LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÌM HIỂU QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY KHOAI LANG NHẬT TỪ ĐỐT THÂN

Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hoài An Khoa MT&CNSH 08CSH2 LỜI MỞ ĐẦU Trong các loại cây lương thực có củ, khoai lang chiếm vị trí quan trọng. Trên thế giới khoai lang là 1 trong 5 cây có củ quan trọng (sắn, khoai lang, khoai mỡ, khoai sọ, khoai tây). Thành phần chính khoai lang gồm tinh bột, đường, protein, vitamin, và các chất khoáng. Khoai lang được dùng làm lương thực thực phẩm chính cho con người, làm thức ăn cho gia súc và là nguồn nguyên liệu của ngành công nghiệp chế biến: bánh kiện kinh tế còn khó khăn cây khoai lang được coi là cây trồng cứu đói nhưng hiện nay nó là một cây trồng mang lại nhiều lợi nhuận kinh tế. Ở nước ta, khoai lang là một trong bốn cây lương thực chính sau lúa, ngô, sắn. Trên thế giời, Việt Nam được xếp thứ năm về sản lượng khoai lang xuất khẩu. Tuy nhiên, năng suất còn thấp và bấp bênh do sử dụng giống đã thoái hóa, ít quan tâm đến biện pháp canh tác, sâu bệnh. Hiện nay, những giống khoai lang Nhật nổi tiếng về chất lượng cao và đã thích nghi trong điều kiện ở Việt Nam và trở thành đối tượng nghiên cứu thời sự. Sự ra đời của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật từ thế kỷ 20 đã mở ra cuộc cách mạng mới trong công tác tạo giống. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật ngày càng hoàn thiện giúp cho việc nhân giống và phục hồi giống tốt hơn. Do đó việc ứng dụng kỹ thuật này vào trong sản xuất khoai lang sẽ tạo ra nhiều triển vọng mới trong việc tăng năng suất cũng như diện tích khoai lang Nhật, nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường tiêu thụ ngày càng cao 1 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hoài An Khoa MT&CNSH 08CSH2 Mục đích của khóa luận này nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự sinh trưởng và phát triển của cây khoai lang. Đề tài này được thực hiện tại phòng CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT- VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI-VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM. 2 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hoài An Khoa MT&CNSH 08CSH2 3 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hoài An Khoa MT&CNSH 08CSH2 1.1. Giới thiệu về cây khoai lang 1.1.1. Sơ lược về khoai lang 1.1.1.1. Phân loại khoa học Tên khoa học: Ipomoea Batatas L. Giới: Plantae Lớp: Magnoliopsida Bộ : Solanales Họ: Convolvulaceae Chi: Ipomoea Loài : I. batatas Tên tiếng Anh: Sweet potato Hình 1.1. Cây khoai lang 1.1.1.2. Nguồn gốc Khoai lang có nguồn gốc ở Nam Mỹ khoảng 5.000 năm trước Công Nguyên. Dấu tích củ khô tồn tại lâu nhất được khám phá tại Caves của Chilca Canyon thuộc Peru (Engel, 1970). Người ta cũng tìm thấy sự hiện diện của khoai lang đầu tiên tại vùng Mayan của Trung Mỹ. Astin (1977) đã giả thuyết có hai trung tâm phát sinh nguồn gốc khoai lang tại Guatamala và nam Peru. Trong một số công trình khác cũng chỉ ra sự đa dạng loài khoai lang cao nhất ở Colombia, Equador và nam Peru. Khoai lang được khám phá bởi Christophe Columbus trong cuộc thám hiểm tìm ra châu Mỹ năm 1492. Ông đã đưa nó vào Tây Ban Nha được gọi là khoai tây Tây Ban Nha hay khoai tây ngọt, mãi sau này mới gọi là khoai lang. 4 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hoài An Khoa MT&CNSH 08CSH2 Khoai lang được mở rộng theo hai con đường: Con đường từ Tây Ban Nha giới thiệu vào châu Âu sau đó truyền tới châu Phi, vào Ấn Độ và Tây Ấn. Con đường khác do người Tây Ban Nha mang khoai lang từ vùng Trung Mỹ tới Philippines (Yen, 1982) vào khoảng năm 1521 (Obrien, 1972), sau đó tiếp tục đưa đến châu Phi (Cinklin, 1963). Khoai lang được đưa về Trung Quốc từ Philippines và xuất hiện ở Phúc Kiến (Fukien) năm 1594. Con đường khác vào Trung Quốc là do người Tây Ban Nha, đưa vào vùng Combatfami năm 1674. Một người Anh đưa vào Nhật năm 1615. Khoai lang được tiếp tục đưa vào Malaysia và các nước Nam Á, Đông Nam Á. Ở Việt Nam, theo nhiều tài liệu để lại như “Thực vật bản thảo”, “Lĩnh nam tạp kỷ” và “Quảng Đông tân ngữ“ của Lê Quí Đôn thì khoai lang được du nhập vào nước ta từ Philipines vào khoảng cuối đời Minh cai trị nước ta. Cây được trồng trong phạm vi rộng giữa vĩ tuyến 40 độ Bắc đến 40 độ Nam và lên tới độ cao 2.300 m so với mặt nước biển (Đinh Thế Lộc, 1996). 1.1.1.3. Phân bố  Trên thế giới Ngày nay, khoai lang được trồng rộng khắp trong các khu vực nhiệt đới và ôn đới ấm với lượng nước đủ để hỗ trợ sự phát triển của nó. Theo số liệu thống kê của FAO năm 2004 thì sản lượng toàn thế giới là 127 triệu tấn. Trong đó phần lớn tại Trung Quốc với sản lượng khoảng 105 triệu tấn và diện tích trồng là 49.000 km². Khoảng một nửa sản lượng của Trung Quốc được dùng làm thức ăn cho gia súc và gia cầm . Sản lượng trên đầu người lớn nhất tại các quốc gia mà khoai lang là mặt hàng lương thực chính trong khẩu phần ăn, đứng đầu là quần đảo Solomon với 160 kg/người/năm và Burundi với 130 kg. Bắc Carolina, bang đứng đầu Hoa Kỳ về sản xuất khoai lang, hiện nay cung cấp 40% sản lượng khoai lang hàng năm của quốc gia này. 5 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hoài An Khoa MT&CNSH 08CSH2 Mississippi cũng là bang chủ lực trong việc trồng khoai lang, tại đây khoai lang được trồng trên diện tích khoảng 8.200 mẫu Anh. Khoai lang từ Mississippi đóng góp khoảng 19 triệu USD vào nền kinh tế bang này và hiện nay có khoảng 150 trang trại ở Mississippi trồng khoai lang. Năm quận đứng đầu canh tác khoai lang ở Mississippi là Calhoun, Chickasaw, Pontotoc, Yalobusha và Panola. Lễ hội khoai lang quốc gia (Hoa Kỳ) được tổ chức hàng năm tại Vardaman vào tuần đầu tiên của tháng 11, và Vardaman được gọi là "The Sweet Potato Capital" (tạm dịch: Thủ đô khoai lang). Thị trấn Benton, Kentucky kỷ niệm khoai lang hàng năm cùng với Lễ hội Ngày Tater vào thứ hai đầu tiên của tháng 4.  Trong nước Ở nước ta, khoai lang là loại cây lương thực được trồng lâu đời và xếp hàng thứ ba sau lúa và ngô. Khoai lang được trồng nhiều từ Bắc chí Nam, đặc biệt là đồng bằng ven biển. Đây là một trong những loại cây có củ quan trọng, có khả năng thích ứng mạnh, tương đối ít sâu bệnh, trồng được trên nhiều loại đất khác nhau: nặng, nhẹ, đất thịt, đất cát. Khoai lang lại có thể trồng được nhiều vụ trong năm, dễ trồng, cho năng suất cao, tương đối ổn định. Khoai lang được trồng khắp nơi, đặc biệt ở miền Trung, Trung du phía Bắc, Đồng bằng Sông Hồng, Đồng bằng Sông Cửu Long, Về nguồn gen thu thập và nhập nội, chương trình cây có củ quốc gia đã nhập nội và tổ chức sưu tập nguồn gen trong cả nước trong đó có Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh tham gia. Các nguồn gen này hiện được lưu trữ tại Trung tâm Cây có củ thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Hưng Lộc, Viện Khoa học Nông nghiệp miền Nam gồm nhiều mẫu giống và dòng lai. Kết quả chọn tạo giống khoai lang từ 1991-1995 của Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Hưng Lộc và Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tuyển chọn được 36 dòng triển vọng có năng suất củ tươi cao và phẩm chất củ ngon; giới thiệu được các giống khoai lang tốt như: K4, TN66, HL-4, NC1525, HL-419, HL-518. Năm 6 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hoài An Khoa MT&CNSH 08CSH2 1993-1994, các giống K4, HL-4, TN66 đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn công nhận (Hoàng Kim, Nguyễn Thị Sâm, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Đức Tuyến, Trương Văn Hộ và Enrique Chujoy, 1995). 1.1.2. Đặc điểm thực vật, sinh trưởng và phát triển của khoai lang 1.1.2.1. Đặc điểm thực vật Hình 1.2 Cây khoai lang và các bộ phận Rễ Khoai lang sau khi trồng 3 - 4 ngày sẽ mọc rễ mới, trong điều kiện khô hạn hoặc nhiệt độ và ẩm độ thấp thì khoai mọc rễ non chậm. Rễ mọc đầu tiên ở các đốt thân dưới đất. Mỗi đốt có khả năng ra 15 - 20 rễ, nhưng thường chỉ có 5 - 10 rễ được phân hoá thành rễ dầy mới có cơ hội hình thành củ. Rễ khoai lang chia làm ba loại: rễ con, rễ đực và rễ củ. Thân 7 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hoài An Khoa MT&CNSH 08CSH2 Thân khoai lang có dạng bò hay nửa đứng. Thân phổ biến màu xanh, tím và xanh tím. Thân có nhiều đốt với chiều dài lóng khác nhau. Ở mắt đốt mọc ra rễ phụ. Độ dài đốt phụ thuộc vào giống. Căn cứ vào độ dài thân chính người ta chia làm hai loại: Loại thân dài khoảng 2- 5 m , loại thân ngắn: 0,5 -1 m. Thân phát triển dài ngắn ngoài yếu tố chính là giống còn phụ thuộc nhiều vào chế độ mưa, loại đất và phân bón. Lá Lá khoai lang là lá đơn, mọc cách, mỗi mắt một lá gồm cuống lá và phiến lá. Cuống lá dài 6 - 20 cm, có lợi cho việc sử dụng ánh sáng, giúp lá vươn lên khoảng không gian và có thể điều chỉnh mắt lá xoay chếch theo chiều ánh sáng để lá sử dụng ánh sáng được tối đa, khắc phục nhược điểm thân nằm bò dưới mặt đất. Những giống nhiều nhánh và cuống lá to, dài sẽ có năng suất chất xanh cao. Màu sắc cuống lá do giống qui định. Đa số các giống khoai lang có cuống lá màu xanh, một số khác có cuống màu tím nhạt, tím. Hoa Hoa khoai lang mọc ở nách lá hoặc ngọn thân, hoa hình chuông có cuống dài. Hoa mọc thành chùm hay riêng rẽ. Tràng hoa hình phễu màu hồng tím hay phớt hồng, bên trong nó có nhiều lông tơ và tuyến mật hấp dẫn côn trùng. Một hoa gồm 5 nhị đực và nhụy cái, nhị đực thấp hơn nhụy cái. Quả và hạt Quả khoai lang thuộc loại quả sóc hình tròn màu nâu đen, sau khi thụ tinh một đến hai tháng thì quả chín và còn tùy thuộc giống và mùa vụ. Một quả có từ 1 đến 4 hạt, hạt có vỏ cứng, hạt dễ bị rụng khi quả chín. 2.1.3.1. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển Khoai lang có bốn thời kỳ sinh trưởng và phát triển: Mọc mầm và ra rễ; Phân cành và tạo củ; Tăng trưởng thân lá; Phát triển của củ . Thời kỳ ra rễ và chồi xanh 8 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hoài An Khoa MT&CNSH 08CSH2 Ra rễ và mọc mầm cần 15 - 25 ngày, phụ thuộc vào chất lượng dây giống và điều kiện sinh thái của các vùng khác nhau. Thời kỳ phân cành và hình thành củ Từ khi trồng đến khi hoàn thành giai đoạn này khoảng 40 - 50 ngày. Các nhánh trên thân bắt đầu phát triển và bò trải dần trên mặt luống. Củ hình thành khoảng 1,0 - 1,5 tháng sau khi trồng tùy thuộc giống và điều kiện môi trường. Đây là thời kỳ quyết định số củ trên cây; trong rễ củ bắt đầu có sự hoạt động của các bó mạch gỗ, hình thành các loại tượng tầng sơ cấp và tượng tầng thứ cấp để tạo củ Thời kỳ phát triển thân lá Thời gian từ lúc trồng đến hoàn thành thời kỳ phát triển thân lá khoảng 75 - 85 ngày. Ở thời kỳ này thân lá phát triển với tốc độ nhanh nhất, bò lan phủ kín mặt và rãnh luống. Sự hình thành thêm rễ củ mới là không đáng kể. Nhưng những củ đã được hình thành phát triển theo chiều dài nhanh chóng. Một số củ hình thành sớm bắt đầu quá trình tích lũy chất khô. Thời kỳ phát triển củ Từ khi trồng đến khi hoàn thành giai đoan này khoảng 90 - 105 ngày đối với các giống khoai lang hiện trồng phổ biến ở Việt Nam. Điều kiện thuận lợi cho quá trình phình to của củ là có sự chênh lệch nhiệt độ ngày và đêm lớn (ban ngày nắng ấm, ban đêm hơi se lạnh); nên chênh lệch nhiệt độ ngày và đêm càng lớn trong giai đoạn cuối thì năng suất củ khoai lang càng cao. Đặc điểm của thời kỳ này là củ lớn nhanh trong khi sinh trưởng thân lá giảm từ từ rồi ngừng hẳn, lá gốc già vàng và rụng dần. 1.1.3. Tình hình nghiên cứu cây khoai lang 1.1.3.1. Thế giới Cây khoai lang được coi là một trong 7 loài cây lương thực quan trọng trên thế giới và xếp quan trọng hàng thứ 5 đối với các nước đang phát triển. Nó được trồng trên 9 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hoài An Khoa MT&CNSH 08CSH2 hơn 100 quốc gia trên thế giới với chức năng là một nguồn thực phẩm giá trị đối với con người, gia súc cũng như là vật liệu thô cho các ngành công nghiệp chế biến. Cây khoai lang tạo được lượng sinh khối và chất dinh dưỡng lớn nhất trên cùng một đơn vị diện tích khi so sánh với bất cứ loài cây trồng nào. Trong một nghiên cứu tại Nhật Bản, so sánh với 20 loài trái cây và rau quả khác trong việc làm ngăn chặn cũng như làm giảm lượng cholesterol thì khoai lang được xếp đầu bảng. Ngoài ra khoai lang còn mang tính giải độc cao đối với các loại kim loại nặng. Cây khoai lang thích nghi được với nhiều điều kiện sinh thái nông nghiệp khác nhau, nó có thể mọc ở những vùng đất nghèo dinh dưỡng cũng như những vùng đất bị khô hạn. Tại Ai Cập, khoai lang được trồng ở những vùng đất khác nhau với tổng diện tích là 11.200 hectares với năng suất là 30 tấn/ha. Trong vòng vài ba năm qua nhu cầu xuất khẩu khoai lang tăng lên rất nhiều nhưng Ai Cập chỉ xuất được 6.000 tấn sang châu Âu. Lý do là dịch hại và bệnh đã ngăn cản việc làm cho khoai lang ở Ai Cập đạt được năng suất tối đa. Trong đó bệnh virus được coi là nguyên nhân chính làm giảm năng suất. Do đó, Viện Kỹ thuật Gen trong Nông nghiệp của Ai Cập (AGERI) đã áp dụng kỹ thuật nhằm cải tạo giống khoai lang gồm các bước như sau: ü Cải tạo giống địa phương bằng việc sản xuất nguồn cây giống sạch bệnh. ü Phát triển một hệ thống nhân giống có hiệu quả có khả năng ngăn chặn sự lây lan của virus. ü Phát triển một hệ thống phát hiện virus ở các cánh đồng trồng khoai lang. ü Ngoài ra họ còn thiết lập các hệ thống theo dõi đảm bảo chất lượng của sản phẩm khoai lang được sản xuất ra. Kết quả nghiên cứu nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của Castro và Andrate (1995) chỉ ra trên môi trường MS bổ sung 0,005 mg/l NAA, 0,5 mg/l BA và 0,25 mg/l GA 3 cho kết quả tốt. 10 [...]... 08CSH2 Khóa luận tốt nghiệp 33 Nguyễn Thị Hoài An Khoa MT&CNSH 08CSH2 Khóa luận tốt nghiệp 2.1 Giới thiệu các bước trong nhân giống cây khoai lang in vitro từ đốt thân 2.1.1 Quy trình Mẫu cấy  Khử trùng mẫu  Tạo thể nhân giống  Nhân giống in vitro  Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro  Chuyển cây ra vườn ươm 34 Nguyễn Thị Hoài An Khoa MT&CNSH 08CSH2 Khóa luận tốt nghiệp 2.1.2 Thuyết minh quy trình 2.1.2.1... thể cắt đốt - Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng Tuy nhiên, có những loài cây trồng không có khă năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo - Để nhân giống, trong môi trường nuôi cấy thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác 1.2.3.2 Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong vi c nhân giống cây trồng... này, mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in vitro Có 2 thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng Đối với những cây khoai lang, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi Mẫu cấy đoạn thân sau khi khử trùng được chuyển vào môi trường MS (Murashige và Skoog,... bào có khả năng phát sinh phôi và tái sinh thành cây khoai lang bằng cách sử dụng 2,4 – D và ABA Cũng trong năm 1997, Sihachakr đã nghiên cứu thành công hệ thống tái sinh cây khoai lang qua con đường phát sinh phôi Các nhân tố ảnh hưởng đến vi c tạo mô sẹo và hình thành chồi cũng đã được thực hiện Công bố này đã cung cấp một loại môi trường cải biên trong nghiên cứu tái sinh khoai lang, môi trường SPM... nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thông thường giống với môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn 1.2.3.3 Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro Ở giai đoạn này cây non được tạo ra... đến hệ số nhân in vitro như thành phần khoáng trong môi trường, loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật sử dụng, Mẫu cấy ban đầu được cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 20 hoặc 60 g/l đường sucrose có hoặc không có kết hợp với 0.1 mg/l BA để kéo dài chồi Trong khuôn khổ khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh vi c tìm hiểu quy trình nhân giống in vitro cây Khoai lang từ đốt thân, em còn trực... độ thấp ü Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử 17 Nguyễn Thị Hoài An Khoa MT&CNSH 08CSH2 Khóa luận tốt nghiệp ü Nuôi cấy quan tự dưỡng 1.2.3 Các bước thực hiện trong vi nhân giống Quá trình vi nhân giống được chia thành các giai đoạn sau: 1.2.3.1 Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống Cây mẹ phải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính... cấy đỉnh sinh trưởng  Vi nhân giống: Đây là nghiên cứu sớm nhất của cây khoai lang do Yamaguchi và cộng sự công bố vào năm 1974 về tái sinh khoai lang thông qua mô sẹo Kết quả cho thấy sự hình thành mô sẹo từ rễ củ trên môi trường White có bổ sung 1 mg/l NAA và tái sinh chồi trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l ABA, 0,02 mg/l kinetin và 0,04 mg/l 2,4-D Năm 1984, sự tái sinh chồi qua mô sẹo từ lá, đỉnh... Khoai lang Nhật in vitro (được trình bày cụ thể trong phần 2.2) 2.1.2.3 Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ Trong quy trình này, chồi in vitro... luận tốt nghiệp 2.1.2.3 Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệu là thể chồi, môi trường nuôi cấy giống với môi trường tạo thể chồi Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh Trong giai đoạn này, nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hệ số nhân . mục đích tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi , thể cắt đốt. - Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên,. hiện trong vi nhân giống Quá trình vi nhân giống được chia thành các giai đoạn sau: 1.2.3.1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống. Cây mẹ phải. loại cây lương thực có củ, khoai lang chiếm vị trí quan trọng. Trên thế giới khoai lang là 1 trong 5 cây có củ quan trọng (sắn, khoai lang, khoai mỡ, khoai sọ, khoai tây). Thành phần chính khoai