Tìm hiểu quy trình phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ TP HCM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : LƯ NHẬT HUY MSSV:207111018 Lớp: 08CSH01 TP Hồ Chí Minh, 2011 LỜI CAM ðOAN Tơi xin cam đoan: - Tự thực khóa luận tốt nghiệp - Khơng chép khóa luận tốt nghiệp hình thức - Các số trích dẫn khóa luận tốt nghiệp trung thực Tơi chịu trách nhiệm hồn tồn lời cam đoan i MỤC LỤC i Danh mục từ viết tắt ii Danh mục hình iii Danh mục bảng, biểu ñồ, sơ ñồ CHƯƠNG MỞ ðẦU Tính cấp thiết đề tài Mục ñích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu 5 Các kết ñạt ñược ñề tài Chương 1: TỒNG QUAN BỆNH LAO 1.1 Bệnh lao 1.1.1 Lịch sử bệnh lao 1.1.2 Khái niệm bệnh lao 1.2 Tình hình dịch tễ bệnh lao 1.2.1 Tình hình bệnh lao giới 1.2.2 Tình hình bệnh lao Việt Nam 1.3 Phân loại ñặc ñiểm vi khuẩn lao 10 1.3.1 Phân loại 10 1.3.2 ðặc ñiểm 11 1.3.3 Bộ gen vi khuẩn lao 12 1.4 Nguồn lây, ñường xâm nhiễm diễn biến bệnh 13 1.4.1 Nguồn lây 13 1.4.2 ðường xâm nhiễm 13 1.4.3 Diễn biến nhiễm bệnh 13 Chương : BỆNH LAO KHÁNG THUỐC 15 2.1 Lịch sử bệnh lao kháng thuốc 16 2.2 Tình hình bệnh lao kháng thuốc 16 2.2.1 Trên giới 16 ii 2.2.2 Ở Việt Nam 18 2.3 Tình hình nghiên cứu bệnh lao kháng thuốc 19 2.4 Vi khuẩn lao kháng thuốc 20 2.4.1 ðặc ñiểm giúp vi khuẩn lao có khả kháng thuốc 20 2.4.1 Vi khuẩn lao ñột biến gen kháng thuốc 21 Chương 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BỆNH LAO 25 3.1 Các phương pháp chuẩn đốn bệnh lao cổ ñiển 26 3.1.1 Chuẩn đốn lâm sàng 26 3.1.2 Phương pháp nhuộm soi ñàm 26 3.1.3 Phương pháp nuôi cấy tìm vi khuẩn lao 26 3.1.4 Phương pháp X-quang phổi 26 3.1.5 Phương pháp thử phản ứng Tuberculin 27 3.2 Các phương pháp chuẩn đốn bệnh lao đại 27 3.2.1 Phương pháp ELISA 27 3.2.2 Phương pháp PCR 29 3.2.3 Phương pháp Real-time PCR 32 Chương 4: QUY TRÌNH PHÁT HIỆN LAO KHÁNG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR 35 4.1 Giới thiệu quy trình 36 4.2 Vật liệu, thiết bị hóa chất 36 4.2.1 Vật liệu sinh học 36 4.2.2 Mồi mẫu dò 36 4.2.3 Thiết bị, dụng cụ 38 4.2.4 Hóa chất 39 4.3 Quy trình phát lao kháng thuốc phương pháp real-time PCR 4.3.1 Mẫu 41 4.3.1.1 Thu mẫu 41 4.3.1.2 Xử lý mẫu 41 4.3.2 Tách chiết DNA 41 iii 4.3.3 Thực Real-time PCR 42 4.3.4 ðọc kết 46 4.3.5 Nhận xét quy trình 46 Chương 5: KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 iv Khoá luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AFB : Acid-fast Bacillus Bp : Base Pair Ct : Threshod Cycle dATP : Deoxyadenosine Triphosphate DNA : Deoxyribonucleic Acid dNTP : Deoxyribonucleotide Triphosphate dTTP : Deoxyguanine Triphosphate ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EMB : Ethambutol HIV : Human Immunodeficiency Virus HRSE : Isoniazid, rifampicin, streptomycin, ethambutol INH : Isoniazid Kb : Kilo base KN : Kháng nguyên KT : Kháng thể LAM : Lipoarabinomannan MDR : Multidrugs Resistant MTB : Mycobacterium Tuberculosis NALC : N-acetyl-L-cystein PCR : Polymerase Chain Reaction PCR : Polymerase Chain Reaction RIF : Rifampicin RNA : Ribonucleic Acid RMP : Rifampicin Taq-DNA polymerase: Thermus Aquaticus DNA Polymerase TB : Tuberculosis XDR : Extensively Drug-resistant SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang Khoá luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 : Hình ảnh vi khuẩn lao chụp kính hiển vi 11 Hình 1.2 : Hình ảnh Mycobacterium tuberculosis hiển vi ñiện tử quét 11 Hình 1.3 : Bộ gen Mycobacterium tuberculosis 12 Hình 2.1 : Tình hình bệnh lao kháng thuốc giới 17 Hình 2.2 : Tình hình bệnh lao Việt Nam 18 Hình 2.3 : Hình ảnh vách tế bào vi khuẩn lao 20 Hình 2.4 : ðột biến vùng 81 bp codon 507-533 gen rpoB 21 Hình 2.5 : Vùng khả bị ñột biến 22 Hình 2.6 : ðột biến codon Ser95 22 Hình 3.1 : Hình ảnh lao chụp x-quang 26 Hình 3.2 : Phương pháp ELISA gián tiếp 27 Hình 3.3 : Các bước phương pháp Sandwich ELISA 29 Hình 4.1 : Các thiết bị dụng cụ quy trình 38 Hình 4.2 : Primer thiết kế hướng dẫn CDS 44 Hình 4.3 : Chu trình nhiệt Phát Mycobacterium tuberculosis (MTB) kháng thuốc kỹ thuật real-time PCR 45 Hình 4.4 : ðường biểu diễn khuyếch đại mẫu thử nghiệm 46 SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang Khoá luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỀU ðỒ, SƠ ðỒ Trang Bảng 1.1 : Thống kê tình hình bệnh lao giới năm 2009 Bảng 4.1 : Các mồi mẫu dị sử dụng 37 Biểu ñồ 2.1 : Tỷ lệ kháng thuốc ca ñã trải qua ñiều trị nhiễm .18 Biểu ñồ 3.1 : Biểu ñồ ñường biểu diễn khuếch ñại 34 SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang Khoá luận tốt nghiệp CHƯƠNG MỞ ðẦU SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang Khố luận tốt nghiệp Tính cấp thiết ñề tài Bệnh lao ñã xuất hàng nghìn năm bệnh khó chữa trị Hiện có khoảng 1/3 dân số giới nhiễm lao, năm có khoảng triệu người chết lao Nguyên nhân gây bệnh lao vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis ðây vi khuẩn hình que, dài từ 3-5µm, rộng từ 0,3 - 0,5µm, khơng có tiêm mao, hai đầu trịn, tế bào có hạt Trong năm 70-80 cơng tác phịng chống điều trị lao trở nên khơng hữu hiệu có xuất chủng lao kháng thuốc khó chữa trị có nguy lây lan nhanh ñã làm cho số người mắc bệnh, tử vong tăng cao Những người mắc chủng vi khuẩn lao phải ñiều trị năm so với ñiều trị 6- tháng trước chi phí tăng lên gấp 100 lần Tổ chức Y tế giới ước tính, đến ñã có 2700 ca bệnh lao kháng thuốc 41 quốc gia Việc ñiều trị cho bệnh nhân lao kháng thuốc nghiêm ngặt cần phải theo dõi liên tục Vi khuẩn lao có thời gian sinh sản tăng trưởng chậm nên phương pháp như: nuôi cấy truyền thống, nhuộm soi ñàm nhiều thời gian, chậm trễ phát ñiều trị bệnh lao Chính phương pháp phát vi khuẩn lao kháng thuốc nhanh chóng xác điều cần thiết ðề tài thực nhằm tìm hiểu quy trình phát vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc số kỹ thuật sinh học phân tử nhằm cung cấp thêm số thông tin vấn đề Mục đích nghiên cứu Tìm hiểu quy trình chẩn đốn bệnh lao kháng thuốc phương pháp sinh học phân tử, giúp phát bệnh nhanh chóng xác để điều trị kịp thời Nhiệm vụ nghiên cứu Tìm hiểu quy trình phát lao kháng thuốc kỹ thuật sinh học phân tử ðánh giá độ nhạy xác quy trình Phương pháp nghiên cứu Thu thập tài liệu Tìm hiểu quy trình phát khuẩn lao Xác định quy trình mặt lý thuyết Dự đốn ñánh giá quy trình ñề xuất SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang Khố luận tốt nghiệp * Vị trí bắt cặp nucleotide dạng ñột biến (G_C) codon 315 (gene katG) nằm ñầu 3' mồi ngược ** Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến (A_T) (gene rpoB) ) nằm đầu 3' mồi xi * Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến (A_G) codon 306 (gene emb) nằm đầu 3' mồi xi ** Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến (A_C) codon 306 (gene emb) nằm ñầu 3' mồi xi *** Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến (G_A) codon 306 (gene emb) nằm ñầu 3' mồi ngược **** Vị trí bắt cặp nucleotide dạng ñột biến (G_C) codon 306 (gene emb) nằm đầu 3' mồi ngược ***** Vị trí bắt cặp nucleotide dạng ñột biến (G_T) codon 306 (gene emb) nằm đầu 3' mồi ngược Giải trình tự: ðoạn DNA gen katG 315/AGC-> ACC, rpoB516/GAC-> GTC emb 306/ATG->GTG/CTG/ATA/ATC/ATT ñược khuếch ñại ñoạn mồi tương ứng Sau sản phẩm đem tới cơng ty tinh giải trình tự 4.2.3 Thiết bị, dụng cụ Các thiết bị dụng cụ A Máy ly tâm thu huyết SVTH: LƯ NHẬT HUY B Máy Stratagene Mx3000P (máy real-time PCR) Trang 38 Khoá luận tốt nghiệp C Máy ly tâm C Máy vortex E Các loại eppendorf thông dụng F Máy ủ nhiệt khô G Micropipette Hình 4.1 Các thiết bị dụng cụ quy trình “Nguồn: www.vietacorp.com” 4.2.4 Hóa chất Hóa chất cho tách chiết DNA: • Dung dịch (1) (Trizol) gồm: phenol 38%, guanidine thyocianat 0.8M, glycerol 5%, pH 8.0 • Dung dịch (2): Chlorofrom • Dung dịch (3): Isopropanol tuyệt đối có chứa chất trợ tủa • Dung dịch (4): Ethanol 70% • Dung dịch (5): dung dịch TE 1X (Tris 0.1M – EDTA 0.001M) Hóa chất real-time PCR: SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 39 Khoá luận tốt nghiệp • Real-time PCR mix Thành phần phản ứng real-time PCR 25µl gồm: dung dịch đệm (buffer) 1X, dNTP 200µM, Taq DNA polymerase 0.625 unit, MgCl2 1.5mM, DNA mẫu, nước cất vơ trùng, mồi mẫu dị Chứng dương: 100µl Chứng âm: 1.5ml 4.3 Quy trình phát lao kháng thuốc phương pháp real-time PCR Quy trình phát vi khuẩn lao kháng thuốc bao gồm bước bản: Thu mẫu, xử lý mẫu, tách chiết DNA, thu DNA, thực real-time PCR sau ta phân tích kết Sơ đồ 4.1: Quy trình phát lao kháng thuốc phương pháp real-time PCR “Nguồn: www.vietacorp.com” Thu Mẫu Xử Lý Mẫu Tách Chiết DNA Thu Nhận DNA Thực Real-time PCR Phân tích kết SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 40 Khoá luận tốt nghiệp 4.3.1 Mẫu 4.3.1.1 Thu mẫu Các bệnh nhân có triệu chứng nghi ngờ bệnh lao ñược tiến hành lấy mẫu, mẫu ñược tiến hành lấy lần (1 mẫu chỗ, mẫu sáng sớm mẫu chỗ) 4.3.1.2 Xử lý mẫu ðối với bệnh phẩm ñàm chất dịch: Mẫu ñược xử lý với số dung dịch hịa tan, sau ly tâm thu cặn Riêng ñối với bệnh phẩm mẫu sinh khiết mẫu trước thêm dịch hịa tan tiến hành nghiền nát 5.3.2 Tách chiết DNA ► ðối với với bệnh phẩm đàm: - Cho 100µ l mẫu vào eppendorf có sẵn 900µl dung dịch 1, vortex 30s, để n 10 phút Thêm vào 200µl dung dịch 2, trộn Li tâm 13000 vịng/phút 10 phút - Thu 600µl dịch có chứa DNA (chú ý thu dịch nổi) vào eppendorf khác có sẵn 600µ l dung dịch (trộn trước sử dụng) Trộn ñều, ñể yên 10 phút - Li tâm 13000 vòng/phút 10 phút - Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu hồng (tránh loại bỏ phần cặn) Cho từ từ 900µl dung dịch vào Li tâm 13000 vòng/phút phút - Loại bỏ hết dịch (dùng pipet 200µl hút phần dịch nổi), thu cặn (tránh loại bỏ phần cặn) ðể khơ 60oC, 10 phút Cho vào 50µl dung dịch - Nếu chưa đặt phản ứng PCR phải bảo quản mẫu -200C ► ðối với với bệnh phẩm chất dịch: - Cho 100µ l mẫu vào eppendorf có sẵn 900µl dung dịch 1, vortex 30s, để n 10 phút Thêm vào 200µl dung dịch 2, trộn Li tâm 13000 vịng/phút 10 phút - Thu 600µl dịch có chứa DNA (chú ý thu dịch nổI) vào eppendorf khác có sẵn 600µ l dung dịch (trộn trước sử dụng) Trộn ñều, ñể yên 10 phút - Li tâm 13000 vòng/phút 10 phút SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 41 Khoá luận tốt nghiệp - Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (tránh loại bỏ phần cặn) Cho từ từ 900µl dung dịch vào Li tâm 13000 vòng/phút phút - Loại bỏ hết dịch (dùng pipet 200µl hút phần dịch nổi), thu cặn (tránh loại bỏ phần cặn) ðể khô 60oC, 10 phút Cho vào 50µl dung dịch5 - Nếu chưa đặt phản ứng PCR phải bảo quản mẫu -200C ► ðối với với bệnh phẩm mẫu sinh khiết: - Cho thêm 700µl dung dịch 1vào, vortex 30s, để n 10 phút Thêm vào 200µl dung dịch 2, trộn Li tâm 13000 vịng/phút 10 phút - Thu 600µl dịch có chứa DNA (chú ý thu dịch nổi) vào eppendorf khác có sẵn 600µ l dung dịch (trộn trước sử dụng) Trộn ñều, ñể yên 10 phút - Li tâm 13000 vòng/phút 10 phút - Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (tránh loại bỏ ln phần cặn) Cho từ từ 900µl dung dịch vào Li tâm 13000 vòng/phút phút - Loại bỏ hết dịch (dùng pipet 200µl hút phần dịch nổi), thu cặn (tránh loại bỏ phần cặn) ðể khơ 60oC, 10 phút Cho vào 50µl dung dịch - Nếu chưa ñặt phản ứng PCR phải bảo quản mẫu -200C 4.3.3 Thực Real-time PCR 5.3.3.1 Thiết kế mồi Tất DNA polymerase hoạt ñộng tổng hợp mạch DNA từ mạch khn cần diện mồi chun biệt Mồi đọan oligonucleotide có khả bắt cặp bổ sung với ñầu 3’ mạch khn DNA polymerase nối dài mồi để hình thành mạch Mồi tiêu quan trọng ñể ñạt nhân đặc trưng có hiệu cao Mồi phải tuân thủ nguyên tắc sau:  Tm mồi “xuôi” mồi “ngược” không cách biệt xa  Tránh bắt cặp bổ sung mồi “xuôi” mồi “ngược”  Tránh cấu trúc “kẹp tóc” thành phần mồi  Thành phần nucleotide mồi phải cân SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 42 Khoá luận tốt nghiệp  Tránh cặp GC lặp ñi lặp lại nhiều lần  Thành phần GC khoảng 40% - 60%  Trình tự mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần nhân Nếu ñược cung cấp hai mồi (mồi xi mồi ngược) có khả bắt cặp chun biệt với hai đầu trình tự DNA, phản ứng PCR nhân trình tự nằm hai mồi Mồi xi: trình tự với mạch mã Mồi ngược: trình tự ngược bổ sung với mạch mã Cách tính Tm (nhiệt độ gắn mồi) Tm = 4(G+C) + 2(A+T) Quy trình thiết kế mồi gồm bước: Bước 1: Thu thập trình tự gen gen coat proteins piscine nodavirus từ ngân hàng gene NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Bước 2: Chạy clustal riêng cho loại gene (vùng có trình tự tương đồng tất đoạn gene) Bước 3: Tìm cặp mồi cơng bố báo uy tín quốc tế Bước 4: chạy clustal đoạn gene coat proteins với mồi xuôi mồi ngược, ñánh giá mức ñộ tương ñồng ñoạn Bước 5: phân tích đánh giá primer Tm, % GC, khả hình thành cấu trúc kệp tóc, self- dimmer, hetero- dimmer, độ tương đồng, kích thước sản phẩm PCR tạo thành chương trình BLAST, oligo Analyzer, annhyb, từ chọn primer tốt ñể chạy phản ứng Real-time PCR ► Cách thực hiện: Sử dụng chức tìm kiếm tích hợp GenBank, thích bệnh lao tải Trong vài cú nhấp chuột, gen có liên quan (embB, RR pncA) trích ðược hướng dẫn thích CDS, tập hợp đoạn mồi tính cho gen Sử dụng chức tương tác thiết kế mồi Workbench CLC, mồi thiết kế để phù hợp với nhu cầu cụ thể SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 43 Khố luận tốt nghiệp Hình 4.2: Primer thiết kế hướng dẫn CDS thích (màu vàng trống) “Nguồn: http://www.clcbio.com” Các liệu trình tự nhập vào Workbench CLC, lắp ráp, gen tự ñộng ñược chia riêng biệt 4.3.3.2 Xác ñịnh ñộ ñặc hiệu ñộ nhạy mồi Một yêu cầu quang trọng mồi phải khuếch đại trình tự mục tiêu cần quan tâm Ngồi trình tự mục tiêu lồi khảo sát, mồi khơng bắt cặp lên trình tự lồi có mẫu Do việc xác định khả nhân chọn lọc mồi ln ln địi hỏi Việc xác ñịnh phải ñược thực lý thuyết thực nghiệm Trên lý thuyết trình tự mồi mẫu dị kiểm tra chương trình Blast trang web NCBI 4.3.3.3 Xác ñịnh nhiệt ñộ lai tối ưu Nhiệt ñộ lai tiêu quan trọng ảnh hưởng lớn tới kết phản ứng PCR Nhiệt ñộ lai cao hay thấp ảnh hưởng tới hiệu phản ứng Nhiệt ñộ lai q thấp so với nhiệt độ biến tính cặp mồi sử dụng dễ sinh sản phẩm ký sinh khơng mong muốn phản ứng, cịn nhiệt ñộ lai cao cản trở bắt cặp mồi nên hiệu nhân không cao Từ nhiệt độ biến tính mồi xi mồi ngược ñược sử dụng, tiến hành khảo sát, thơng thường nhiệt độ lai so với nhiệt ñộ biến tính mồi khác biệt khoảng +-5 ñộ C Ta tiến hành phân tích chọn nhiệt ñộ tối ưu (55-65 ñộ C) SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 44 Khoá luận tốt nghiệp 4.3.3.4 Xác ñịnh ñộ nhạy quy trình Bất kỳ phương pháp nào, đối tượng mục tiêu ñược pháp nồng ñộ giới hạn chúng mẫu Một phương pháp tốt phát ñược ñối tượng quan tâm nồng ñộ thấp tốt Do đó, tiêu quan trọng ñánh giá mức ñộ hiệu phương pháp ðể tiến hành khảo sát ñộ nhạy quy trình, mẫu vi khẩn lao có nồng ñộ 10^5 copies/ml ñược tiến hành pha loãng bậc 10 liên tiếp ñến nồng ñộ cuối 10 copies/ml Ở nồng ñộ, xác ñịnh nồng ñộ thấp mà phương pháp cho kết rõ ràng xác 4.3.3.5 Chu trình Real-time PCR [33] Cho 5µl chứng +, chứng – tách chiết vào tube real-time PCR mix Trước sau ñặt phản ứng PCR phải ly tâm tube ñể tất dung dịch nằm ñáy tube ðặt vào máy real-time PCR với standard Cài đặt chương trình real-time PCR: chu kỳ: 95oC-5’, 40 chu kỳ: 95oC-15’’, 55oC-1’(chụp hình giai đoạn này), 72oC-20’’ Chọn chức chờ “Heat lid” đạt 1050 C chương trình ln nhiệt bắt đầu Hình 4.3: Chu trình nhiệt Phát Mycobacterium tuberculosis (MTB) kháng thuốc kỹ thuật real-time PCR “Nguồn: www.vietacorp.com” SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 45 Khố luận tốt nghiệp Tùy thuộc vào đặc tính vi khuẩn, mồi sử dụng cấu trúc DNA hay RNA loài mà ta thiết lập chu trình nhiệt khác 4.3.4 ðọc kết Mẫu gồm có: mẫu thí nghiệm, chứng nội, chứng âm Chứng Dương Chứng Nội Mẫu thí nghiệm Chứng Âm Hình 4.4: ðường biểu diễn khuyếch đại mẫu thử nghiệm “Nguồn: www.vietacorp.com” Ta thấy chứng dương chứng âm cho kết tốt Vì tín hiệu huỳnh quang chứng dương vượt qua tính hiệu chu kỳ 32 chứng âm khơng vượt qua tín hiệu Chứng nội dương tính (tốt) Tín hiệu huỳnh quang chứng nội vượt qua tính hiệu chu kỳ 32 Mẫu thí nghiệm vượt qua tín hiệu chu kỳ 32 ∆ Vậy ta kết luận mẫu bệnh phẩm dương tính ( có diện vi khuẩn lao kháng thuốc) 4.3.5 Nhận xét quy trình - Quy trình công ty cổ phần Việt Á xây dựng có độ nhạy độ đặc hiệu cao - ðã ñược sử dụng 50 mẫu bệnh phẩm cho kết tốt mẫu bệnh phẩm bệnh viện lao bệnh phổi Trung Ương phòng xét nghiệm Y khoa Âu Lạc cung cấp SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 46 Khố luận tốt nghiệp - Quy trình phát ñược vi khuẩn lao kháng nhiều loại thuốc tùy thuộc kít sử dụng để phát kháng loại thuốc - Ưu nhược điểm quy trình: * Ưu ñiểm: Cho phép xác ñịnh số lượng khn mẫu ban đầu với xác ñộ nhạy cao * Nhược ñiểm: chi phí cho việc phát bệnh ñầu tư trang thiết bị máy móc cao - So với nước khác giới quy trình phát tương tự sử dụng nhiều cho kết tốt nhanh chóng - So với kỹ thuật PCR phương pháp real-time PCR có nhiều mặt lợi nhiều Kết real-time PCR kết định tính (hiện diện hay vắng mặt trình tự DNA) hay định lượng (số lượng DNA) Thêm vào đó, liệu real-time PCR ñược ñánh không cần phải ñiện di gel, giúp tiết kiệm thời gian gia tăng số lượng thí nghiệm thưc Cuối cùng, việc tiến hành phản ứng ñánh giá liệu hệ thống ống đóng kín giúp làm giảm nguy ngoại nhiễm loại bỏ thao tác sau phản ứng khuếch đại Phương pháp real-time PCR theo dõi giai ñoạn qua chu kỳ SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 47 Khoá luận tốt nghiệp CHƯƠNG KẾT LUẬN SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 48 Khoá luận tốt nghiệp Qua thời gian thực đề tài, tơi tìm hiểu nghiên cứu thành cơng quy trình phát vi khuẩn lao kháng thuốc phương pháp sinh học phân tử mà cụ thể ñây phương pháp real-time PCR Quy trình cho kết nhanh chóng xác đáp ứng tính cấp thiết nêu Quy trình dựa vào đoạn mồi thiết kế giúp phát vi khuẩn lao ñột biến gen KatG, RpoB, Emb kháng loại thuốc sử dụng ñể ñiều trị lao thành phần chủ yếu isoniazid, rifampicin, Ethambutol (EMB) Quy trình cho kết nhanh chóng xác phát vi khuẩn lao kháng thuốc tùy thuộc vào kít thiết kế dùng ñể phát vi khuẩn lao kháng loại thuốc Chuẩn đốn vi khuẩn lao kháng thuốc phương pháp sinh học phân tử (phương pháp real-time PCR) giúp rút ngắn thời gian chuẩn đốn xuống cịn khoảng đến ngày thay tới tháng phương pháp trước Vấn đề có ý nghĩa vô to lớn với công tác kiểm sốt điều trị bệnh lao kháng thuốc nước có tỷ lệ bệnh nhân lao cao nước ta SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 49 Khoá luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Bernard Rglick Jack J.Pasternak, Công nghệ sinh học phân tử, Nguyên Lý Và Ứng Dụng Của DNA Tái Tổ Hợp, Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật [2] Bộ môn Lao Trường ðại học Y Hà Nội (2002), Bệnh học Lao, Nhà xuất Y học Hà Nội [3] ðái Duy Ban, Trần Thị Minh Tâm, ðái Thị Ngân Hà, ðái Thị Hằng Nga (1988), Công nghệ DNA ñiều trị gen bệnh hiểm nghèo, nhà xuất Y học [4] Nguyễn Phúc Cẩm Hoàng (2006), Lao quan niệu sinh dục [5] Nguyễn ðức Lượng (chủ biên), Cơng nghệ gen, Nhà xuất đại học quốc gia TP.Hồ Chí Minh [6] Trần Văn Sáng (2007), ðặc ñiểm bệnh lao, Bệnh lao học, Nhà xuất Y học, Hà Nội [7] Hồ Thị Thanh Thủy, Phát nhanh vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng loai thuốc isoniazid, rifampin ethambutol real-time PCR, Công ty cổ phần TM – SX & DV Việt Á [8] Phạm Hùng Vân (2009), PCR Real-time PCR Các vấn ñề áp dụng thường gặp NXB Y học chi nhánh TP.HCM [9] Viện lao bệnh phổi (1999), Bài giảng Lao Bệnh phổi, Nhà xuất Y học Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH [10] Erlich H A (1989), PCR technogoly: principles and Applications for DNA Amplification, New York stockton Press [11] García de V, Infantes S D, Lasala F, Chaves F, Alcala L, Bouza E (2002), New real-time PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutations and high-level isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis, J Clin Microbiol 40:988-995 [12] Hirano et al (1999), Mutations in the rpoB gene of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolate mostly in Asian contries and their rapid detection by line probe assay, J Clin Microbiol 37:2663-2666 SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 50 Khoá luận tốt nghiệp [13] Igor Mokrousov et al (2003) Allele-specific rpoB PCR assays for detection of Rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis in Sputum Smears, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p.2331-2235 [14] Janet Wilson (2004), Another iron in the fire [15] Keita Miki, Toshi Nagata, Takao Tnaka, yeung-Hyen Kim, Masato Uchijima, Naoya Ohara, Satoshi Nakamura, Maasaji Okada, and Yukio Koide (2004), Induction of protective celluar immunity against Mycobacterium tuberculosis by recombinant attnuated seft-destructinh Listeria monocytogenes strains harboring eukaryotic expression plasmid for antigen 85 complex and MPB/MPT51 [16] Lety MA, Nair S, Berche P, Escuyer V, A single point mutation in the embB gene is responsible for resistance to ethambutol in Mycobacterium smegmatis, Antimicrob Agents Chemother 1997;41:2629–33 [17] M Monir Madkour (2004), Tuberculosis [18] Nino Mdicani, Haijing Li, Maka Akhalaia, Medea Gegria, Leila Goginashvili, Douglas S Kernodle, George Khechinashvili, Yi-Wei Tang (2009) Monitoring therapeutic affcacy by real-time detec of Mycobacterium tuberculosis mRNA in sputum, Clinical Chemistry 55:9 [19] Ramaswamy SV, Amin AG, Goksel S, Stager CE, Dou SJ, El Sahly H, et al, Molecular genetic analysis of nucleotide polymorphisms associated with ethambutol resistance in human isolates of Mycobacterium tuberculosis, Antimicrob Agents Chemother 2000;44:326–36 [20] S.H.E Kaufmann, H Hahn, Mycrobacteria and TB [21] Sreevatsan S, Stockbauer KE, Pan X, Kreiswirth BN, Moghazeh SL, Jacobs Jr WR, et al (1997) Ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis: critical role of embB mutations, Antimicrob Agents Chemother;41:1677–81 TÀI LIỆU INTERNET (http://) [22] http://www.cimsi.org.vn/?action=News&newsId=12033(Thông tin y học Việt Nam, Viện công nghệ thông tin thư viện Y học Trung Ương) [23] http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/ttyh/bshkhkt/laohivhiemhoakep.htm (Theo tài liệu BV Phạm Ngọc Thạch TP.Hồ Chí Minh) SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 51 Khoá luận tốt nghiệp [24] http://mpshcmc.com/tintuc/thongtinyhoc/107-thc-trng-toan-cu-v-bnh-lao-.html [25] http://baogialai.com.vn/channel/1604/201103/Huong-den-muc-tieu-loai-trubenh-lao-trong-cong-dong-1984349/ [26] http://vnthuquan.net/diendan/printable.aspx?m=47074 [27] http://www.clcbio.com/index.php?id=953 [28] http://hocvienquany.vn/Default.aspx?MaTin=991 [29] http://www.baotintuc.vn/130N20101217094514700T0/xet-nghiem-benh-laophoi-trong-vong-100-phut.htm [30] http://bacsytructuyen.com/vn/Tien-bo-quan-trong-trong-phat-hien-benh-laoc1059/Tien-bo-quan-trong-trong-phat-hien-benh-lao-n2648 [31] http://www.tinsuckhoe.com/benh-lao-phoi-va-nhung-dieu-can-biet/tinh-hinhbenh-lao.nd5-sjd.55521.41.1.html [32] http://factsanddetails.com [33] http://www.vietacorp.com SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 52 ... Tìm hiểu quy trình phát lao kháng thuốc kỹ thuật sinh học phân tử ðánh giá ñược ñộ nhạy xác quy trình Phương pháp nghiên cứu Thu thập tài liệu Tìm hiểu quy trình phát khuẩn lao Xác định quy trình. .. trễ phát ñiều trị bệnh lao Chính phương pháp phát vi khuẩn lao kháng thuốc nhanh chóng xác ñiều cần thiết ðề tài thực nhằm tìm hiểu quy trình phát vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc. .. kháng thuốc số kỹ thuật sinh học phân tử nhằm cung cấp thêm số thơng tin vấn đề Mục đích nghiên cứu Tìm hiểu quy trình chẩn đốn bệnh lao kháng thuốc phương pháp sinh học phân tử, giúp phát bệnh nhanh