Trang thiết bị và dụng cụ
- Tủ cấy vô trùng - Tủ lạnh lưu mẫu
- Máy khuấy từ
- Máy nhiệt khô
- Máy ly tâm
- Vortex mixer (máy trộn mẫu)
- Các loại Eppendorf 0,2; 0,5; 1,5 ml
- Cân phân tích - Bếp điện
- Kéo, đèn cồn
- Bộ điện di nằm ngang và bộ nguồn
- Máy tru trình nhiệt (Mastercycler)
- Tủ UV
Chuẩn bị mẫu Mẫu sữa bột
Các loại sữa bột cho trẻ em bị nghi ngờ có sự hiện diện của Enterobacter sakazakii. Các mẫu được lấy trong môi trường vô trùng mỗi mẫu lấy không hơn
100g
Cho 100g mẫu vào bình chứa với thể tích thích hợp và cho vào 900ml nước
cất vô trùng ở nhiệt độ 45oC và ủ qua đêm ở nhiệt độ 37oC . sau khi ủ lấy ra 2ml dung dịch đã được ủ cho vào eppendorf để tách chiết DNA
Mẫu vi sinh vật
Các loại vi khuẩn được nuôi giữ trong môi trường TSB có chứa 15%
glycerol ở nhiệt độ - 20 oC và được cấy trên môi trường TSA trước khi đem thử
Tách chiết DNA
Nguyên tắc : Việc thu nhận DNA từ tế bào vi khuẩn được tiến hành thông qua nhiều bước. Các giai đoạn cơ bản của tách chiết DNA bao gồm:
(1) Phá màng tế bào và màng nhân. (2) Loại protein.
(3) Tủa DNA.
Đối với mẫu sữa bột Trước khi chiết xuất DNA, 2ml mẫu được đem đi ly
Thêm 800µl đệm phosphate (1 phần 120 mM NaH 2PO4 và 9 phần 120 mM
Na2HPO 4 ), 700 µl phenol và 100 µl 20% (m / v) sodium dodecyl sulfate (SDS) hỗn hợp này được vortexed trong 2 phút và sau đó ủ ở 60oC trong 20 phút.
Sau khi ủ, mẫu được ly tâm trong 5 phút tại 1 500 xg lấy phần dung dịch là dung dịch DNA loại bỏ phần cặn bên dưới là các xác protein
Bổ sung vào phần dung dịch với 600 µl phenol gồm phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1) hòa tan hỗn hợp trên và được ủ trên nước đá 1 giờ và sau
đó ly tâm trong 10 phút ở 15 000 xg
Sau khi ly tâm loại bỏ phần dung dịch . phần cặn được rửa bằng cồn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ethanol 70% và ly tâm trong 5 phút ở 15 000 x g sau khi ly tâm hút phần dung dịch
ra cẩn thận không được làm mất phần cặn. Làm khô phần cặn bằng không khí khô sau đó bổ sung thêm 100µl TE (10 mM Tris (Fluka), 1 mM EDTA (Merck), pH 8).
Để hòa tan phần cặn
Phản ứng PCR
Gene Primer Sequence (5’ – 3’)
ompA ESSF
ESSR
GGATTTAACCGTGAACTTTTCC CGCCAGCGATGTTAGAAGA
Phản ứng xảy ra với thể tích 25 µl có chứa 1 U (0,35 µl) Taq ADN polymerase , 2,5 µl đệm magiê cùng với enzym, 2 mM (1,5 µl) MgCl2, 1 µl dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 mM (1 µl) dNTPs, 0.5 µM (0,5 µl) mỗi mồi và 750 µg / ml (1 µl) mẫu DNA, và 1 µl DNA chiết xuất từ vi khuẩn E. sakazakii đã được thêm vào để biểu hiện kết quả và 1 µl nước cất vô trùng (mẫu chứng dương)
Phản ứng PCR được thực hiện bằng máy chu trình nhiệt ( Mastercycler ).
Giai đoạn biến tính : Hỗn hợp được giữở nhiệt độ 95oC trong 2 phút làm biến tính tách 2 đoạn DNA quá trình này được thực hiện trong 35 chu kì trong 35 giây ở 95oC để biến tính thêm
Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ được hạ xuống 61oC trong 1 phút
Giai đoạn kéo dài DNA : tăng lên 72oC trong 1 phút để kéo dài đoạn mồi và giai đoạn này kéo dài 10 phút
Sau khi trải qua chu trình nhiệt hỗn hợp sẽ được cho lên gel agarose có chứa ethidium bromide và đem điện di và được đọc kết quả dưới tia UV
Đọc kết quả
Hình 3.9 : Kết quả sau khi điện di sử dụng cặp mồi ESSF và ESSR giếng 1-17
đều cho kết quả (+) tính với đoạn gen ompA. Giếng 1 là chứng dương và giếng C là chứng âm M là trọng trượng phân tử