C. Máy ly tâm D Máy vorte
E. Máy ủ nhiệt khô F Máy ly tâm eppendorf 0.2ml
4.3. Thuyết minh quy trình
4.3.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu
-Lấy máu tĩnh mạch, lấy lúc đói và buổi sáng là tốt nhất. Vì lúc này các thành phần phân tử trong máu là thuần khiết.
-Máu chỉ giữ ở 4o-8oC trong tối đa 4 giờ, sau đó phải tách huyết thanh. Phải thực hiện liền nếu không sẽ xảy hiện tượng máu bị ngoại nhiễm từ môi trường xung quanh. Thu mẫu Thu nhận RNA T hự c hiệ n R ea l- T im e PC R Phân tích kết quả Tách chiết RNA Thực hiện RT
-Lấy 3ml máu bệnh nhân cho vào ống nghiệm thu máu chuyên dụng. -Ly tâm ống nghiệm chứa máu 3000 vòng/phút trong 15 phút.
-Thu khoảng 0.5ml huyết thanh chuyển vào tube 1.5ml vô trùng. -Giữ tube huyết thanh ở -200C cho đến khi tiến hành xét nghiệm. 4.3.2. Thu nhận RNA
Việc tách chiết RNA bao gồm các bước cơ bản sau: (1) phá màng tế bào, (2) loại protein, (3) tủa RNA. Để thu nhận RNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. Việc tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước).
Các chất trong tách chiết: (1) thành phần có phenol, guianidine thyocianat là những chất làm biến tính protein mạnh , khi xử lí với hóa chất này, tế bào sẽ bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nội bào: DNA, RNA, protein…(2) chloroform: thường đi kèm với phenol, có tác dụng bổ sung và loại bỏ hoàn toàn dấu vết phenol, chloroform cũng làm biến tính protein nhưng yếu hơn phenol. Sau khi ly tâm, mẫu xử lí với Trizol sẽ tách thành hai lớp: Lớp dưới là phenol, lớp trên là nước chứa RNA (khi Trizol có pH 4.0), phần protein bị biến tính sẽ nằm ở mặt phân cách hai lớp này và bị loại bỏ. RNA trong phần dịch nổi được thu nhận bằng cách tủa với Isopropanol có bổ sung chất trợ tủa. Chất trợ tủa này là một polymer có cấu trúc mạng lưới nên dễ dàng bắt được các phân tử RNA, nhưng không gây ức chế phản ứng PCR. Sau khi tủa, tủa sẽ được rửa lại 1 lần nữa với ethanol 70% và cuối cùng sẽ được bảo quản trong nước cất đã qua xử lý bằng DEPC, bảo quản ở -20oC đến khi sử dụng.
4.3.3. Quy trình thực hiện
-Cho 200µl mẫu (huyết thanh) vào 1 eppendorf có sẵn 900µl dung dịch 1, vortex 30s, để yên 10 phút. Thêm vào 200µl dung dịch 2, trộn đều. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
-Thu 600µl dịch nổi có chứa RNA vào 1 eppendorf sạch đã có sẵn 600µl dung dịch 3. Trộn đều, để yên 10 phút. Thêm 200µl dung dịch 2. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
-Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh. Cho từ từ 900µl dung dịch 4 vào. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
-Loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Để khô ở 60oC, 10 phút. Cho vào 50µl dung dịch 5. 4.3.4. Thực hiện phản ứng RT
-Thực hiện bước này với các tube RT-Mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
-Trước và sau khi đặt phản ứng RT phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube.
-Đánh dấu các tube bằng ký hiệu mẫu. Cho 15µl chứng (+), chứng (-) hoặc dịch RNA tách chiết vào tube. Phải kiểm tra chắc chắn dịch trong tip phải được cho hết vào tube. Thực hiện mẫu nào, chỉ mở nắp tube tương ứng. Thực hiện xong đóng thật kỹ nắp tube ngay để tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Xong, ly tâm và chuyển ngay các tube vào máy PCR.
-Lập chương trình cho máy PCR hoạt động: 25oC – 5’, 42oC – 30’, 85oC – 5’, giữ ở 4oC. Chọn chức năng chờ đến khi “Heat lid” đạt 1050 thì chương trình luân nhiệt mới bắt đầu.
-Sản phẩm cDNA được dùng để thực hiện phản ứng PCR/real-time PCR.
-Nếu chưa thực hiện phản ứng PCR/real-time PCR ngay phải bảo quản cDNA ở - 20oC.
4.4.5. Thực hiện phản ứng Real-time PCR
-Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
-Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube.
-Cho 2.5µl dịch cDNA từ phản ứng RT ở trên vào tube HCV qPCR mix. Phải kiểm tra chắc chắn dịch trong tip phải được cho hết vào tube. Thực hiện mẫu nào, chỉ mở nắp tube tương ứng. Thực hiện xong đóng thật kỹ nắp tube ngay để tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Xong, ly tâm và chuyển ngay các tube vào máy real-time PCR cùng với 1 bộ standard.
-Bật máy real-time PCR, nhất là đèn của đầu đọc real-time ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình. Bật máy tính và chờ cho máy tính khởi động xong, gọi chương
trình real-time PCR lên. Phải kiểm tra chắc chắn máy real-time PCR và máy vi tính đã kết nối với nhau. Chọn chức năng chờ cho đến khi “Heat lid” đạt 1050 thì chương trình luân nhiệt bắt đầu.
-Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
-Với standard: chọn loại mẫu là và khai báo nồng độ tương ứng với từng standard. -Với mẫu: chọn loại mẫu là không biết, đặt tên hoặc số tương ứng với ký hiệu của mẫu.
-Màu “Fam”: phát hiện trình tự mục tiêu HCV, màu “Hex”: phát hiện trình tự chứng nội.
-Cài đặt chương trình cho máy real-time PCR hoạt động: 1 chu kỳ: 95oC-5’, 40 chu kỳ: 95oC-15’’, 60o-1’ (chọn đọc kết quả ở bước này). Chọn chức năng chờ cho đến khi đạt 105o thì chương trình luân nhiệt bắt đầu.
-Lưu file dữ liệu vào máy tính. Nên chọn lưu ở phân vùng ổ cứng không cài hệ điều hành.
Hình 4.2: Quá trình luân nhiệt
( Nguồn: công ty Việt Á, 2011)