C. Máy ly tâm D Máy vorte
E. Máy ủ nhiệt khô F Máy ly tâm eppendorf 0.2ml
4.4. Đọc và giải thích kết quả PHÂN TÍCH KẾT QUẢ:
PHÂN TÍCH KẾT QUẢ:
Sau khi kết thúc quá trình Real-Time PCR, chuyển sang chế độ “Analysis” để phân tích. Tùy loại máy có thể phân tích ở dạng “Linear” hoặc dạng “Log” hoặc cả hai.
Phân tích chứng dương và chứng âm: Chỉ chọn giếng và âm , chọn màu FAM rồi đến màu HEX. Thí nghiệm đạt yêu và chuyển sang bước phân tích kết quả
nếu chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vượt qua tín hiệu nền ( đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệu nền ( đường biểu diễn âm tính ), chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đường biểu diễn tính hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính. Những trường hợp khác sự cố-nguyên nhân-khắc phục.
Phân tích mẫu: Chọn màu FAM. Có thể phân tích đồ thị ở chế độ đã xử lý hoặc chế độ dữ liệu thô. Nên chọn từng mẫu và phân tích chế độ dữ liệu để có kết quả chính xác nhất. Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng và bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trước, kết luận mẫu dương tính. Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng và bắt đầu từ sau chu kỳ 36, kết luận “mẫu dương tính dưới ngưỡng phát hiện”. Mẫu có đường biểu diễn dương tính không rõ ràng và bắt đầu từ sau chu kỳ 36, kết luận “mẫu nghi ngờ” và đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm hoặc thự hiện lại xét nghiệm sau 1-3 tháng. Mẫu có đường biểu diễn âm tính, kết luận “ không tìm thấy virus trong mẫu”. Những trường hợp khác sự cố-nguyên nhân-khắc phục.
In đồ thị kết quả: Chọn chứng âm chứng nội và mẫu in đồ thị. Copy đồ thị vào trang trả kết quả, chú thích các đường biểu diễn “ chứng âm”, “ chứng nội”, “mẫu”
Biểu đồ 4.9: Biểu đồ đường chuẩn
( Nguồn: công ty Việt Á, 2011)
Qua biểu đồ đường chuẩn ta thấy E=103.9% (nằm trong khoảng 90-105%), R2=1.000 và độ dốc (slope) của đường biểu diễn là -3.232. Có thể kết luận đây là biểu đồ chuẩn lý tưởng.
Sau khi đã có đường chuẩn ta sẽ xác định được lượng copies HBV-DNA trong 1ml huyết thanh.
Kết quả của quá trình Real-time PCR gồm: một mẫu thử nghiệm và một chứng âm.
Bảng 4.1. Kết quả thể hiện quy trình Real-Time PCR
Giếng Tên giếng Màu của
mẫu dò Ct(dR)
Quantity
(copies) Copies/ml
B10 HBV FAM 28,46 4,83E+02 7,25E+04
Hình 4.10: Đường biểu diễn khuếch đại mẫu thử nghiệm
(Nguồn: công ty Việt Á, 2011) Phân tích đồ thị
-Mẫu dương tính khi đường biểu diễn vượt qua tín hiệu nền. -Mẫu âm tính khi mẫu không vượt qua được tín hiệu nền. -Mẫu nội tại dùng để kiểm tra mẫu có bị ức chế không.
Các trường hợp xảy ra trong quá trình thực hiện phản ứng: TH1: Tất cả các mẫu đều dương tính kể cả chứng âm.
- Nguyên nhân1: Lô thí nghiệm bị ngoại nhiễm DNA hoặc sản phẩm PCR từ từ môi trường của khu vực thao tác hoặc nhiễm chéo giữa các mẫu.
-Biện pháp khắc phục: Tiến hành lại thí nghiệm cẩn thận. Chiếu UV và vệ sinh khu vực thao bằng nước Javel để khử nhiễm.
TH2: Tất cả mẫu và chứng nội đều âm tính kể cả chứng dương.
- Nguyên nhân: máy bị hư,
-Biện pháp khắc phục: sửa hoặc thay máy mới.
TH3: Tất cả mẫu đều âm tính kể cả chứng dương nhưng chứng nội dương tính.
-Nguyên nhân: hóa chất bị hư.
-Biện pháp khắc phục: thay hóa chất mới.
TH4: Chứng dương âm, chứng nội trong tube chứng dương dương, các mẫu khác bình thường.
-Nguyên nhân: chứng dương hư
- Biện pháp khắc phục: thay chứng dương mới.
TH5: chứng âm dương, các mẫu khác bình thường, có mẫu âm, có mẫ dương mạnh, dương yếu.
- Nguyên nhân: chứng âm bị ngoại nhiễm DNA hoặc sản phẩm PCR từ môi trường từ khu vực thao tác hoặc nhiễm chéo từ mẫu dương tính.
- Biện pháp khắc phục: thay chứng âm và tiến hành lại thí nghiệm cẩn thận.
TH6: Mẫu và chứng nội đều âm tính. Có mẫu dương tính, có mẫu âm thật sự.
-Nguyên nhân: Có thể âm thật sự có thể phản ứng PCR bị ức chế. - Biện pháp khắc phục: Pha loãng mẫu từ 10-100 lần.
TH7: Tất cả các mẫu thí nghiệm trong lô đều bất thường.
-Nguyên nhân: Tube chứa PCR không tương ứng với máy hoặc máy Real-Time bị hư.