LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÌM HIỂU QUY TRÌNH ĐỊNH HCV BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.1. Giới thiệu về bệnh viêm gan C [1,9] 1.1.1. Giới thiệu chung Gan là cơ quan nội tạng lớn nhất và đảm nhận nhiều vai trò chức năng quan trọng của cơ thể như hỗ trợ tiêu hóa, điều hòa chuyển hóa năng lượng, dự trữ máu, khử độc,… Viêm gan là tính trạng gan bị sưng hoại tử tế bào gan, giảm hoặc mất dần chức năng hoạt động. Có nhiều nguyên nhân gây viêm gan như thuốc, rượu, chất độc,… quan trọng và phổ biến nhất là do nhiễm siêu vi. Có nhiều loại siêu vi viêm gan: A, B, C, D, E, G, TT virus, Sen virus,… trong đó, chỉ có virus gây viêm gan B, C, D là có thể gây viêm gan mãn tính, xơ gan và dẫn đến ung thư gan. Bệnh viêm gan siêu vi C lần đầu được phát hiện vào năm 1989, do Hepatitis C virus gây ra. Bệnh thường ít gây triệu chứng rõ ràng và điển hình. Chủ yếu là các dấu hiệu mệt mỏi, chán ăn rối loạn tiêu hóa, ít khi bị vàng da. Việc phát hiện bệnh hầu hết là do tình cờ khi xét nghiệm máu hoặc kiểm tra sức khỏe. Diễn tiến bệnh âm thầm, chưa có vacxin phòng ngừa, tỷ lệ chuyển thành xơ gan và ung thư gan cao hơn so với bệnh viêm gan so siêu vi B. Mặt khác, chi phí điều trị bệnh là khá cao và cần tuân theo phát đồ điều trị chặt chẽ . Do đó, việc xét nghiệm máu định kỳ là rất cần thiết để phát hiện bệnh gan sớm. 1.1.2. Lịch sử phát hiện viêm gan siêu vi C Năm 1975, Prince và cộng sự nhận định rằng có một chứng bệnh viêm gan siêu vi sau truyền máu không do viêm gan siêu vi B và có thời kỳ ủ bệnh dài hơn thời ủ bệnh do viêm gan siêu vi A. Sau đó, các tác giả: Bassler và cộng sự (1995), Lee và cộng sự (1993), Livak và cộng sự (1995) chứng minh về mặt huyết thanh học rằng bệnh viêm gan siêu vi loại này không có liên quan gì đến bệnh viêm gan siêu vi A và từ lúc này danh từ “bệnh viêm gan siêu vi không A không B” ra đời. Vào tháng 5 năm 1989 bằng phương pháp ly tâm siêu tốc huyết tương thu từ những con tinh tinh bị bệnh viêm gan siêu vi, Choo và cộng sự (1989) đã tách chiết nucleic acid của virus, tổng hợp cDNA từ RNA tách chiết, chèn vào bộ gen của λgt11 và xâm nhiễm E. coli, thu được có một dòng có phản ứng đặc hiệu với kháng thể có trong huyết thanh người bị bệnh viêm gan siêu vi không A không B sau SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP truyền máu. Cuối cùng, Choo và cộng sự (1989) xác định rằng bệnh viêm gan siêu vi không A không B do một loại siêu vi mới gây ra, đó là siêu vi C (HCV). 1.2. Dịch tể học [3,11] 1.2.1 Tình hình nhiễm siêu vi C trên thế giới Hình 1.1: Bản đồ phân bố tỷ lệ nhiễm HCV trên thế giới (Nguồn: www: WHO, 2008) Theo ước tính của tổ chức y tế thế giới WHO, trung bình 3% dân số thế giới nhiễm viêm gan siêu vi C , 170 triệu người mang virus này dạng mạn tính. Trong đó, Đông Nam Á có khoảng 32,3 triệu người bị nhiễm, chiếm 2.15% dân số khu vực này. Tần suất toàn bộ của HCV ở cộng đồng chung được báo cáo theo từng lục địa với tần suất trung bình 5.17% ở Châu Phi , 3.5% ở Châu Á, 1,93% ở Châu Mỹ, 1,75% ở Châu Âu, và 1.88% ở Châu Đại Dương. Tính trên toàn cầu là 2.856% có nghĩa là khoảng 210 triệu người nhiễm HCV trên toàn thế giới. Ở các nước phát triển, HCV là nguyên nhân của 20% các ca viêm gan cấp, 70% viêm gan mạn, 40% xơ gan giai đoạn cuối, 60% ung thư gan, 30% ca ghép gan. Ở các nước đang phát triển, HCV là nguyên nhân của 18% các ca viêm gan cấp, 69% viêm gan mạn, 33% xơ gan giai đoạn cuối, 52% ung thư gan, 32% ca ghép gan. Ở các nước kém phát triển, HCV là nguyên nhân của 36% các ca viêm gan cấp, 75% viêm gan mạn, 50% xơ gan giai đoạn cuối, 66% ung thư gan, 38% ca ghép gan. Trong các genotype của HCV, gen type 1 chiếm tỷ lệ cao nhất trên thế giới nói chung và ở nước Mỹ nói riêng với 35% loại 1a và 35% loại 1b. Genotype 3 thường thấy ở Pakistan, Úc, Scotland. Genotype 4 ở Trung Đông và Châu Phi cũng như SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 3 Không có KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP South Africa. Genotype 6 tại Hồng Kông và Macau. 1.2.2. Tình hình nhiễm siêu vi C ở Việt Nam [7,13] Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HCV 1,8% dân số cả nước. , trung bình từ 1-3 trường hợp/100000 người mỗi năm. Theo Trương Xuân Liên (2010), tỷ lệ nhiễm HCV ở một số đối tượng tại TP.HCM là : trên người tiêm chích ma túy là 96,2%, nhiễm HIV là 73,6%, bệnh nhân xơ gan : 47,8%, bệnh nhân viêm gan : 26,6%, bệnh nhân ung thư gan : 23,2%, bệnh nhân nghi viên gan :19,3%, người cho máu : 14%, gái mại dâm : 9,9%, bệnh nhân da liễu : 6,9%, nhân viên y tế : 3,28% và người cho máu bình thường : 2,53%. Nakata và cộng sự (2007) khảo sát trên người không có bệnh gan ở 2 thành phố lớn là Hồ Chí Minh và Hà Nội thì thấy tỉ lệ có kháng thể kháng HCV (anti- HCV) lần lượt là 9% (43/491) và 4% (18/511). Phân bố kháng thể không phụ thuộc theo tuổi. Cũng trong nghiên cứu này, ở TP.HCM, tần suất nhiễm anti-HCV khá cao ở người tiêm chính ma túy 87%, bệnh nhân đang thẩm tách máu : 54%, hoặc có bệnh ưa chảy máu : 29%. Nghiên cứu cũng cảnh báo cần sàng lọc anti-HCV ở người cho máu vì mục đích thương mại là quan trọng. Theo Trần Thanh Dương và cộng sự (2009) nghiên cứu kiểu gen của 14 bệnh nhân viêm gan tại Hà Nội thì thấy các kiểu gen 1a, 1b và 6a lần lượt là 4, 4 và 6 trường hợp. Cũng chính tác giả này, phân tích HCV ở phụ nữ mại dâm tại Hà Nội thì thấy có nhiều kiểu gen : 1a, 1b, 6, 6a, 9a. Cao nhất là 1a, 6a và 1b. 1.3. Con đường lây nhiễm HCV [5,7] HCV lây truyền theo đường máu và các đường lây chủ yếu sau :  Người nhận máu, chế phẩm máu hoặc các bộ phận cơ thể từ một người cho nhiễm HCV.  Nhân viên y tế: tiếp xúc với bệnh phẩm chứa siêu vi trong quá trình làm việc.  Ðường tình dục.  Mẹ truyền sang con. Dùng chung dao cạo, bàn chải răng, kềm cắt móng tay với người bị nhiễm siêu vi C, kim chích xăm mình hay xỏ lỗ tai không đảm bảo vô trùng. Tuy nhiên, 30-40% các trường hợp là không rõ nguyên nhân. SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.4 Diễn tiến bệnh [13,15] Sau khi bị nhiễm siêu vi, bệnh nhân có thời gian ủ bệnh từ 2 tuần – 6 tháng. Đây là giai đoạn nhiễm trùng cấp tính. Phần lớn bệnh nhân không có triệu chứng lâm sàng. Một số có biểu hiện mệt mỏi, chán ăn, … Việc chẩn đoán bệnh trong giai đoạn này dựa vào xét nghiệm máu. Sau 6 tháng, khoảng 85% bệnh nhân chuyển thành dạng mãn tính. Khi đó, bệnh diễn tiến thầm lặng có thể từ 10-30 năm. Khi bệnh nhân phát hiện thường vào giai đoạn cuối, khi các tế bào gan đã xơ, viêm và hoại tử Có hai dạng viêm gan mạn tính -Viêm gan C mãn tính có men ALT(Aspartate Amino Transferase) bình thường, (ALT do gan tạo ra thường có một hàm lượng cố định trong máu, trị số bình thường ALT < 40 U/L ,AST < 40 U/l) Trường hợp viêm gan C mãn tính có men ALT bình thường là khi bệnh nhân có sự hiện diện của anti-HCV, RNA HCV (+) bằng phương pháp PCR, và men ALT bình thường kéo dài. -Viêm gan C mãn tính có men ALT tăng : Bệnh nhân viêm gan C mãn tính thuộc vào loại này. Tùy theo tổn thương mô học mà chia làm hai loại: viêm gan mãn nhẹ và viêm gan mãn mức độ từ vừa đến nặng. Sự phân biệt này rất quan trọng về tiên lượng và chỉ định điều trị + Viêm gan mãn nhẹ: Viêm gan mãn nhẹ là khi sinh thiết gan cho thấy tổn thương mô học nhẹ. Theo cách tính của Knodell(1980) viêm gan mãn nhẹ là khi số điểm sơ hóa là 0 hoặc 1 và số điểm hoại tính viêm- hoại tử nhỏ hơn 6. + Viêm gan từ mức độ vừa đến nặng: Viêm gan từ mức độ vừa đến nặng là khi sinh thiết gan thấy có tổn thương viêm- họai tử đáng kể hoặc xơ hóa lan rộng. Theo cách tính của Knodell (1980) viêm gan mãn vừa và nặng được xác định là khi số điểm sơ hóa là 3 hoặc 4 và số điểm hoạt tính lớn hơn 6. SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Nhiễm cấp tính Không triệu chứng Mệt mỏi Viêm gan nặng Hồi phục Viêm gan mãn Hình 1.2: Sơ đồ diễn tiến bệnh siêu vi ( Nguồn: bệnh viện Hòa Hảo) 1.5. Biện pháp phòng ngừa và điều trị [20.23] 1.5.1. Biện pháp phòng ngừa Các vết máu khô từ những người nhiễm HCV có thể lây cho người khác trong khoàng thời gian từ 16 giờ đến 4 ngày, ở nhiệt độ phòng. Do đó, các vết máu cần phải được tẩy sạch và người thực hiện phải mang bao tay cao su. Không dùng chung ống chích, kim tiêm, bông băng. Không dùng chung dao cạo râu, bàn chải đánh răng, dụng cụ cắt móng tay. Quan hệ tình dục không an toàn. Băng vết thương để tránh tiếp xúc máu cho người khác. 1.5.2. Điều trị Điều trị viêm gan siêu vi đòi hỏi phải có kiến thức sâu về viêm gan và thuốc chống siêu vi . Do đó, bệnh nhân nên được điều trị và theo dõi bởi bác sĩ chuyên về viêm gan. SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 6 6 0 % 2 tuần- 6 tháng 3 9 % 15% 1 % Nhiễm cấp tính 1 0 - 3 0 n ă m Không triệu chứng Mệt mỏi Viêm gan nặng Hồi phục 85% Viêm gan không biến chứng 20% Biến chứng xơ và ung thư Viêm gan mạn Viêm gan không biến chứng 20% Biến chứng xơ và ung thư KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hiện nay, để chống lại viêm gan C là interferon, một thuốc ức chế sự nhân lên của virus. Các thuốc interferon dùng để điều trị viêm gan gồm: interferon α2b (Intron A), interferon α2a (Roferon-A) và interferon alfacon-1 (Infegen). Nhưng interferon chỉ có tác dụng ở khoảng 20% số trường hợp. Hiện nay, tiêm interferon thường được phối hợp với uống ribavirin-một thuốc kháng sinh virus phổ rộng. Điều trị thường mất sáu tháng đến một năm và thành công ở khoảng 40% số người bị HCV. Gần đây, một thuốc khác, interferon pegyl hóa có hiệu quả gấp hai lần interferon thông thường. Vào tháng 1-2001 Cơ quan quản lý thuốc và dược phẩm Mỹ đã cho phép dùng interferon pegyl hóa, interferon-peginterferon alfa-2b để điều trị viêm gan. Theo nghiên cứu của bác sĩ Nguyễn Thu Thủy-bệnh viện Hòa Hảo TP.HCM Hiệu quả điều trị phụ thuộc nhiều yếu tố như: giới tính, thời gian ủ bệnh, độ tuổi…… Yếu tố Thuận lợi Không thuận lợi Giới tính Độ tuổi Thời gian bệnh Xơ gan Cân nặng Nồng độ virus Genotype Nữ <40 Ngắn Không >75 kg Thấp Không phải type 1 Nam >40 Dài Có <75 kg Cao Type 1 Bảng 1.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điều trị bệnh viêm gan C Do đó, các lời khuyên được đưa ra để giữ gìn sức khỏe và bảo vệ gan:  Theo dõi và tuân theo sự chỉ dẫn của bác sĩ chuyên khoa.  Hạn chế tối đa các chất kích thích như rượu bia các loại nước có gas, các loại hóa chất, các loại phụ gia Hạn chế chất béo động vật. Không sử dụng bất ký loại thuốc gì nếu không có chỉ định của bác sĩ đặc biệt các loại thuốc giảm đau, thuốc an thần, thuốc ngủ… SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 7 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Sống khoẻ mạnh, tập luyện vừa phải, ăn uống điều độ, không uống rượu, nghỉ ngơi đầy đủ là những phương thức tốt cho bịnh nhân viêm gan C để giữ gìn sức khoẻ, năng lượng. SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 8 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN VỀ VIÊM GAN SIÊU VI C SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 9 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2.1. Hepatitis C virus -HCV [10,11] HCV được xếp vào họ Flaviviridae vì có một số đặc tính về cấu trúc gen tương tự như Flavivirus và Peptivirus. Do số lượng, việc xử lý protein virus và các đặc điểm sao chép có một số khác biệt, nên gần đây HCV được xếp vào giống mới của họ Flaviviridae với tên Hepacivirus. HCV lại có chung các đặc điểm với Picornavirus và các virus thực vật như Potyvirus, làm cho ta lầm tưởng HCV là một mắt xích tiến hóa giữa các virus thực vật và động vật. HCV thuộc nhóm Flavirus HCV là một siêu vi nhỏ, hình cầu, đường kính khoảng 55-65nm. Trọng lượng phân tử vào khoảng 4106 daltons. Bộ gen của siêu vi C là một chuỗi đơn RNA độ 95000 nucleotide chứa một khung đọc mở dịch mã dài mã hóa một polypeptide lớn 3010-3033 amino acid bắt đầu tại codon methionin trong khung đọc đầu tiên và nằm bên trong phần nucleocapside 30-35nm có cấu trúc đối xứng 20 mặt. Ở ngoài cùng là lớp vỏ lipid chứa các protein E1 và E2 tạo thành các phức hợp primer. Kiểu đọc mở HCV mã hóa một tiền chất polyprotein mà tiền chất này được xử lý đồng dịch mã hoặc sau dịch mã để tổng hợp các protein cấu trúc ( C, E1, E2, p7) và các protein không cấu trúc (NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a và NS5b). HCV có 6 gentype được ký hiệu theo thứ tự từ 1 đến 6. Mỗi gentype có nhiều type phụ. Trong đó, thường gặp nhất là các type 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5, 6. type 1a và 1b là khó chửa trị nhất vì độc lực mạnh của virus. Bên cạnh đó, HCV thường bị đột biến nên có khả năng tránh được các đáp ứng miễn dịch của cơ thể và dễ chuyển sang nhiễm mạn tính. 2.2. Cấu trúc HCV [4] Hình 2.1. Cấu trúc HCV SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 10 Protein vỏ E1 Protein vỏ E2 Protein liên kết màng NS2 Protein lõi [...]... phần đáng kể vào việc hình thành một phương pháp định lượng mới, đó là Real – Time PCR SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 20 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4 QUY TRÌNH REAL-TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG HCV 4.1 Kỹ thuật Real-Time PCR 4.1.1 Nguyên tắc SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 21 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Real-time PCR cũng dựa trên PCR thường, nhưng phương pháp này có thể định lượng được hàm lượng DNA/RNA có trong mẫu nhờ... phosphatase nên sẽ làm gia tăng độ nhạy của kỹ thuật Sau đó, cơ chất phát ánh sáng của alkaline phosphatase là CSPD được cho vào phản ứng và ánh sáng phát ra được phân tích bằng máy đo ánh sáng Hàm lượng trình tự mục tiêu được định lượng bằng giá trị RLU có hàm lượng tương ứng với hàm lượng trình tự đích có trong mẫu ban đầu 3.2.5 Kỹ thuật Real-Time PCR Các kỹ thuật cổ điển như Southern blot hay Northern... quả đơn giản Đây là phương pháp định lượng có khả năng thay thế cho định lượng bằng Real-Time PCR ở những nơi không có thiết bị chuyên dụng cho Real-Time PCR 3.2.3 PCR định lượng cạnh tranh Phương pháp này nhân bản trong cùng eppendorf một trình tự mục tiêu cần định lượng và một trình tự được gọi là chứng định lượng có nồng độ biết trước Các nồng độ giảm dần của chứng định lượng được cho vào từng phản... dẫn đến sự phát triển các phương pháp định lượng dựa trên cơ sở lai phân tử như RNAse protection, dot blot,… Tuy nhiên, các phương pháp này có chung nhựơc điểm là thời gian tiến hành kéo dài và cần một lượng nucleic acid ban đầu lớn Sự ra đời của kỹ thuật PCR đã khắc phục các nhược điểm nêu trên Các phương pháp định lượng dựa trên kỹ thuật PCR như PCR ELISA, PCR định lượng cạnh tranh,… ngày càng phát... Mx3000P Trang 29 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP C Máy ly tâm E Máy ủ nhiệt khô SVTH: BÙI QUANG THIỆU D Máy vortex F Máy ly tâm eppendorf 0.2ml Trang 30 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 4.1: Các loại Miropipette dùng trong Real-Time PCR 4.2 Quy trình thực hiện Kỹ thuật Real-Time PCR sử dụng mẫu dò Taqman đặc hiệu cho HCV Mỗi cặp mồi được thiết kế trong vùng 5’ không mã hóa 5’UTR của bộ gen HCV để nhân bản trình tự mục tiêu... bản của chứng định lượng và trình tự mục tiêu bằng nhau thì nồng độ thì nồng độ của trình tự mục tiêu chính là nồng của chứng định lượng trong phản ứng đó Thông thường, chứng định lượng được thiết kế sao cho gần giống với trình tự mục tiêu nhất về kích thước, thành phần nucleotide để sự nhân bản của trình tự mục tiêu không bị ức chế bởi chứng định lượng và ngược lại Tuy nhiên, chứng định lượng cũng... phân biệt được với trình tự mục tiêu bằng cách tăng kích thước hay them vị trí nhận biết của một enzyme cắt giới hạn vào trình tự của chứng định lượng SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 18 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3.2.4 Kỹ thuật Hybrid Capture Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc lai phân tử giữa một mạch của phân tử DNA mạch đôi và phân tử RNA tạo thành một thể lai DNA:RNA Các mẫu được xủ lý bằng dung dịch ly giải... tương ứng với hàm lượng PCR có trong mẫu Việc định lượng RNA HCV có trong mẫu được thực hiện bằng cách quy giá trị cường độ màu ỡ mỗi vi giếng vào một đường chuẩn xây dựng từ những mẫu có nồng độ RNA HCV biết trước Phương pháp này có khả năng phát hiện HCV với nồng độ là 600IU/ml Độ tuyến tính của phương pháp nằm trong khoảng 600IU/ml đến 850000IU/ml Phương pháp định lượng bằng PCR ELISA có khả năng... hợp RNA HCV mạch dương : Sau khi hình thành, chuỗi RNA mạch âm thành khuôn mẫu để tổng hợp bộ gen RNA mạch dương của virus mới Quá trình này được thực hiện bởi HCV RNA polymerase  Sự tạo vỏ ngoài HCV : Sự nảy chồi của HCV, các hạt RNA được tạo vỏ nảy chồi qua màng bào tương  Sự bài tiết HCV kết hợp chủ yếu với lưới nội bào tương với khoảng 10 12 virion HCV mỗi ngày 2.3.1.1 Nhiễm HCV cấp HCV được... PCR Dựa vào một đường cong chuẩn thiết lập với những hàm lượng bản sao xác định, có thể tính được số lượng bản sao HCV xác định, có thể tính được số lượng bản sao hiện diện trong mẫu ban đầu Quy trình thực hiện gồm 5 bước Thu mẫu Tách chiết RNA Thu nhận RNA Phân tích kết quả Thực hiện RT Thực hiện RealTime PCR 4.3 Thuyết minh quy trình 4.3.1 Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu -Lấy máu tĩnh mạch, lấy lúc . tương với khoảng 10 12 virion HCV mỗi ngày. 2.3.1.1. Nhiễm HCV cấp HCV được truyền từ người sang người theo đường máu hoặc tiếp xúc với dịch cơ thể người mang HCV. HCV có thể lưu hành tự do trong. trình này được thực hiện bởi HCV RNA polymerase.  Sự tạo vỏ ngoài HCV : Sự nảy chồi của HCV, các hạt RNA được tạo vỏ nảy chồi qua màng bào tương.  Sự bài tiết HCV kết hợp chủ yếu với lưới. gần đây HCV được xếp vào giống mới của họ Flaviviridae với tên Hepacivirus. HCV lại có chung các đặc điểm với Picornavirus và các virus thực vật như Potyvirus, làm cho ta lầm tưởng HCV là một