LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÌM HIỂU QUY TRÌNH ĐỊNH HCV BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR

Sau đó, các tác giả: Bassler và cộng sự 1995, Lee và cộng sự 1993, Livak và cộng sự 1995 chứng minh về mặt huyết thanh học rằng bệnh viêm gan siêu vi loại này không có liên quan gì đến b

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về bệnh viêm gan C [1,9]

1.1.1 Giới thiệu chung

Gan là cơ quan nội tạng lớn nhất và đảm nhận nhiều vai trò chức năng quan trọng của cơ thể như hỗ trợ tiêu hóa, điều hòa chuyển hóa năng lượng, dự trữ máu, khử độc,…

Viêm gan là tính trạng gan bị sưng hoại tử tế bào gan, giảm hoặc mất dần chức năng hoạt động Có nhiều nguyên nhân gây viêm gan như thuốc, rượu, chất độc,… quan trọng và phổ biến nhất là do nhiễm siêu vi Có nhiều loại siêu vi viêm gan: A, B, C, D, E, G, TT virus, Sen virus,… trong đó, chỉ có virus gây viêm gan B,

C, D là có thể gây viêm gan mãn tính, xơ gan và dẫn đến ung thư gan Bệnh viêm gan siêu vi C lần đầu được phát hiện vào năm 1989, do Hepatitis C virus gây ra Bệnh thường ít gây triệu chứng rõ ràng và điển hình Chủ yếu là các dấu hiệu mệt mỏi, chán ăn rối loạn tiêu hóa, ít khi bị vàng da Việc phát hiện bệnh hầu hết là do tình cờ khi xét nghiệm máu hoặc kiểm tra sức khỏe

Diễn tiến bệnh âm thầm, chưa có vacxin phòng ngừa, tỷ lệ chuyển thành xơ gan và ung thư gan cao hơn so với bệnh viêm gan so siêu vi B Mặt khác, chi phí điều trị bệnh là khá cao và cần tuân theo phát đồ điều trị chặt chẽ Do đó, việc xét nghiệm máu định kỳ là rất cần thiết để phát hiện bệnh gan sớm

1.1.2 Lịch sử phát hiện viêm gan siêu vi C

Năm 1975, Prince và cộng sự nhận định rằng có một chứng bệnh viêm gan siêu vi sau truyền máu không do viêm gan siêu vi B và có thời kỳ ủ bệnh dài hơn thời ủ bệnh do viêm gan siêu vi A Sau đó, các tác giả: Bassler và cộng sự (1995), Lee và cộng sự (1993), Livak và cộng sự (1995) chứng minh về mặt huyết thanh học rằng bệnh viêm gan siêu vi loại này không có liên quan gì đến bệnh viêm gan siêu vi A và từ lúc này danh từ “bệnh viêm gan siêu vi không A không B” ra đời.Vào tháng 5 năm 1989 bằng phương pháp ly tâm siêu tốc huyết tương thu từ những con tinh tinh bị bệnh viêm gan siêu vi, Choo và cộng sự (1989) đã tách chiết nucleic acid của virus, tổng hợp cDNA từ RNA tách chiết, chèn vào bộ gen của λgt11 và xâm nhiễm E coli, thu được có một dòng có phản ứng đặc hiệu với kháng thể có trong huyết thanh người bị bệnh viêm gan siêu vi không A không B sau

truyền máu Cuối cùng, Choo và cộng sự (1989) xác định rằng bệnh viêm gan siêu

vi không A không B do một loại siêu vi mới gây ra, đó là siêu vi C (HCV)

1.2 Dịch tể học [3,11]

1.2.1 Tình hình nhiễm siêu vi C trên thế giới

Hình 1.1: Bản đồ phân bố tỷ lệ nhiễm HCV trên thế giới

(Nguồn: www: WHO, 2008)

Theo ước tính của tổ chức y tế thế giới WHO, trung bình 3% dân số thế giới

nhiễm viêm gan siêu vi C , 170 triệu người mang virus này dạng mạn tính Trong

đó, Đông Nam Á có khoảng 32,3 triệu người bị nhiễm, chiếm 2.15% dân số khu vực này

Tần suất toàn bộ của HCV ở cộng đồng chung được báo cáo theo từng lục địa với tần suất trung bình 5.17% ở Châu Phi , 3.5% ở Châu Á, 1,93% ở Châu Mỹ, 1,75% ở Châu Âu, và 1.88% ở Châu Đại Dương Tính trên toàn cầu là 2.856% có nghĩa là khoảng 210 triệu người nhiễm HCV trên toàn thế giới

Ở các nước phát triển, HCV là nguyên nhân của 20% các ca viêm gan cấp, 70% viêm gan mạn, 40% xơ gan giai đoạn cuối, 60% ung thư gan, 30% ca ghép gan Ở các nước đang phát triển, HCV là nguyên nhân của 18% các ca viêm gan cấp, 69% viêm gan mạn, 33% xơ gan giai đoạn cuối, 52% ung thư gan, 32% ca ghép gan Ở các nước kém phát triển, HCV là nguyên nhân của 36% các ca viêm gan cấp, 75% viêm gan mạn, 50% xơ gan giai đoạn cuối, 66% ung thư gan, 38% ca ghép gan

Trong các genotype của HCV, gen type 1 chiếm tỷ lệ cao nhất trên thế giới nói chung và ở nước Mỹ nói riêng với 35% loại 1a và 35% loại 1b Genotype 3 thường thấy ở Pakistan, Úc, Scotland Genotype 4 ở Trung Đông và Châu Phi cũng như

Không có

South Africa Genotype 6 tại Hồng Kông và Macau

1.2.2 Tình hình nhiễm siêu vi C ở Việt Nam [7,13]

Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HCV 1,8% dân số cả nước , trung bình từ 1-3 trường hợp/100000 người mỗi năm

Theo Trương Xuân Liên (2010), tỷ lệ nhiễm HCV ở một số đối tượng tại TP.HCM là : trên người tiêm chích ma túy là 96,2%, nhiễm HIV là 73,6%, bệnh nhân xơ gan : 47,8%, bệnh nhân viêm gan : 26,6%, bệnh nhân ung thư gan : 23,2%, bệnh nhân nghi viên gan :19,3%, người cho máu : 14%, gái mại dâm : 9,9%, bệnh nhân da liễu : 6,9%, nhân viên y tế : 3,28% và người cho máu bình thường : 2,53%

Nakata và cộng sự (2007) khảo sát trên người không có bệnh gan ở 2 thành phố lớn là Hồ Chí Minh và Hà Nội thì thấy tỉ lệ có kháng thể kháng HCV (anti-HCV) lần lượt là 9% (43/491) và 4% (18/511) Phân bố kháng thể không phụ thuộc theo tuổi Cũng trong nghiên cứu này, ở TP.HCM, tần suất nhiễm anti-HCV khá cao ở người tiêm chính ma túy 87%, bệnh nhân đang thẩm tách máu : 54%, hoặc có bệnh ưa chảy máu : 29% Nghiên cứu cũng cảnh báo cần sàng lọc anti-HCV ở người cho máu vì mục đích thương mại là quan trọng

Theo Trần Thanh Dương và cộng sự (2009) nghiên cứu kiểu gen của 14 bệnh nhân viêm gan tại Hà Nội thì thấy các kiểu gen 1a, 1b và 6a lần lượt là 4, 4 và

6 trường hợp Cũng chính tác giả này, phân tích HCV ở phụ nữ mại dâm tại Hà Nội thì thấy có nhiều kiểu gen : 1a, 1b, 6, 6a, 9a Cao nhất là 1a, 6a và 1b

1.3 Con đường lây nhiễm HCV [5,7]

HCV lây truyền theo đường máu và các đường lây chủ yếu sau :

 Người nhận máu, chế phẩm máu hoặc các bộ phận cơ thể từ một người cho nhiễm HCV

 Nhân viên y tế: tiếp xúc với bệnh phẩm chứa siêu vi trong quá trình làm việc

 Ðường tình dục

 Mẹ truyền sang con

Dùng chung dao cạo, bàn chải răng, kềm cắt móng tay với người bị nhiễm siêu vi

C, kim chích xăm mình hay xỏ lỗ tai không đảm bảo vô trùng

Tuy nhiên, 30-40% các trường hợp là không rõ nguyên nhân

1.4 Diễn tiến bệnh [13,15]

Sau khi bị nhiễm siêu vi, bệnh nhân có thời gian ủ bệnh từ 2 tuần – 6 tháng Đây là giai đoạn nhiễm trùng cấp tính Phần lớn bệnh nhân không có triệu chứng lâm sàng Một số có biểu hiện mệt mỏi, chán ăn, … Việc chẩn đoán bệnh trong giai đoạn này dựa vào xét nghiệm máu

Sau 6 tháng, khoảng 85% bệnh nhân chuyển thành dạng mãn tính Khi đó, bệnh diễn tiến thầm lặng có thể từ 10-30 năm Khi bệnh nhân phát hiện thường vào giai đoạn cuối, khi các tế bào gan đã xơ, viêm và hoại tử

Có hai dạng viêm gan mạn tính

-Viêm gan C mãn tính có men ALT(Aspartate Amino Transferase) bình thường, (ALT do gan tạo ra thường có một hàm lượng cố định trong máu, trị số bình thường ALT < 40 U/L ,AST < 40 U/l)

Trường hợp viêm gan C mãn tính có men ALT bình thường là khi bệnh nhân

có sự hiện diện của anti-HCV, RNA HCV (+) bằng phương pháp PCR, và men ALT bình thường kéo dài

-Viêm gan C mãn tính có men ALT tăng :

Bệnh nhân viêm gan C mãn tính thuộc vào loại này Tùy theo tổn thương mô học mà chia làm hai loại: viêm gan mãn nhẹ và viêm gan mãn mức độ từ vừa đến nặng Sự phân biệt này rất quan trọng về tiên lượng và chỉ định điều trị

+ Viêm gan mãn nhẹ:

Viêm gan mãn nhẹ là khi sinh thiết gan cho thấy tổn thương mô học nhẹ Theo cách tính của Knodell(1980) viêm gan mãn nhẹ là khi số điểm sơ hóa là 0 hoặc 1 và số điểm hoại tính viêm- hoại tử nhỏ hơn 6

+ Viêm gan từ mức độ vừa đến nặng:

Viêm gan từ mức độ vừa đến nặng là khi sinh thiết gan thấy có tổn thương viêm- họai tử đáng kể hoặc xơ hóa lan rộng Theo cách tính của Knodell (1980) viêm gan mãn vừa và nặng được xác định là khi số điểm sơ hóa là 3 hoặc 4 và số điểm hoạt tính lớn hơn 6

Nhiễm cấp tính

Không triệu chứng Mệt mỏi Viêm gan nặng

Hình 1.2: Sơ đồ diễn tiến bệnh siêu vi

( Nguồn: bệnh viện Hòa Hảo)

1.5 Biện pháp phòng ngừa và điều trị [20.23]

1.5.1 Biện pháp phòng ngừa

Các vết máu khô từ những người nhiễm HCV có thể lây cho người khác trong khoàng thời gian từ 16 giờ đến 4 ngày, ở nhiệt độ phòng Do đó, các vết máu cần phải được tẩy sạch và người thực hiện phải mang bao tay cao su

Không dùng chung ống chích, kim tiêm, bông băng

Không dùng chung dao cạo râu, bàn chải đánh răng, dụng cụ cắt móng tay

Quan hệ tình dục không an toàn

Băng vết thương để tránh tiếp xúc máu cho người khác

1.5.2 Điều trị

Điều trị viêm gan siêu vi đòi hỏi phải có kiến thức sâu về viêm gan và thuốc chống siêu vi Do đó, bệnh nhân nên được điều trị và theo dõi bởi bác sĩ chuyên về viêm gan

Không triệu chứng Mệt mỏi Viêm gan nặng

Hồi phục

85%

Viêm gan không biến chứng

20% Biến chứng xơ và ung thư

Viêm gan mạn

Viêm gan không biến chứng

20% Biến chứng xơ và ung thư

Hiện nay, để chống lại viêm gan C là interferon, một thuốc ức chế sự nhân lên của virus Các thuốc interferon dùng để điều trị viêm gan gồm: interferon α2b (Intron A), interferon α2a (Roferon-A) và interferon alfacon-1 (Infegen) Nhưng interferon chỉ có tác dụng ở khoảng 20% số trường hợp.

Hiện nay, tiêm interferon thường được phối hợp với uống ribavirin-một thuốc kháng sinh virus phổ rộng Điều trị thường mất sáu tháng đến một năm và thành công ở khoảng 40% số người bị HCV

Gần đây, một thuốc khác, interferon pegyl hóa có hiệu quả gấp hai lần interferon thông thường Vào tháng 1-2001 Cơ quan quản lý thuốc và dược phẩm

Mỹ đã cho phép dùng interferon pegyl hóa, interferon-peginterferon alfa-2b để điều trị viêm gan

Theo nghiên cứu của bác sĩ Nguyễn Thu Thủy-bệnh viện Hòa Hảo TP.HCMHiệu quả điều trị phụ thuộc nhiều yếu tố như: giới tính, thời gian ủ bệnh, độ tuổi……

>75 kgThấpKhông phải type 1

Nam

>40DàiCó

<75 kgCaoType 1

Bảng 1.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điều trị bệnh viêm gan C

Do đó, các lời khuyên được đưa ra để giữ gìn sức khỏe và bảo vệ gan:

 Theo dõi và tuân theo sự chỉ dẫn của bác sĩ chuyên khoa

 Hạn chế tối đa các chất kích thích như rượu bia các loại nước có gas, các loại hóa chất, các loại phụ gia

Hạn chế chất béo động vật

Không sử dụng bất ký loại thuốc gì nếu không có chỉ định của bác sĩ đặc biệt các loại thuốc giảm đau, thuốc an thần, thuốc ngủ…

Sống khoẻ mạnh, tập luyện vừa phải, ăn uống điều độ, không uống rượu, nghỉ ngơi đầy đủ là những phương thức tốt cho bịnh nhân viêm gan C để giữ gìn sức khoẻ, năng lượng.

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ VIÊM GAN

SIÊU VI C

2.1 Hepatitis C virus -HCV [10,11]

HCV được xếp vào họ Flaviviridae vì có một số đặc tính về cấu trúc gen tương tự như Flavivirus và Peptivirus Do số lượng, việc xử lý protein virus và các đặc điểm sao chép có một số khác biệt, nên gần đây HCV được xếp vào giống mới của họ Flaviviridae với tên Hepacivirus HCV lại có chung các đặc điểm với Picornavirus và các virus thực vật như Potyvirus, làm cho ta lầm tưởng HCV là một mắt xích tiến hóa giữa các virus thực vật và động vật

HCV thuộc nhóm Flavirus HCV là một siêu vi nhỏ, hình cầu, đường kính khoảng 55-65nm Trọng lượng phân tử vào khoảng 4106 daltons Bộ gen của siêu vi

C là một chuỗi đơn RNA độ 95000 nucleotide chứa một khung đọc mở dịch mã dài

mã hóa một polypeptide lớn 3010-3033 amino acid bắt đầu tại codon methionin trong khung đọc đầu tiên và nằm bên trong phần nucleocapside 30-35nm có cấu trúc đối xứng 20 mặt Ở ngoài cùng là lớp vỏ lipid chứa các protein E1 và E2 tạo thành các phức hợp primer

Kiểu đọc mở HCV mã hóa một tiền chất polyprotein mà tiền chất này được

xử lý đồng dịch mã hoặc sau dịch mã để tổng hợp các protein cấu trúc ( C, E1, E2, p7) và các protein không cấu trúc (NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a và NS5b)

HCV có 6 gentype được ký hiệu theo thứ tự từ 1 đến 6 Mỗi gentype có nhiều type phụ Trong đó, thường gặp nhất là các type 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5, 6 type 1a và 1b là khó chửa trị nhất vì độc lực mạnh của virus Bên cạnh đó, HCV thường bị đột biến nên có khả năng tránh được các đáp ứng miễn dịch của cơ thể và dễ chuyển sang nhiễm mạn tính

(Nguồn: James A Perkin, 2001) Vật liệu di truyền của HCV là một chuỗi RNA mạch( +), chứa khoảng 9400 nucleotide mã hóa cho một polyprotein tiền thể gồm 3011 amino acid Gen chứa một khuôn đọc mở với các trình tự được trình bày trong hình 2.2

Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc gen HCV

(Nguồn: James A Perkin, 2001)

 Đầu 5’ không dịch mã: có chức năng điều hòa dịch mã

C (nucleocapsid): protein lõi

E1 (envelope): protein vỏ

E2 (envelope): protein vỏ

NS2 (membrane binding protein): một protein liên kết với màng

NS3 (protease/helicase): các enzyme thủy giải và cắt đứt liên kết hydro

NS4 (membrane binding protein): một protein liên kết với màng

NS5 (polymerase): enzyme nhân bản vật liệu di truyền

Gen của siêu vi C là một chuỗi đơn RNA có cực tính dương, gồm khoảng

9500 nucleotide được chia làm ba vùng:

(i)Đầu 5’ không mã hóa gồm 341-344 nucleotide Đây là vùng tương đối bị ít

biến đổi nhất giữa các phân type khác nhau Do đó vùng này như là một chất mồi

để phát hiện RNA của siêu vi C bằng phương pháp PCR Chức năng của vùng này

là tham gia vào quá trình điều hòa nhân đôi của siêu vi

(ii)Vùng được mã hóa nằm giữa hai đầu 5’ và 3’ Vùng này chỉ có một

khung đọc mở duy nhất gồm 9379-9481 nucleotide, được giải mã để tổng hợp một polyprotein tiền chất của siêu vi gồm khoảng 3000 acid amin Sau đó, protein này

sẽ được các enzyme protease của siêu vi và các enzyme peptidase tín hiệu của tế bào phân cắt thành protein cấu trúc và protein không cấu trúc

(iii)Đầu 3’ không mã hóa:

RNA virus chỉ có một khung đọc mẫu duy nhất mã hóa khoảng 3010-3033

aa, hai đầu được gắn kết bởi các vùng không dịch mã 3’ và 5’ Polyprotein được

phân cắt sau dịch mã với các peptidase tín hiệu và các protease mã hóa virus NS2-3

và NS 3-4 để sinh ra các protein cấu trúc và không cấu trúc trưởng thành

2.2.1 Các protein cấu trúc

Các protein cấu trúc bao gồm C, E1 và E2 :

Protein capsid = protein C (21 kDa) tạo nên phần nucleocapsid bao bọc bên ngoài chuỗi gen của siêu vi

Protein E1 (37 kDa) và E2 (61 kDa) là hai glycoprotein của lớp vỏ, liên kết với nhau thành các phức hợp dimer Ở protein E2 có hai vùng siêu biến là HVR1 (ở vị trí acid amin 390-410) và HVR2 (ở vị trí acid amin 474-480) Vùng siêu biến này thường xuyên bị biến đổi qua mỗi lần siêu vi nhân đôi, tạo ra sự khác biệt giữa các gen của siêu vi C trong cùng một bệnh nhân HVR1 còn là nơi kích thích hệ thống miễn dịch tạo ra kháng thể trung hòa Vì vậy kháng thể mà cơ thể tạo ra không theo kịp sự biến đổi liên tục tại vùng HVR1 Đây là cơ chế giúp siêu vi trốn tránh được đáp ứng miễn dịch của ký chủ và làm cho tình trạng nhiễm siêu vi C thường chuyển sang mãn tính

Protein p7 (7 kDa) mà chức năng vẫn chưa được biết rõ

2.2.2 Các protein không cấu trúc:

2.3 Cơ chế gây bệnh

Đầu tiên, HCV gắn vào một thụ thể trên bề mặt tế bào gan nhờ hai glycoprotein bề mặt của nó là E1 và E2, thực hiện quá trình hòa màng RNA mạch

(+) của HCV được dịch mã nhờ hệ thống dịch mã của tế bào chủ Protein tiền thể tạo ra sẽ được phân cắt bởi enzyme tín hiệu để tạo ra các protein cấu trúc C, E1, E2

và các protein không cấu trúc là NS1-NS5 Sau đó bắt đầu phiên mã ngược để tạo ra mạch RNA mạch (-) bổ sung với mạch (+) đã có nhờ vào enzyme Reverse Tranriptase Sau đó, capsomer được tạo ra từ các protein thành phần như C, E1, E2

sẽ kết hợp với RNA kép của HCV để tạo thành dạng nucleocapsid Nucleocapsid này tiến đến tương tác với màng tế bào để thoát ra ngoài, trở thành dạng virus hoàn chỉnh và đi xâm nhiễm một tế bào khác

2.3.1 Sự sao chép và xâm nhập vào tế bào vật chủ

Các bước sao chép được mô tả như sau :

Protein màng của E2 giúp gắn kết virus vào tế bào

 Sự cởi bỏ vỏ ngoài của HCV

 Sự tạo vỏ ngoài HCV : Sự nảy chồi của HCV, các hạt RNA được tạo vỏ nảy chồi qua màng bào tương

 Sự bài tiết HCV kết hợp chủ yếu với lưới nội bào tương với khoảng 1012 virion HCV mỗi ngày

2.3.1.1 Nhiễm HCV cấp

HCV được truyền từ người sang người theo đường máu hoặc tiếp xúc với dịch cơ thể người mang HCV HCV có thể lưu hành tự do trong huyết tương và gây nhiễm các tế bào di động như lympho bào, bạch cầu đơn nhân Ngoài ra, bằng phương pháp lai in situ, PCR và các nghiên cứu miễn dịch huỳnh quang đã tìm thấy các thành phần virus trong tế bào gan, các tế bào lympho B và T, và các đại thực bào, và hóa học mô miễn dịch đã chứng minh các kháng nguyên virus trong các tế bào thượng bì đường mật và trong các tế bào thượng bì tuyến nước bọt Việc phát hiên này có nhiều ý nghĩa rất quan trọng :

-Việc nuôi cấy siêu vi C có thể thực hiện được ở các dòng lympho bào

- Các tế bào đơn nhân có thể là nguồn chứa siêu vi và đặc biệt có thể là nguyên nhân gây tái nhiễm siêu vi C sau khi ghép gan

- Sự lây nhiễm ở các tế bào đơn nhân có thể chọn lọc nên một vài biến chủ đặc biệt và tạo điều kiện cho bệnh tồn tại kéo dái

-RNA virus thường được phát hiện 2 ngày sau truyền nhiễm, tuy nhiên không liên tục, cho thấy có các đơn bùng cháy sau chép virus Khi được xác định bằng định lượng PCR và bằng xét nghiệm DNA nhánh, tình trạng huyết tương tăng lên mức độ cao (180 bộ gene/ml hay nhiều hơn) trước khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng

Mật độ của các hạt tử HCV trong huyết thanh rất thay đổi, từ 1,03 đến 1,72g/ml Sở dĩ mật độ của HCV thay đổi như vậy là do các virion lưu hành trong máu dưới nhiều dạng khác nhau : hoặc là ở dạng tự do có tính lây nhiễm rất cao nhưng chỉ hiện diện với mật độ tương đối thấp (khoảng 1,03) ; hoặc là ở dạng kết hợp với các đại phân tử, đặc biệt là các lipoprotein hoặc hiện diện trong các phức hợp miễn dịch nhưng mật độ lại cao

2.3.1.2 Nhiễm HCV mạn

Nhiễm HCV thường có 80% tình trạng virus có trong huyết thanh tồn tại, cho dù không có các triệu chứng lâm sàng và sinh hóa Lượng virus trong huyết thanh được phát hiện trong quá trình tồn tại biến đổi thay đổi theo từng cá nhân, từ

102 – 1010 gene/ml, và có thể dao động mạnh theo thời gian Tình trạng virus huyết thanh có lúc không phát hiện được cho là do dao động về số lượng tế bào nhiễm virus, các yếu tố vật chủ tác động lên sự thanh thải virus cũng như hiệu quả sao chép của các loài

Định lượng các men AST (Alanin Amino Transferase ) và ALT (Aspartate Amino Transferase) Đặc điểm quan trọng về phương diện sinh hóa trong viêm gan siêu vi C là sự dao động của men ALT lúc tăng, lúc giảm thậm chí trong giới hạn bình thường Sự tăng men gan trong viêm gan C cấp thường thấp hơn so với mức tăng trong viêm gan A và B.

3.1.2 Xét nghiệm đánh giá chức năng gan

Chức năng bài tiết mật bị ảnh hưởng dẫn đến tình trạng tăng bilirubin trong máu ( cả bilirubin trực tiếp và bilirubin giáp tiếp) gây vàng da Bilirubin là sản phẩm chuyển hoá của hemoglobin Bilirubin gián tiếp và bilirubin trực tiếp thường được đo để tầm soát và theo dõi bệnh gan hay đường mật

Đánh giá chức năng tổng hợp yếu tố đông máu của gan bằng cách khảo sát

tử nhỏ như : acid béo, bilirubin… Globulin chủ yếu là immunoglobulins (Ig's)- có nhiều lọai, IgM, IgE ) được tạo ra từ bạch cầu, thuộc về kháng thể và có chức năng nhận ra và "tấn công" các vật lạ xâm nhập cơ thể

Chức năng thải NH3 bình thường là 9-33µmol/L Khi gan suy NH3 sinh độc cho cơ thể, đặc biệt là hệ thần kinh dẫn đến rối loạn tri giác, hôn mê

3.1.3 Siêu âm bụng tổng quát

Giúp chẩn đoán loại trừ các nghuyên nhân gây tắc mật khác như sỏi mật, u đường mật, u đầu tụy, hoặc các tổn thương như ung thư gan, sán lá gan…

Trong viêm gan cấp, cấu trúc gan đồng nhất, gan có thể hơi to

Sinh thiết tế bào gan : quan sát tế bào gan dưới kính hiển vi, xác định mức độ viêm nhiễm chẩn đoán giai đoạn bệnh và đánh giá hiệu quả điều trị

3.1.4 Xét nghiệm miễn dịch học

Tìm anti-HCV trong máu

Tuy nhiên xét nghiệm này dương tính chỉ có tính chất gợi ý về tình trạng nhiễm HCV, không cho kết luận mới nhiễm hay đã nhiễm từ lâu và không thể kết luận chắc chắn là không còn mang HCV.

3.2 Chẩn đoán cận lâm sàng

3.2.1 Phương pháp bDNA

Là một kỹ thuật lai phân tử giữa RNA HCV với những probe bắt cặp bổ sung với một trình tự có tính bảo tồn cao ở vùng 5’ không mã hóa Đây là một phương pháp phát hiện và định lượng trực tiếp Người ta xử lý huyết tương hoặc huyết thanh người bệnh với protease K nhằm giải phóng RNA HCV từ các hạt virus RNA được lai với các probe đặc hiệu Sau đó phức hợp RNA HCV-probe được cố định trên một vi giếng và tiếp tục được lai với các probe khuếch đại tín hiệu, mỗi probe này liên kết với nhiều phân tử alkaline phosphatase Cuối cùng, cơ chất của enzyme được cho vào vi giếng và tín hiệu hóa quang sẽ được thu nhận bởi máy đọc tín hiệu ánh sáng

Trong phương pháp định lượng bằng bDNA thì việc thiết kế các probe mục tiêu là vô cùng quan trọng Cả hai loại probe ( probe cố định RNA HCV vào vi giếng và probe khuếch đại tín hiệu RNA HCV ) phải được thiết kế sao cho có thể định lượng mọi genotype HCV với hiệu quả như nhau Các loại probe này thường

có kích thước từ 16-24 nucleotide và nhiệt độ nóng chảy (Tm) vào khoảng 700C nhằm đảm bảo tính đồng nhất của phản ứng lai và tín hiệu tối đa

Phương pháp cho kết quả tuyến tính với các mẫu huyết thanh có nồng độ RNA HCV từ 200000 đến 120000000 phân tử RNA/1ml máu Các genotype của HCV cũng có ảnh hưởng trên việc định lượng RNA HCV giữa genotype 1 và 2 có

độ nhạy chênh lệch nhau vào khoảng 3 lần và giữa genotype 3a và 6a là 1,5 lần.3.2.2 Phương pháp ELISA

Phương pháp này sử dụng nguyến tắc phát hiện phân tử lai dựa vào sự chuyển màu cơ chất hoặc tín hiệu quang, hóa quang dưới sự xúc tác của enzyme kết hợp với kháng thể kháng digoxigenin Đầu tiên người ta tách chiết RNA HCV từ huyết thanh và chuyển thành cDNA nhờ phản ứng phiên mã ngược cDNA này được dùng làm bản mẫu cho phản ứng PCR Trong thành phần của phản ứng PCR, một trong hai primer sẽ được đánh dấu ở đầu 5’ với biotin, như vậy sản phẩm PCR

tạo ra sẽ có một mạch được đánh dấu biotin ở đầu 5’ Sau bước nhân bản sản phẩm PCR được biến tính thành dạng mạch đơn và được cho vào các vi giếng Mặt trong của mỗi vi giếng được phủ streptavidin là một protein có ái lực đặc biệt cao đối vớ biotin sẽ giữ các mạch mang biotin ở đầu 5’ Tiếp theo, người ta cho probe đặc hiệu cho HCV vào vi giếng và tiến hành phản ứng lai Probe này được đánh dấu ở đầu 3’ với digoxigenin sẽ bắt cặp bổ sung với mạch mang biotin ở đầu 5’ Phức hợp kháng thể kháng digoxigenin – alkaline phosphatase được cho vào và ủ trong một thời gian thích hợp, phần dư thừa sẽ được loại bỏ Phản ứng màu sẽ xuất hiện khi cơ chất hiện màu của alkaline phosphatase được cho vào Cường độ màu tương ứng với hàm lượng PCR có trong mẫu Việc định lượng RNA HCV có trong mẫu được thực hiện bằng cách quy giá trị cường độ màu ỡ mỗi vi giếng vào một đường chuẩn xây dựng từ những mẫu có nồng độ RNA HCV biết trước Phương pháp này có khả năng phát hiện HCV với nồng độ là 600IU/ml Độ tuyến tính của phương pháp nằm trong khoảng 600IU/ml đến 850000IU/ml Phương pháp định lượng bằng PCR ELISA có khả năng sử dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vì không đòi hỏi các thiết bị chuyên dụng, không mắc tiền và thao tác không phức tạp, việc đánh giá kết quả đơn giản Đây là phương pháp định lượng có khả năng thay thế cho định lượng bằng Real-Time PCR ở những nơi không có thiết bị chuyên dụng cho Real-Time PCR.

3.2.3 PCR định lượng cạnh tranh

Phương pháp này nhân bản trong cùng eppendorf một trình tự mục tiêu cần định lượng và một trình tự được gọi là chứng định lượng có nồng độ biết trước Các nồng độ giảm dần của chứng định lượng được cho vào từng phản ứng Ở phản ứng nào mà tín hiệu sau nhân bản của chứng định lượng và trình tự mục tiêu bằng nhau thì nồng độ thì nồng độ của trình tự mục tiêu chính là nồng của chứng định lượng trong phản ứng đó Thông thường, chứng định lượng được thiết kế sao cho gần giống với trình tự mục tiêu nhất về kích thước, thành phần nucleotide để sự nhân bản của trình tự mục tiêu không bị ức chế bởi chứng định lượng và ngược lại

Tuy nhiên, chứng định lượng cũng phải phân biệt được với trình tự mục tiêu bằng cách tăng kích thước hay them vị trí nhận biết của một enzyme cắt giới hạn vào trình tự của chứng định lượng

3.2.4 Kỹ thuật Hybrid Capture

Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc lai phân tử giữa một mạch của phân tử DNA mạch đôi và phân tử RNA tạo thành một thể lai DNA:RNA Các mẫu được xủ

lý bằng dung dịch ly giải để giải phóng các nucleic acid có trong tế bào Sau đó các probe DNA hoặc RNA được cho vào và phản ứng lai được tiến hành trong các ống nghiệm hoặc trong các vi giếng của microtiter plate có phủ một kháng thể đa dòng Kháng thể đa dòng này bắt giữ toàn bộ các phân tử lai DNA:RNA hiện diện trong phản ứng Các phân tử nucleic acid khác như phân tử DNA mạch đơn, RNA, thể lai DNA:DNA, RNA:RNA không phản ứng với kháng thể này bị rửa trôi Một phương pháp khác để cố định các trình tự mục tiêu sử dụng các probe có gắn biotin và phản ứng bắt giữ xảy ra trong các ống nghiệm hoặc trong các microtiter plate có phủ treptavidin Sau đó, các phân tử lai DNA:RNA đã được bắt giữ sẽ liên kết đặc hiệu với một kháng thể thứ hai cộng hợp với alkaline phosphatase Một phân tử lai có thể liên kết với nhiều phức hợp kháng thể - alkaline phosphatase nên sẽ làm gia tăng độ nhạy của kỹ thuật Sau đó, cơ chất phát ánh sáng của alkaline phosphatase là CSPD được cho vào phản ứng và ánh sáng phát ra được phân tích bằng máy đo ánh sáng Hàm lượng trình tự mục tiêu được định lượng bằng giá trị RLU có hàm lượng tương ứng với hàm lượng trình tự đích có trong mẫu ban đầu

3.2.5 Kỹ thuật Real-Time PCR

Các kỹ thuật cổ điển như Southern blot hay Northern blot đã dẫn đến sự phát triển các phương pháp định lượng dựa trên cơ sở lai phân tử như RNAse protection, dot blot,… Tuy nhiên, các phương pháp này có chung nhựơc điểm là thời gian tiến hành kéo dài và cần một lượng nucleic acid ban đầu lớn Sự ra đời của kỹ thuật PCR đã khắc phục các nhược điểm nêu trên Các phương pháp định lượng dựa trên

kỹ thuật PCR như PCR ELISA, PCR định lượng cạnh tranh,… ngày càng phát triển

Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu khi sử dụng phương pháp này phải giải quyết hai vấn đề lớn, đó là: ảnh hưởng của pha bão hòa trong phản ứng PCR và sự ức chế của phản ứng bởi các chất kìm hãm Càng về cuối khi khi phản ứng PCR bước vào pha bão hòa, thì hiệu quả nhân bản càng giảm, không còn mang tính lũy thừa Có nhiều nguyên nhân cho hiện tượng này như lượng primer giảm, nồng độ các sản phẩm PCR quá cao khiến cho primer khó kết hợp với mạch khuôn, các thành phần

phản ứng như ezyme, nucleotide, MgCl2… cạn kiệt Lúc đó nếu căn cứ vào hàm lượng sản phẩm PCR để suy ra hàm lượng nucleic acid ban đầu thì không chính xác

vì các mẫu có hàm lượng nucleic acid ban đầu khác nhau sẽ có hàm lượng sản phẩm PCR tại pha bão hòa như nhau Vấn đề thứ hai là sự tồn tại của các chất kìm hãm phản ứng PCR, cả sau quá trình tách chiết, cũng ảnh hưởng lớn đến hàm lượng sản phẩm PCR sau cùng

Nhiều cải tiến nhằm làm cho phương pháp định lượng dựa trên kỹ thuật PCR trở nên chính xác và có độ tin cậy cao hơn Holland và cộng sự (1991) đã phát hiện chức năng 5’ exonuclease của Taq polymerase Bassler và cộng sự (1995), Lee

và cộn sự (1993), Livak và cộng sự (1995) đã phát triển các loại mẫu dò có khả năng chuyển năng lượng huỳnh quang Sự phát triển về thiết bị của các công ty như Perkin Elmer, Idaho Technologies, Acugen… cũng góp phần đáng kể vào việc hình thành một phương pháp định lượng mới, đó là Real – Time PCR

CHƯƠNG 4 QUY TRÌNH REAL-TIME PCR

ĐỊNH LƯỢNG HCV

4.1 Kỹ thuật Real-Time PCR

4.1.1 Nguyên tắc