối chủng thuần và ủ ở 37oC qua đêm
+ Cách 2 : Dùng que cấy vòng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc chủng
thuần, khuếch tán dày đặc chủng vật thử nghiệm (E. sakazakii) vào ống nghiệm
chứa dung dịch sodium nitrate 0,01M trong đệm phosphate 20 Mm, pH= 7 ủ ở 37oC trong 24 giờ
+ Cách 3 : nhỏ vài giọt dung dịch sodium nitrate 1% vào dịch nuôi
cấy đã nuôi cấy ở cuối pha log. Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 4 giờ
Sau thời gian ủ, acid hóa môi trường bằng cách bổ sung vài giọt HCl 1N sau đó bổ sung 0,5ml dung dịch sulphanilamide 0,2% và 0,5ml N-
napthylethylenediamine hydrochloride được bảo quản trong tủ lạnh để định tính
nitrite. Khi phản ứng định tính nitrate (-) thì bổ sung một lượng nhỏ bụi kẽm để định tính nitrate
- Đọc kết quả
Thử nghiệm nitratase là (+) khi có sự xuất hiện màu hồng
Trường hợp không xuất hiện màu hồng, tiếp tục định tính nitrate bằng bụi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
kẽm. Nếu phản ứng định tính nitrate cho màu hồng ( do sự hiện diện của nitrate ) thì thử nghiệm nitratase là (-), ngược lại nếu không chuyển màu thì thử nghiệm
nitratase là (+)
Hình 3.5 : Thử nghiêm nitratase (+) khi xuất hiện màu đỏ